On The Rate and Extent of Drug Delivery to the Brain

To define and differentiate relevant aspects of blood–brain barrier transport and distribution in order to aid research methodology in brain drug delivery. Pharmacokinetic parameters relative to the rate and extent of brain drug delivery are described and illustrated with relevant data, with special emphasis on the unbound, pharmacologically active drug molecule. Drug delivery to the brain can be comprehensively described using three parameters: Kp,uu (concentration ratio of unbound drug in brain to blood), CLin (permeability clearance into the brain), and Vu,brain (intra-brain distribution). The permeability of the blood–brain barrier is less relevant to drug action within the CNS than the extent of drug delivery, as most drugs are administered on a continuous (repeated) basis. Kp,uu can differ between CNS-active drugs by a factor of up to 150-fold. This range is much smaller than that for log BB ratios (Kp), which can differ by up to at least 2,000-fold, or for BBB permeabilities, which span an even larger range (up to at least 20,000-fold difference). Methods that measure the three parameters Kp,uu, CLin, and Vu,brain can give clinically valuable estimates of brain drug delivery in early drug discovery programmes

Development of a Physiologically-Based Pharmacokinetic Model of the Rat Central Nervous System

Central nervous system (CNS) drug disposition is dictated by a drug’s physicochemical properties and its ability to permeate physiological barriers. The blood–brain barrier (BBB), blood-cerebrospinal fluid barrier and centrally located drug transporter proteins influence drug disposition within the central nervous system. Attainment of adequate brain-to-plasma and cerebrospinal fluid-to-plasma partitioning is important in determining the efficacy of centrally acting therapeutics. We have developed a physiologically-based pharmacokinetic model of the rat CNS which incorporates brain interstitial fluid (ISF), choroidal epithelial and total cerebrospinal fluid (CSF) compartments and accurately predicts CNS pharmacokinetics. The model yielded reasonable predictions of unbound brain-to-plasma partition ratio (Kpuu,brain) and CSF:plasma ratio (CSF:Plasmau) using a series of in vitro permeability and unbound fraction parameters. When using in vitro permeability data obtained from L-mdr1a cells to estimate rat in vivo permeability, the model successfully predicted, to within 4-fold, Kpuu,brain and CSF:Plasmau for 81.5% of compounds simulated. The model presented allows for simultaneous simulation and analysis of both brain biophase and CSF to accurately predict CNS pharmacokinetics from preclinical drug parameters routinely available during discovery and development pathways

Prediction of brain target site concentrations on the basis of CSF PK : impact of mechanisms of blood-to-brain transport and within brain distribution

In the development of drugs for the treatment of central nervous system (CNS) disorders, the prediction of human CNS drug action is a big challenge. Direct measurement of brain extracellular fluid (brainECF) concentrations is highly restricted in human. Therefore, unbound drug concentrations in human cerebrospinal fluid (CSF) are used as a surrogate for human brainECF concentrations. Due to qualitative and quantitative differences in processes that govern the pharmacokinetics (PK) of drugs in the brain, a generally applicable relationship between CSF concentrations and brainECF concentrations does not exist. The aim of the research presented in this thesis was to develop a preclinical brain distribution model, allowing the prediction of human brain target site concentrations on the basis of preclinical data. In order to be able to build a brain distribution model understanding of time-dependent (also non-steady state) kinetics of the unbound drug in brainECF and CSF is essential. To that end, systematic studies on the inter-relationship of plasma PK, blood-brain barrier (BBB) transport, blood-CSF barrier (BCSFB) transport and intra-brain distribution were performed in the rat by implantation of microdialysis probes at multiple brain sites in individual animals.TI PharmaUBL - phd migration 201

Current research into brain barriers and the delivery of therapeutics for neurological diseases: a report on CNS barrier congress London, UK, 2017.

This is a report on the CNS barrier congress held in London, UK, March 22-23rd 2017 and sponsored by Kisaco Research Ltd. The two 1-day sessions were chaired by John Greenwood and Margareta Hammarlund-Udenaes, respectively, and each session ended with a discussion led by the chair. Speakers consisted of invited academic researchers studying the brain barriers in relation to neurological diseases and industry researchers studying new methods to deliver therapeutics to treat neurological diseases. We include here brief reports from the speakers

Influence of PEPT2 on the Regional Distribution Kinetics of Cefadroxil in Brain Using Intracerebral Microdialysis in Rats, Wildtype and PEPT2 Knockout mice

Peptide transporter 2 (PEPT2) is a member of proton-coupled oligopeptide transporter (POT) family that recognizes and transports di-/tri-peptides and peptide-like drugs across cell membranes, thus playing an important role in substrate pharmacokinetics. In brain, PEPT2 works to efflux substrates from cerebrospinal fluid (CSF) into choroid plexus, thus limiting the substrate distribution in CSF. However, PEPT2 does not reduce the distribution of substrate in brain parenchyma, which is believed to be a more relevant site for the neurological effects of most compounds. Moreover, this finding is not consistent with the observance that PEPT2 decreases the neurological effects of its substrates (e.g., kyotorphin and 5-aminolevulinic acid). Considering that the brain parenchyma consists of extracellular fluid (ECF) and intracellular fluid (ICF), we hypothesized that PEPT2 has an impact in reducing substrate distribution in brain ECF, which is the site of neurological effects of most compounds. In the present study, intracerebral microdialysis (the only method to directly monitor drug concentrations in brain ECF) was applied to rats, wildtype and Pept2 knockout mice in order to study the impact of PEPT2 on the brain distribution of cefadroxil, a substrate of PEPT2 with high affinity. Our findings demonstrated that cefadroxil concentration in brain ECF of Pept2 knockout mice was 2.3 fold higher as compared to wildtype mice, indicating that PEPT2 as an efflux transporter at choroid plexus does not only reduce cefadroxil concentrations in CSF but also in brain ECF. Moreover, the microdialysis study of cefadroxil in rats (± probenecid) demonstrated that other transporters (e.g., OATs, MRPs and/or OATPs) were also involved in the elimination of cefadroxil from brain. PEPT2 also functions as an uptake transporter at brain cells (e.g., neurons in neonate and adult, and astrocytes in neonate), which resulted in a higher cefadroxil level in brain ICF compared to brain ECF (i.e., higher unbound volume distribution Vu,brain). These results provided significant insight into the mechanism by which PEPT2 affected the distribution of its substrates in brain (brain cells, ECF, and CSF) and could have important implications in the design and delivery of peptide-like pharmaceuticals for brain diseases.PHDPharmaceutical SciencesUniversity of Michigan, Horace H. Rackham School of Graduate Studieshttps://deepblue.lib.umich.edu/bitstream/2027.42/137151/1/xmchen_1.pd

Translational aspects of blood-brain barrier transport and central nervous system effects of drugs: from discovery to patients

Pharmacolog

Innovative in vitro method and permeability estimation procedure to predict drug transport across the blood-brain barrier

La Barrera Hematoencefálica (BHE) es una entidad caracterizada por su naturaleza restrictiva al paso de sustancias. Las propiedades de la barrera están determinadas por la confluencia de tres componentes principales: 1) uniones celulares endoteliales con presencia de proteínas especificas intramembrana y citoplasmáticas unidas estrechamente al citoesqueleto. Esta circunstancia restringe la difusión paracelular de compuestos. Adicionalmente a las células endoteliales, la barrera presenta una membrana basal, en la cual se localizan pericitos y astrocitos, que conforman una capa que refuerza las propiedades de la barrera; 2) la presencia de transportadores de absorción y la sobreexpresión de transportadores de secreción combinada con el escaso transporte vesicular y la falta de fenestraciones y 3) metabolismo debido a la presencia de enzimas específicas, cuya función es proteger al cerebro. Todos estos componentes de la BHE son esenciales para mantener su integridad estructural, funcionalidad y estabilidad. En el Capítulo 1 de la Tesis se revisa con detalle la anatomía y fisiología de la BHE así como los mecanismos de transporte a través de esta barrera. La BHE permite el paso de sustancias esenciales al cerebro, tales como glucosa, oxigeno, iones, aminoácidos esenciales y algunas sustancias lipídicas. En situaciones fisiopatológicas, también permite el paso de macrófagos y otras células del sistema inmune. Sin embargo, debido a su naturaleza protectora de la homeostasis del cerebro, limita el transporte de sustancias potencialmente tóxicas, como son los fármacos. Estas restricciones son necesarias para mantener un óptimo ambiente que permita el desarrollo de las funciones neuronales, aunque pueda limitar el acceso de tratamientos farmacológicos cuando son requeridos. La BHE, la Barrera Cerebroespinal (BCE) y otras estructuras son un obstáculo enorme para la administración de fármacos con finalidad diagnóstica o terapéutica en el interior del cerebro. Actualmente, existe un número creciente de patologías que afectan al Sistema Nervioso Central (SNC) y según las investigaciones más recientes en muchas de ellas existe una desregulación o disfunción de la BHE. Numerosos investigadores trabajan hoy en día para entender los principales determinantes de la velocidad y magnitud de acceso al cerebro a fin de mejorar el desarrollo de sistemas de liberación dirigidos a optimizar el paso a través de la BHE. En este sentido hay numerosas propuestas novedosas que facilitarán el desarrollo de candidatos capaces de acceder al SNC que se describen en el Capítulo 2 de la memoria. Con el fin de garantizar que los fármacos alcanzan su diana terapéutica es necesario evaluar la habilidad de los candidatos para cruzar la BHE, preferiblemente en las primeras fases de desarrollo de medicamentos. La determinación de los parámetros farmacocinéticos de los compuestos en desarrollo se ha facilitado gracias al uso de métodos experimentales in silico, in vitro e in vivo. Particularmente, los métodos in vitro basados en cultivos y co-cultivos de líneas celulares se han utilizados como métodos de cribado rápido para seleccionar los mejores candidatos en las etapas siguientes. Los modelos in vitro deben cumplir una serie de requisitos como un valor alto de resistencia transepitelial (TEER), baja capacidad permeable y la expresión de diferentes transportadores en su membrana. Mediante los coeficientes de permeabilidad obtenidos, se puede predecir la velocidad de acceso al cerebro y el momento del inicio de la acción, pero no es posible determinar la cantidad de fármaco que se alcanzaría en estado estacionario. Sólo la fracción de fármaco libre en plasma es capaz de atravesar las barreras biológicas, tales como la BHE, y alcanzar la diana terapéutica. Por ello son necesarios nuevos modelos in vitro experimentales capaces de considerar todos los factores mencionados y predecir velocidad y cantidad de fármaco que alcanza la diana terapéutica, en este caso en el cerebro. Otro objetivo de los modelos in vitro consiste en reproducir las condiciones fisiopatológicas de la BHE. La morfología, la fisiología y consecuentemente la permeabilidad de la BHE se ven alteradas en numerosas enfermedades y todavía no se conoce claramente como esos cambios afectan al acceso de fármacos al SNC. Modelos in vitro de condiciones patológicas podrían ser muy útiles para encontrar soluciones aplicables a estas situaciones. En este sentido, el aislamiento de capilares se ha utilizado para estudiar ciertas condiciones patológicas y, recientemente, se están investigando con este propósito modelos de redes de fibras en 3D, modelos de chip de microfluidos y otros modelos de cultivos celulares. Los diversos métodos in silico, in vitro e in vivo se discuten en cuanto a ventajas y limitaciones en el Capítulo 3 y se justifica la necesidad del desarrollo de un nuevo sistema de predicción como objetivo central de esta Memoria. Durante las fases preclínicas del desarrollo de medicamentos, los experimentos para la determinación de la permeabilidad son esenciales a la hora de seleccionar moléculas candidatas para su posterior desarrollo clínico. La estimación del valor de permeabilidad de estas moléculas es un punto crítico que permitirá incorporar o descartar a los candidatos para las fases posteriores, por lo que el valor de permeabilidad obtenido debe ser lo más exacto y preciso posible. Para ello es necesario controlar los factores pre-experimentales, experimentales y post-experimentales que pueden influir en la obtención de dicho valor. En el Capítulo 4 se revisan estas metodologías de cálculo y se propone un nuevo método de estimación. Tavelin y col. habían propuesto en 2002 una nueva ecuación para calcular la permeabilidad cuando el experimento de transporte no cumplía las condiciones sink o sumidero. También describieron la presencia de perfiles atípicos en los que la velocidad inicial está alterada debido a factores propios del investigador, o factores asociados a las características fisicoquímicas del compuesto, así como condicionantes propios del diseño experimental. El modelo non-sink clásico presenta una infra- o sobreestimación del valor de permeabilidad en situaciones de perfiles atípicos, es por ello que surgió la necesidad de diseñar una nuevo modelo para calcular la permeabilidad que se ha llamado MNS (modificación de la ecuación non-sink.). Mediante la simulación de experimentos de transporte, se ha explorado la capacidad predictiva del nuevo modelo MNS, para diferentes perfiles de cantidad-concentración frente al tiempo, incluyendo aquellos en los cuales la permeabilidad se ve alterada en las primeras fases del ensayo experimental y se ha comparado frente a los métodos clásicos sink y no-sink. El modelo se ha probado considerando diferentes niveles de variabilidad experimental y, finalmente se ha explorado su utilidad para la clasificación de fármacos según el sistema BCS (Biopharmaceutical Classification System). Los resultados han demostrado que el método MNS es preciso y exacto para el cálculo de la permeabilidad en cualquier tipo de perfil y en diferentes escenarios de variabilidad, bajo condiciones sink y no-sink, mientras que el modelo estándar No-Sink presenta una peor capacidad predictiva en aquellas situaciones dónde se ve alterado el paso de fármaco a través de la monocapa en las fases iniciales del ensayo experimental. Los modelos de regresión lineal, Sink y Sink corregida, no son válidos en condiciones no-sink, debido a que no se cumplen las asunciones necesarias para su utilización, pero tampoco en condiciones sink donde hay una alta variabilidad experimental. Otros factores que pueden afectar el valor de permeabilidad calculado son los relativos a los protocolos o procedimientos normalizados de trabajo de la técnica experimental. Este aspecto se aborda en el Capítulo 5. En esta tesis doctoral se ha realizado un estudio para comparar los resultados obtenidos utilizando distintos protocolos que se diferenciaban fundamentalmente en la edad de las monocapas utilizadas (pases) y en la distinta maduración de las células antes de realizar el experimento (días post-sembrado), así como en el uso de insertos recubiertos o no con colágeno. Los resultados obtenidos demostraron diferencias estadísticamente significativas en el valor de permeabilidad según las distintas condiciones ensayadas. Es por ello que, la estandarización y la demostración de la idoneidad de los métodos experimentales son pasos necesarios para la utilización de los valores de permeabilidad con fines regulatorios o de predicción del comportamiento in vivo durante el desarrollo clínico. Generalmente, se ha prestado más atención a la validación de los procesos experimentales y menos al análisis matemático de los resultados, aunque los modelos matemáticos estándar presenten una serie de asunciones que no siempre se mantienen experimentalmente. Una vez controlada la fiabilidad en la obtención de la permeabilidad para fármacos candidatos a atravesar la BHE se procede al cálculo de los parámetros que rigen dichos procesos. Los parámetros más relevantes para la predicción de la velocidad y cantidad que atraviesa la BHE son: fu, plasma (fracción de fármaco libre en plasma), Kpuu, brain (relación entre la concentración de fármaco libre en plasma y cerebro) y Vu, brain (volumen de distribución en el cerebro). Su estimación requiere todavía de modelos in vivo y de experimentos in vitro de cribado rápido conjuntamente, lo cual dificulta el cribado rápido de moléculas candidatas a actuar en el SNC en las fases iniciales de desarrollo clínico. El objetivo principal de este trabajo es el desarrollo de un nuevo método in vitro de cribado rápido para la predicción de la velocidad y cantidad de fármaco que atraviesa la BHE y se discute en el Capítulo 6. El sistema permite estimar los parámetros anteriormente descritos en un único método experimental, utilizando monocapas celulares in vitro bajo diferentes condiciones. A partir de relaciones entre los valores de permeabilidad obtenidos bajo cada condición y con el adecuado análisis matemático, se estiman todos los parámetros relevantes. Se seleccionaron diez compuestos y se estimaron sus valores de permeabilidad utilizando líneas celulares MDCKII y MDCKII-MDR1 en ausencia o presencia de albúmina y homogeneizado de cerebro. Los ratios entre las permeabilidades obtenidas en presencia y ausencia de albúmina permiten estimar la fracción libre en plasma in vitro. Por otro lado, los ratios entre las permeabilidades en presencia y ausencia de homogeneizado de cerebro permiten la estimación de la fracción libre en cerebro in vitro. Kpuu, brain y Vu, brain se estiman a partir de la relación entre las permeabilidades apical y basal en condiciones estándar. Los parámetros in vitro se correlacionaron con los parámetros de los mismos compuestos obtenidos en experimentos in vivo. Con ello, se ha demostrado una alta capacidad predictiva del comportamiento in vivo de los compuestos utilizando el sistema experimental propuesto. La línea celular MDCKII presentó un mayor nivel de correlación frente a los valores in vivo de fu, plasma, Kpuu, brain y Vu, brain (R=0.93, R=0.85 y R=0.99, respectivamente). Debido a su sencillez, destaca notablemente el nivel de correlación obtenido, a pesar del número reducido de compuestos con características fisicoquímicas y mecanismos de transporte asociados tan diversos. Modificaciones experimentales posteriores serán necesarias, con el fin de optimizar el método, pero los resultados obtenidos hasta el momento demuestran su viabilidad. Del mismo modo que otros modelos de cultivos celulares in vitro, el sistema es adecuado para la miniaturización y robotización con el objetivo de establecer mecanismos de cribado rápido de candidatos en el desarrollo de medicamentos

Novel CNS drug discovery and development approach: model-based integration to predict neuro-pharmacokinetics and pharmacodynamics

Pharmacolog