Improving the performance and evaluation of computer-assisted semen analysis

Semen analysis is performed routinely in fertility clinics to analyze the quality of semen and sperm cells of male patients. The analysis is typically performed by trained technicians or by Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) systems. Manual semen analysis performed by technicians is subjective, time-consuming, and laborious, and yet most fertility clinics perform semen analysis in this manner. CASA systems, which are designed to perform the same tasks automatically, have a considerable market share, yet many studies still express concerns about their accuracy and consistency. In this dissertation, the focus is on detection, tracking, and classification of sperm cells in semen images, key elements of CASA systems. The objective is to improve existing CASA algorithms and systems by applying validated computer vision, tracking, and computational intelligence algorithms. The first step of the study is the development of simulation models for generating synthetic images of semen samples. The images enable the assessment of CASA systems and their algorithms. Specifically, the simulation models generate time-lapse images of semen samples for various sperm image categories and include ground truth labels. The models exploit standard image processing operations such as point spread functions and 2D convolutions, as well as new models of sperm cell swimming, developed for this study. They embody multiple studies of sperm motility in the form of parameterized motion equations. Use cases are presented to use the swimming models and the simulated images to assess and compare algorithms for sperm cell segmentation, localization, and tracking. Second, a digital washing algorithm is presented for unwashed semen samples. Digital washing has the potential to replace the chemical washing techniques used by fertility clinics at present, which are costly, time-consuming, and unfriendly to the environment. The digital washing algorithm extracts features from moving sperm cells in an image, and uses these features to identify all sperm cells (moving and stationary) within each studied image (simulated or real). The effectiveness of the digital washing algorithm is demonstrated by comparing the performance of the proposed algorithm to other cell segmentation and detection techniques. Third, a classification algorithm for sperm cells is developed, based on their swimming patterns. The classification algorithm uses K-means clustering on a subset of motility parameters of sperm cells selected by the Artificial Bee Colony (ABC) algorithm. Results of classification and clustering are shown, using simulated and real semen images. Swimming pattern classification has the potential to increase understanding of the relationship between the distribution of sperm cell swimming modes in a patient’s semen image and the fertility of that patient. Lastly, a new method is presented to calculate motility parameters from sperm tracks. The movement of sperm cell is modeled as a sinusoidal traveling wave (“traveling sinusoid”). The amplitude and average path of a moving cell are estimated using an extended Kalman filter (EKF). The states estimated by the EKF include position, velocity, amplitude, and frequency of the traveling wave. The motility parameters calculated from this approach are shown to be superior to those calculated by other existing methods in terms of their accuracy and consistency. CASA developers will find in this study (and in the software made available) new tools to improve the performance of their designs, and to compare and contrast different proposed approaches and algorithms

Robust Automatic Multi-Sperm Tracking in Time-Lapse Images

Human sperm cell counting, tracking and motility analysis is of significant interest to biologists studying sperm function and to medical practitioners evaluating male infertility. Today, the prevailing method for analyzing sperm at fertility clinics and research laboratories is laborious and subjective. Namely, the number and quality of sperm are often visually appraised by technicians using a microscope. Although total sperm count and sperm concentration can be reasonably estimated when standard protocols are applied, they have little diagnostic value except in identifying pathologically extreme abnormalities. More dynamic sperm swimming parameters such as curvilinear velocity (VCL), straight-line velocity (VSL), linearity of forward progression (LIN) and amplitude of lateral head displacement (ALH) are increasingly believed to have clinical significance in predicting infertility but are impossible for a human observer to visually discern. Expensive computer-assisted semen analysis (CASA) instruments are also sometimes used but are severely encumbered by crude ad-hoc tracking algorithms which cannot track sperm in close proximity or whose paths intersect and are typically limited to analyzing video clips of < 1 sec duration.In this thesis, we present a robust automatic multi-sperm tracking algorithm that can measure dynamic sperm motility parameters over time in pre-recorded time-lapse images. This effort is informed by progress in signal processing and target tracking technologies over the last three decades. Multi-target tracking algorithms originally developed for radar, sonar and video processing have addressed similar problems in other domains. In this thesis, we demonstrate that their methodologies can be used for sperm tracking and motility analysis. To resolve sperm measurement-to-track association conflicts, we applied and evaluated three multi-target tracking algorithms: the probabilistic data association filter (PDAF), the joint probabilistic data association filter (JPDAF) and the exact nearest neighbor extension to the JPDAF (ENN-JPDAF). We validated the accuracy of our tracking and motility analysis by using simulated sperm trajectories whose ground truth tracks were perfectly known. Using samples collected from five patients at a fertility clinic, we demonstrated automatic sperm detection and tracking even during challenging multi-sperm collision events. Combined analysis, testing and simulation support the use of probabilistic data association techniques robust automatic multi-sperm tracking. This method could provide fertility specialists with new data visualizations and interpretations previously impossible with existing laboratory protocols

Symmetry-breaking phase-transitions in highly concentrated semen

New experimental evidence of self-motion of a confined active suspension is presented. Depositing fresh semen sample in an annular shaped micro- fluidic chip leads to a spontaneous vortex state of the fluid at sufficiently large sperm concentration. The rotation occurs unpredictably clockwise or counterclockwise and is robust and stable. Furthermore, for highly active and concentrated semen, richer dynamics can occur such as self-sustained or damped rotation oscillations. Experimental results obtained with systematic dilution provide a clear evidence of a phase transition toward collective motion associated with local alignment of spermatozoa akin to the Vicsek model. A macroscopic theory based on previously derived Self-Organized Hydrodynamics (SOH) models is adapted to this context and provides predictions consistent with the observed stationary motion

Methods and measures for investigating microscale motility

Motility is an essential factor for an organism's survival and diversification. With the advent of novel single-cell technologies, analytical frameworks and theoretical methods, we can begin to probe the complex lives of microscopic motile organisms and answer the intertwining biological and physical questions of how these diverse lifeforms navigate their surroundings. Herein, we give an overview of different experimental, analytical, and mathematical methods used to study a suite of microscale motility mechanisms across different scales encompassing molecular-, individual- to population-level. We identify transferable techniques, pressing challenges, and future directions in the field. This review can serve as a starting point for researchers who are interested in exploring and quantifying the movements of organisms in the microscale world.Comment: 24 pages, 2 figure

Supervised and unsupervised spermatozoa detection, classification and tracking in imaging data

Tese de mestrado. Bioinformática e Biologia Computacional (Biologia Computacional). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011A aplicação da matemática na pesquisa em biologia tem vindo a ganhar relevância nas últimas décadas. Vários estudos teóricos e quantitativos têm contribuído para o progresso da biologia celular, da biologia do desenvolvimento e da imunologia. Os modelos matemáticos são particularmente úteis em casos onde a regulação genética afecta as propriedades biofísicas da célula e um exemplo é o estudo da biomecânica e hidrodinâmica dos espermatozóides. No entanto, a inexistência de comparações quantitativas rigorosas entre estes modelos e os dados experimentais torna este processo difícil e enviesado. Isto é devido à comparação maioritariamente qualitativa e visual, onde os parâmetros são mudados até o modelo e os dados serem semelhantes. As simulações de células contêm toda a informação geométrica dos objectos que descrevem pelo que podem ser rigorosamente comparadas com as imagens e filmes. Por outro lado, a reconstituição de células é dificultada pelos processos de análise de imagens actuais, que têm um fraco desempenho e que necessitam de supervisão humana. Este último ponto torna a análise de grande quantidade de dados difícil e introduz subjectividade e enviesamento na análise. Desta forma, os avanços na biologia celular quantitativa dependem do desenvolvimento de novos métodos automáticos de análise de imagem. Os sistemas de análise de espermatozóides assistida por computação (CASA) são um bom exemplo onde a bioimagiologia e a sua análise automática foram combinadas com sucesso. Estes sistemas apareceram nos anos 70 e são baseados na análise populacional dos parâmetros de motilidade dos espermatozóides. A sua popularidade advém da sua importância nos sectores médico e económico, uma vez que um em cada seis casais é subfértil e metade dos casos são de origem masculina. A motilidade espermática é essencial para a fertilização. Na viagem até ao ovo, as células espermáticas têm que nadar numa extensão milhares de vezes o seu comprimento através de uma geometria interna complexa cheia de fluídos altamente viscosos e de células imunes potencialmente hostis. Começando com uma população de centenas de milhões, a grande maioria não chegará às trompas de Falópio e muito menos chegarão ao local onde ocorre a fertilização. Adicionalmente, a capacitação espermática e a reacção acrossómica são dois eventos que ocorrem durante esta viagem que podem ser usados para definir a capacidade de fertilização, uma vez que também são essenciais para que esta ocorra. A capacitação prepara a membrana do espermatozóide para receber futuras pistas de localização do óvulo enquanto que a reacção acrossómica liberta enzimas para que o espermatozóide possa penetrar na camada protectora do óvulo enquanto também prepara a membrana espermática para a fusão das duas células. Para além da motilidade espermática, uma abordagem prática para estudar a fertilização tem sido medir a taxa de resposta dos espermatozóides à indução da reacção acrossómica. Actualmente, esta habilidade é medida manualmente em preparações de células espermáticas fixadas e coradas de forma a visualizar o acrossoma, um complexo derivado do Golgi localizado no ápice da célula. Sendo um parâmetro comum e frequentemente usado em pesquisa científica, neste trabalho desenvolvemos um processo automático de classificar os espermatozóides de acordo a reacção acrossómica. O nosso classificador baseia-se na análise de discriminantes, um método que define funções de fronteira entre duas ou mais classes, de acordo com os factores providenciados. Definimos duas classes: Capacitadas, que são células que sofreram capacitação mas que ainda não passaram por nenhum estado de reacção acrossómica, e Reagidas, que já reagiram ou que ainda estão a reagir. Como características escolhemos a intensidade média de sete sub-áreas da cabeça do espermatozóide, dispostas ao longo do seu eixo maior. Primeiro testámos se a Análise de Discriminantes Lineares (LDA) e Análise de Discriminantes Quadráticos (QDA) seriam aceitáveis para classificar este tipo de reacção em células detectadas manualmente. A classificação por QDA teve resultados melhores do que a por LDA, classificando correctamente 98.0% das células, tendo sido seleccionado como modelo de classificação. Tendo em vista uma verdadeira automatização, testámos o mesmo método com células detectadas por segmentação automática da imagem, onde estimámos os parâmetros do módulo de detecção (filtragem de objectos) e classificámos correctamente 94.7% dos objectos que correspondiam a um e apenas um espermatozóide cuja classe era conhecida. No entanto, o processo automático classifica todos os objectos detectados resultando numa classificação todos esses objectos obtivemos um erro de 28.1% na frequência relativa de espermatozóides Reagidos, que é uma diferença significativa. Este erro é maioritariamente devido aos espermatozóides anotados manualmente cuja classe era dúbia, pelo que não foram atribuídos a nenhuma classe. É razoável assumir que todos os espermatozóides dúbios sejam na verdade células que começaram recentemente a reagir e que deverão pertencer à classe Reagidos. Desta forma o erro na frequência de Reagidos obtido é de apenas -2.4%. A eficiência na classificação dos objectos detectados automaticamente cujas classes eram conhecidas e o facto de o classificador ter classificado as dúbias como Reagidas apoia esta hipótese. Provavelmente, é necessário treinar o modelo de classificação com dados anotados por um especialista na área da reacção acrossómica para poder generalizar o nosso modelo correctamente. É ainda de salientar que, pelo nosso processo, detectámos apenas 49.0% das células, uma vez que muitas detecções tratavam-se de facto de agregados celulares. Este agregados foram filtrados antes da classificação pois iriam enviesar a classificação. Para evitar este problema, propomos o uso de preparações com menos densidade celular, diminuindo o número e tamanho das agregações e permitindo melhor detecção e resultados mais fiáveis. A maioria dos métodos actuais de detecção de espermatozóides (i.e. incluindo o nosso) sofrem do mesmo problema: resolver as células quando estão agregadas. Com o intuito de ultrapassar as suas limitações, desenvolvemos um novo algoritmo de detecção. O nosso método visa tirar partido da informação do espermatozóide, como conhecimento a priori, e da informação contida em imagens de série temporal, podendo ser também aplicado em imagens isoladas, como demonstramos. A ideia base é aplicar uma função que descreva a forma e movimento do espermatozóide ao longo do tempo à célula na imagem, estimando os parâmetros dessa função através da posição e forma de potenciais objectos nessas imagens. Se o melhor ajuste da função for bom, é muito provável que um espermatozóide se encontra nas posições e com as formas modeladas. Devido à complexidade em desenvolver, ajustar e validar um modelo baseado em equações diferenciais, neste trabalho tabelámos a posição, rotação e conformação flagelar dum espermatozóide de ouriço-do-mar da espécie Lytechinus pictus. Para validar o nosso método, tentámos detectar o espermatozóide tabelado usando apenas uma imagem (i.e. ajuste local) e ainda rastreá-lo ao longo do tempo (i.e. ajuste global). Tanto a detecção como o rastreamento foram eficazes. Para generalizar este modelo, usámos um filme de um espermatozóide de Strongylocentrotus purpuratus (i.e. outro ouriço-do-mar) e conseguimos detectar e rastrear essa mesma célula, tendo havido apenas uma pequena acumulação de erro nos últimos tempos de amostragem que poderá ser devido à diferença inter-espécie ou a este espermatozóide não ter uma dinâmica estacionária (i.e. a nadar em círculos com a frequência flagelar constante). Podemos iterar o processo global em todas as imagens e seleccionar as instâncias do modelo correspondentes ao mesmo espermatozóides, ou seja, a mesma célula mas fitado localmente em imagens/tempos diferentes, de forma a obter o melhor modelo do espermatozóide nesse filme. Este processo de ajuste local pode ser usado em imagens isoladas (i.e. independência espacial) e, consequentemente, para detectar os espermatozóides humanos usados na classificação, desde que o espermatozóide tabelado seja ajustado. Uma questão interessante é se o nosso modelo consegue aumentar a resolução temporal e espacial da microscopia. Analisando uma sub-amostra temporal conseguimos detectar e rastrear a célula correctamente, tendo o nosso modelo sido coerente com os tempos de amostragem não usados para ajustar os parâmetros. De modo semelhante, conseguimos ainda obter boas estimativas da posição do flagelo em imagens onde apenas a informação da cabeça estava disponível (i.e. os flagelos não eram visíveis). No entanto, das várias instâncias do modelo referentes a esse espermatozóide, não conseguimos escolher a que mais se aproximava à célula, pelo que é necessário um método de selecção diferente que inclua mais informação. Os métodos desenvolvidos podem ser integrados em modelos morfodinâmicos, onde forma, mecânica e sinalização são combinados, e revolucionar os sistemas CASA, que estão até à data por integrar motilidade e processos bioquímicos.Recent advances in microscopy, by allowing to visualize cells and tissues in their natural physiological context, expanded the research possibilities to unprecedented domains. However, progress is hindered by the virtual absence of automatic image analysis methods that extract quantitative information from images. At best, image analysis is based on semi-automatic methods that require human supervision which is subjective and biased. This is how spermatozoa research stands at the moment and here we address three major computational issues in sperm imaging research: classification, detection and tracking. Sperm capacitation, acrosomal reaction and motility play an important role in fertility, which is a subject of growing medical and economic importance. In sperm research, acrosomal reaction is commonly measured by image analysis but, since no automatic classifier exists, it is performed manually. We developed and compared a method based on Discriminant Analysis capable of distinguishing capacitated cells which have not undergone acrosomal reaction from cells which are reacting or have reacted with over 94% of efficiency. The major difficulty encountered was automatic spermatozoa detection and a method to detect and track was devised - detect while tracking. This method uses a model of a sperm cell as a priori knowledge and can define well the sperm flagella position. We showed it can also predict sperm cells and their flagella at higher temporal resolution than the image sequence under study. It also has the potential to estimate flagellar conformations when only the sperm head positions are available but more sources of information are required in order to get the right conformation. Our methods modules can be easily adapted to any experimental setting (i.e. different labelling or sperm cell model) and the methods themselves can be combined to each other or to other available methods in order to facilitate sperm research

Sea urchin spermatozoa as case study

"Digitization and robotization of laboratory equipment has recently contributed to the generation of high content of data and its metadata. While this seems like an advantage for science's celerity, the analysis of such data became the limiting step { a very narrow bottleneck. Such is the case for imaging data acquisition and its analysis. After collecting Gigabytes of images, researchers spend several orders of magnitude of more time to determine the regions of interest (ROIs) (e.g. cell) and to measure relevant attributes (e.g. mean uorescence intensity). This manual curation of data promotes another issue that is related with the reproducibility of the analysis, e.g., the same researcher will hardly select the exact same ROIs in the same data set. Furthermore, there is also the possibility of bias in the selection of which cells to use in the analysis by biased determination of the ROIs.(---)

Hypoxia causes transgenerational impairments in reproduction of fish

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