Disulfide Bond and Topological Isomerization of the Conopeptide PNID: Disulfide Bonds with a Twist.

Ph.D. Thesis. University of Hawaiʻi at Mānoa 2017

Développement de stratégies de marquage isotopique des groupements méthyles pour l'étude d'assemblages protéiques de grande taille par RMN

Solution NMR spectroscopy has been limited to small biological objects for a long time. Nowadays, it is unequivocally recognized that the strategy of specific isotope labeling of methyl groups in a perdeuterated protein has significantly extended the frontier of this technique. Indeed, proteins as large as 1 MDa could be investigated by NMR. Conversely, this strategy presents an important drawback consisting of the drastically reduced number of protonated probes. The project of this thesis falls within the framework of developing new methodologies to cope with this scarce structural information, relying on the simultaneous labeling of several methyl groups to increase the number of probes. For optimized combinatorial labeling, the choice of the ensemble of amino acids to label simultaneously and the precursors as well as the protocol for their incorporation have to be carefully studied. In this work, a new protocol was introduced for the scrambling-free and optimized isotopic labeling of AbId1(LV)proS methyl groups. In comparison to the “standard AbId1LV” labeling scheme, the proposed pattern induces a 2-fold decrease of number of Leu and Val NMR signals and enhances the intensity of detectable long-range nOes by a factor 4. The described protocol also permits the suppression of spurious correlations, especially harmful for structural studies based on detection/analysis of nOes. To make an efficient use of the obtained high quality NMR spectra using this protocol, assignment of the methyl groups signals is mandatory. Two strategies were then proposed. The first is suitable for systems whose molecular weight does not exceed 100 kDa. It relies on the use of isotopically linearized precursors (with different isotope topologies to discriminate each methyl group) to assign in a regio- and stereo-specific manner the isoleucine, leucine and valine methyl groups in a single step, employing an optimized “out and back” 13C-TOCSY pulse sequence. While the second, adapted to supra-molecular proteins (> 100 kDa), consists of optimizing the previously reported SeSAM approach (Sequence-Specific Assignment of Methyl groups by Mutagenesis). Indeed, thanks to the developed enriched culture medium for the specific labeling of Ala, the minimal required culture volume was significantly decreased, enabling the proteins expression in 24 well plates and their parallel purification in 96 well plates. This improved SeSAM version was estimated to allow the assignment of ca. 100 methyl cross-peaks in 2 weeks, including 4 days of NMR time and less than 2 k€ of isotopic materials. To illustrate the pertinence of using selectively protonated methyl groups, either in a single or combined fashion, several applications were presented, namely the real-time NMR study of self-assembly process of a ~0.5 MDa supra-molecular protein (PhTET-2). The use of combinatorial labeling for the detection of long-range nOes to up to 10 Å (8 Å) in proteins of 82 kDa (respectively 0.5 MDa) was also investigated. This same approach was exploited for the filtering of inter-monomeric long-range nOes in the same symmetrical and homo-oligomeric PhTET-2 protein.Durant longtemps la spectroscopie RMN en solution a été limitée à de petits objets biologiques. Aujourd'hui, il est clairement reconnu que la stratégie du marquage isotopique spécifique de groupements méthyle dans une protéine perdeutérée a considérablement repoussé la frontière de cette technique. En effet, des protéines aussi grande que 1 MDa ont pu être récemment étudiées par RMN. Cependant, cette stratégie présente un inconvénient important lié au nombre réduit de sondes protonées. Dans ce contexte, le projet de thèse vise a développer de nouvelles méthodes pour faire face à cette rareté d'information structurale, en s'appuyant sur le marquage simultané (combinatoire) de plusieurs groupements méthyle afin d'augmenter le nombre de sondes. Pour un marquage combinatoire optimal, le choix des acides aminés à marquer et les précurseurs à utiliser ainsi que le protocole de leur incorporation doit être judicieusement étudié. Dans le présent travail, un nouveau protocole a été mis en place pour un marquage AbId1(LV)proS optimisé, exempt de toutes fuites isotopiques. En comparaison avec le marquage “AbId1LV standard", le modèle proposé permet la diminution d'un facteur de 2 le nombre de signaux RMN des Leu et Val et améliore par un facteur de 4 l'intensité des nOes à long portée qui sont expérimentalement détectable. Par ailleurs, ce protocole permet également la suppression des corrélations parasites, particulièrement nocives pour les études structurales basées sur la détection / analyse de nOes. Afin d'exploiter les spectres RMN obtenus en utilisant le protocole ci-dessus mentionné, l'attribution des signaux des méthyles est obligatoire. Deux stratégies ont été donc proposées. La première s'applique aux systèmes dont le poids moléculaire ne dépasse pas les 100 kDa (e.g. MSG). Elle se repose sur la linéarisation du marquage isotopique des acides aminés permettant ainsi l'utilisation de l'expérience 13C-TOCSY pour attribuer de manière régio et stéréo-spécifique les méthyles de l'isoleucine, leucine et valine en une seule étape. En ce qui concerne la seconde, adaptée aux protéines supra-moléculaire (> 100 kDa), c'est une optimisation de l'approche SeSAM (Sequence-Specific Assignment of Methyl groups by Mutagenesis) précédemment décrite dans la littérature. En effet, grâce au milieu de culture enrichi, mit au point pour le marquage spécifique de l'Ala, le volume minimal de culture requis a été considérablement diminué. Ceci a permis par conséquence de produire les protéines dans des plaques de 24 puits et de les purifier dans des plaques de 96 puits, raccourcissant ainsi le temps global de préparation des échantillons. Il a été estimé que l'utilisation de cette version améliorée de SeSAM offre la possibilité d'attribuer environ 100 méthyles en 2 semaines, dont 4 jours de temps de RMN, en consommant moins de 2 k € de matériaux isotopiques. Pour illustrer la pertinence du marquage isotopique et la protonation sélectifs des méthyles, de façon combinée ou pas, de nombreuses applications ont été présentés, à savoir l'étude en temps réel des processus d'auto-assemblage d'une protéine supramoléculaire (PhTET-2, ~ 0,5 MDa) par RMN. Le marquage combinatoire des protéines (82 kDa et 0,5 MDa) pour la détection de nOes longue portée (jusqu'à 10 Å et 8 Å respectivement) a également été étudié. Cette même approche a également été utilisée pour le filtrage de nOes inter-monomères à long portée, qui sont particulièrement importants pour le calcul de structure, dans des systèmes symétrique et homo-oligomèriques (PhTET-2)

45th Rocky Mountain Conference on Analytical Chemistry

Final program, abstracts, and information about the 45th annual meeting of the Rocky Mountain Conference on Analytical Chemistry, co-endorsed by the Colorado Section of the American Chemical Society and the Rocky Mountain Section of the Society for Applied Spectroscopy. Held in Denver, Colorado, July 27-31, 2003

Développement de stratégies de marquage isotopique des groupements méthyles pour l'étude d'assemblages protéiques de grande taille par RMN

Solution NMR spectroscopy has been limited to small biological objects for a long time. Nowadays, it is unequivocally recognized that the strategy of specific isotope labeling of methyl groups in a perdeuterated protein has significantly extended the frontier of this technique. Indeed, proteins as large as 1 MDa could be investigated by NMR. Conversely, this strategy presents an important drawback consisting of the drastically reduced number of protonated probes. The project of this thesis falls within the framework of developing new methodologies to cope with this scarce structural information, relying on the simultaneous labeling of several methyl groups to increase the number of probes. For optimized combinatorial labeling, the choice of the ensemble of amino acids to label simultaneously and the precursors as well as the protocol for their incorporation have to be carefully studied. In this work, a new protocol was introduced for the scrambling-free and optimized isotopic labeling of AbId1(LV)proS methyl groups. In comparison to the “standard AbId1LV” labeling scheme, the proposed pattern induces a 2-fold decrease of number of Leu and Val NMR signals and enhances the intensity of detectable long-range nOes by a factor 4. The described protocol also permits the suppression of spurious correlations, especially harmful for structural studies based on detection/analysis of nOes. To make an efficient use of the obtained high quality NMR spectra using this protocol, assignment of the methyl groups signals is mandatory. Two strategies were then proposed. The first is suitable for systems whose molecular weight does not exceed 100 kDa. It relies on the use of isotopically linearized precursors (with different isotope topologies to discriminate each methyl group) to assign in a regio- and stereo-specific manner the isoleucine, leucine and valine methyl groups in a single step, employing an optimized “out and back” 13C-TOCSY pulse sequence. While the second, adapted to supra-molecular proteins (> 100 kDa), consists of optimizing the previously reported SeSAM approach (Sequence-Specific Assignment of Methyl groups by Mutagenesis). Indeed, thanks to the developed enriched culture medium for the specific labeling of Ala, the minimal required culture volume was significantly decreased, enabling the proteins expression in 24 well plates and their parallel purification in 96 well plates. This improved SeSAM version was estimated to allow the assignment of ca. 100 methyl cross-peaks in 2 weeks, including 4 days of NMR time and less than 2 k€ of isotopic materials. To illustrate the pertinence of using selectively protonated methyl groups, either in a single or combined fashion, several applications were presented, namely the real-time NMR study of self-assembly process of a ~0.5 MDa supra-molecular protein (PhTET-2). The use of combinatorial labeling for the detection of long-range nOes to up to 10 Å (8 Å) in proteins of 82 kDa (respectively 0.5 MDa) was also investigated. This same approach was exploited for the filtering of inter-monomeric long-range nOes in the same symmetrical and homo-oligomeric PhTET-2 protein.Durant longtemps la spectroscopie RMN en solution a été limitée à de petits objets biologiques. Aujourd'hui, il est clairement reconnu que la stratégie du marquage isotopique spécifique de groupements méthyle dans une protéine perdeutérée a considérablement repoussé la frontière de cette technique. En effet, des protéines aussi grande que 1 MDa ont pu être récemment étudiées par RMN. Cependant, cette stratégie présente un inconvénient important lié au nombre réduit de sondes protonées. Dans ce contexte, le projet de thèse vise a développer de nouvelles méthodes pour faire face à cette rareté d'information structurale, en s'appuyant sur le marquage simultané (combinatoire) de plusieurs groupements méthyle afin d'augmenter le nombre de sondes. Pour un marquage combinatoire optimal, le choix des acides aminés à marquer et les précurseurs à utiliser ainsi que le protocole de leur incorporation doit être judicieusement étudié. Dans le présent travail, un nouveau protocole a été mis en place pour un marquage AbId1(LV)proS optimisé, exempt de toutes fuites isotopiques. En comparaison avec le marquage “AbId1LV standard", le modèle proposé permet la diminution d'un facteur de 2 le nombre de signaux RMN des Leu et Val et améliore par un facteur de 4 l'intensité des nOes à long portée qui sont expérimentalement détectable. Par ailleurs, ce protocole permet également la suppression des corrélations parasites, particulièrement nocives pour les études structurales basées sur la détection / analyse de nOes. Afin d'exploiter les spectres RMN obtenus en utilisant le protocole ci-dessus mentionné, l'attribution des signaux des méthyles est obligatoire. Deux stratégies ont été donc proposées. La première s'applique aux systèmes dont le poids moléculaire ne dépasse pas les 100 kDa (e.g. MSG). Elle se repose sur la linéarisation du marquage isotopique des acides aminés permettant ainsi l'utilisation de l'expérience 13C-TOCSY pour attribuer de manière régio et stéréo-spécifique les méthyles de l'isoleucine, leucine et valine en une seule étape. En ce qui concerne la seconde, adaptée aux protéines supra-moléculaire (> 100 kDa), c'est une optimisation de l'approche SeSAM (Sequence-Specific Assignment of Methyl groups by Mutagenesis) précédemment décrite dans la littérature. En effet, grâce au milieu de culture enrichi, mit au point pour le marquage spécifique de l'Ala, le volume minimal de culture requis a été considérablement diminué. Ceci a permis par conséquence de produire les protéines dans des plaques de 24 puits et de les purifier dans des plaques de 96 puits, raccourcissant ainsi le temps global de préparation des échantillons. Il a été estimé que l'utilisation de cette version améliorée de SeSAM offre la possibilité d'attribuer environ 100 méthyles en 2 semaines, dont 4 jours de temps de RMN, en consommant moins de 2 k € de matériaux isotopiques. Pour illustrer la pertinence du marquage isotopique et la protonation sélectifs des méthyles, de façon combinée ou pas, de nombreuses applications ont été présentés, à savoir l'étude en temps réel des processus d'auto-assemblage d'une protéine supramoléculaire (PhTET-2, ~ 0,5 MDa) par RMN. Le marquage combinatoire des protéines (82 kDa et 0,5 MDa) pour la détection de nOes longue portée (jusqu'à 10 Å et 8 Å respectivement) a également été étudié. Cette même approche a également été utilisée pour le filtrage de nOes inter-monomères à long portée, qui sont particulièrement importants pour le calcul de structure, dans des systèmes symétrique et homo-oligomèriques (PhTET-2)

Towards automated structure determination

Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der konventionellen strukturellen und dynamischen Charakterisierung von gefaltenen und intrinsisch ungefaltenen Proteinen mittels NMR Spektroskopie. ICln ist ein hochkonserviertes und essentielles 27kDa protein und ist in verschiedenen Signaltransduktionswegen wie Zellvolumsregulation, Angiogenese, oder RNA Prozessierung involviert. Basierend auf Rekonstitutionsexperimente in Membranlipiden und anderen Ergebnissen chloridkanalbildende Funktion von ICln vorgeschlagen. Obwohl knock-down Experimente eine direkte funktionelle Eigenschaft dieses Proteins in der Zellvolumsregulation anzeigten, wurde durch näheren Vergleich der biophysikalischen Charakteristika von Chloridstromen aus Zellen unter hypoosmotischen Bedingungen (die in allen bislang untersuchten Zelltypen praktisch gleich sind) mit jenen erhalten aus ICln Überexpression in Xenopus oocyten einige deutliche Unterschiede sichtbar. Weiters zeigten Immunofluorenszenzexperimente unter normalen Bedingungen eine primare zytoplasmatische Lokalisation des Proteins an, das erst durch hypoosmotische Induktion in oder nahe zur Plasmamembran translokalisier wird. Diese Ergebnisse ließen einige Zweifel an einer porenbildenden Kanalfunktion von ICln aufkommen und viele Forschern ordneten dem Protein in diesem Zusammenhang daraufhin eine rein regulatorische Rolle zu. Nichtsdestoweniger ist die Identifizierung oder der Ausschluß potentieller chloridkanalbildender Kanditaten enorm wichtig, da physiologische Veranderungen in der Chloridepermeabilitat die Grundlage vieler schwerer Erkrankungen, wie der Osteopetrosis, der Dent'sche Krankheit oder des Bartter Syndroms sind. Zur diesem Zweck wurde die tertiäre Struktur von ICln in Lösung bestimmt. Dabei zeigte sich das der N-terminale Teil des Proteins in eine Pleckstrin Homologiedoman-analoge Struktur faltet (ein Strukturmotif das bereits in vielen signaltranduktionsregulatorischen Protein identifiziert wurde), wohingegen der C-terminale Abschnitt intrinisch unfaltet ist mit einigen wenigen Sequenzbereichen mit schwach ausgepragter Sekundarstrukturpreferenz. Des weiteren konnten Interaktionen mit dem membrannahen cytoplasmatischen Teil des Blutplatchen alpha2beta-Integrinprotein und mit dem Faktor LSm4 (einem funktionellen Protein in der snRNP Biogenese) nachgewiesen werden. Eine weitere manuelle Strukturanalyse befaßte sich mit der Bestimmung der Lösungskonformation von Cyclophilin D, einem Mitglied der Immunophilin Familie, das an den mitochondrialen Permeabilitatsporenapparat bindet, und ein interessantes Zielprotein bei der Behandlung von neurodegenerativen Erkrannkungen darstellt. Nebenbei wurde eine bereits publizierte NMR-Struktur der LIM1 Domane aus CRP2 verfeinert. Weitere NMR Analysen beschäftigten sich mit den intrinsisch ungefaltenen Proteinen BASP1 and Osteopontin (OPN), beide sehr vielversprechende Zielproteine für die Krebsforschung. In Anlehnung zur Bewaltigung des enormen Aufwands eines structural genomic Projekts wurde im zweitem Teil dieser Arbeit eine einfache sogenannte direkte Methode zur raschen Strukturcharakterisierung in dieser Arbeit entwickelt und anhand experimenteller Daten getestet. Zuletzt wurde das Leistungsvermogen eines von unserem Gruppenleiter verfaßtem Programm für die automatische Vorhersage der Ligandbindungstelle anhand verschiedener Protein-Ligand Komplexe aus der Datenbank evaluiert

Development of a universal alignment medium for the extraction of RDCs and structure elucidation with tensorial constraints

In der hochauflösenden Kernresonanzspektroskopie liefern rest-anisotrope Parameter wie dipolare Restkopplungen (RDcs), restliche chemische Verschiebungsanisotropien (RCSAs) und quadrupolare Restkopplungen (RQCs) wertvolle Informationen, die zu den unter isotropen (standard-) Bedingungen gemessenen NMR-Parametern für die Strukturverfeinerung und -aufklärung komplementär sind. Daher ist ein homogenes und ausreichend schwaches sogenanntes "Alignment" in sogenannten Alignmentmedien erforderlich, um eine geringe Anisotropie in der Probe zu induzieren. Obwohl eine Vielzahl unterschiedlicher Alignmentmedien und -methoden existiert, werden sie recht selten genutzt, da die derzeit verfügbaren üblichen Alignmentmedien entweder speziell für die Anwendung mit kleinen organischen Molekülen oder für große (Bio-) Makromoleküle entwickelt wurden und ihre Verwendung auf bestimmte Lösungsmittel beschränkt ist. Neben flüssigkristallinen Phasen werden mechanisch gestreckte oder gestauchte Polymergele zur adäquaten Ausrichtung von gelösten Stoffen eingesetzt. Oft kann die Präparation von Proben bis zum Äquilibrieren bis zu Wochen und Monaten dauern, was die Nutzung dieser Methoden im kommerziellen Bereich eher erschwert. Frühere Untersuchungen mit vernetzten Polyethylenoxid-Hydrogelen (PEO) zeigten eine erhebliche Quellung in einer Vielzahl von Lösungsmitteln. Leider erforderte die Vernetzung die Verwendung von $\beta$- oder $\gamma$-Strahlung oder wochenlange Bestrahlung mit ultraviolettem Licht. In dieser Arbeit wird ein schneller Syntheseweg optimiert und vorgestellt, um homogene Gelstäbchen auf Basis von PEO als Alignmentmedien herzustellen, der mit den in jedem modernen Labor verfügbaren Mitteln nachvollzogen werden kann. Darüberhinaus wird das Quellverhalten in einer Vielzahl von reinen Lösungsmitteln und Gemischen aufgezeigt und der Einfluss des Massengehalts während der Vernetzung untersucht. Durch Verwendung eines Ausgangsmaterials mit geringer Dispersität wird Kontrolle über die Verteilung der Kettenlängen zwischen den Vernetzungspunkten ermöglicht, wodurch homogene Gele mit schmalen Linienbreiten erhalten werden. Gequollene Poly(ethylen oxid) diacrylat (PEODA) Gele, die mit unterschiedlichem Massenanteil vernetzt wurden, werden zusätzlich mit Doppelquanten NMR (DQ-NMR) untersucht, um das Verhältnis von vernetztem Anteil und der Solfraktion inklusive der Defekte im Netzwerk zu ermitteln. Die Anwendbarkeit von PEODA in skalierbaren Streck- und Kompressionsapparaturen wird präsentiert und erfolgreich mit reinen Lösungsmitteln und Gemischen demonstriert. Hierbei wird eine Methode eingeführt, die ein schnelles externes Äquilibrieren und Übertragen in die Probenröhrchen ermöglicht. Es wird gezeigt, dass durch Feinabstimmung verschiedener Parameter, vernetztes PEODA als universelles Alignmentmedium für gelöste Substanzen, die von kleinen Naturstoffen bis zu Proteinen reichen, geeignet ist. Die bisher angewandte Methode der manuellen Extraktion von Kopplungen ist zeitaufwändig und subjektiv. Es wird ein Verfahren zur halbautomatischen Extraktion von Kopplungen vorgestellt, welches mathematisch auf der Anwendung von Kreuz- bzw. Autokorrelationen beruht. Für die Auswertung von RDCs an kleinen organischen Molekülen, wurden Moleküldynamiksimulationen mit orientierenden Randbedingungen evaluiert und angewandt (engl.: molecular dynamics with orientational constraints, MDOC), einer Molekülmechanik-Methode, die ohne Annahmen über die Ausgangskonformation auskommt. Die Methode ermöglicht die Bestimmung des Konformationsraums anhand experimenteller anisotroper Daten, die als tensoriell orientierende Bedingungen in das Kraftfeld einfließen. Wenn gelöste Moleküle flexibel sind und in unterschiedlichen Konformationen auftreten, ist die Interpretation der Daten mit bisherigen Methoden aufgrund der gemittelten Natur der extrahierten Daten schwierig und Annahmen über auftretende Konformere müssen getroffen werden, die unter Umständen nicht gerechtfertigt sind. In diesen Fällen ist der MDOC Ansatz vorzuziehen, da die Interpretation der RDCs nicht durch die Wahl der Modellierung beeinflusst wird

59th Annual Rocky Mountain Conference on Magnetic Resonance

Final program, abstracts, and information about the 59th annual meeting of the Rocky Mountain Conference on Magnetic Resonance, co-endorsed by the Colorado Section of the American Chemical Society and the Society for Applied Spectroscopy. Held in Snowbird, Utah, July 22-27, 2018

40th Rocky Mountain Conference on Analytical Chemistry

Final program, abstracts, and information about the 40th annual meeting of the Rocky Mountain Conference on Analytical Chemistry, co-sponsored by the Colorado Section of the American Chemical Society and the Rocky Mountain Section of the Society for Applied Spectroscopy. Held in Denver, Colorado, July 25 - August 1, 1998