Hybrid approach for metabolites production using differential evolution and minimization of metabolic adjustment

Microbial strains can be optimized using metabolic engineering which implements gene knockout techniques. These techniques manipulate potential genes to increase the yield of metabolites through restructuring metabolic networks. Nowadays, several hybrid optimization algorithms have been proposed to optimize the microbial strains. However, the existing algorithms were unable to obtain optimal strains because the nonessential genes are hardly to be diagnosed and need to be removed due to high complexity of metabolic network. Therefore, the main goal of this study is to overcome the limitation of the existing algorithms by proposing a hybrid of Differential Evolution and Minimization of Metabolic Adjustments (DEMOMA). Differential Evolution (DE) is known as population-based stochastic search algorithm with few tuneable parameter control. Minimization of Metabolic Adjustment (MOMA) is one of the constraint based algorithms which act to simulate the cellular metabolism after perturbation (gene knockout) occurred to the metabolic model. The strength of MOMA is the ability to simulate the strains that have undergone mutation precisely compared to Flux Balance Analysis. The data set used for the production of fumaric acid is S. cerevisiae whereas data set for lycopene production is Y. lipolytica metabolic networks model. Experimental results show that the DEMOMA was able to improve the growth rate for the fumaric acid production rate while for the lycopene production, Biomass Product Coupled Yield (BPCY) and production rate were both able to be optimized

Improved differential search algorithms for metabolic network optimization

The capabilities of Escherichia coli and Zymomonas mobilis to efficiently converting substrate into valuable metabolites have caught the attention of many industries. However, the production rates of these metabolites are still below the maximum threshold. Over the years, the organism strain design was improvised through the development of metabolic network that eases the process of exploiting and manipulating organism to maximize its growth rate and to maximize metabolites production. Due to the complexity of metabolic networks and multiple objectives, it is difficult to identify near-optimal knockout reactions that can maximize both objectives. This research has developed two improved modelling-optimization methods. The first method introduces a Differential Search Algorithm and Flux Balance Analysis (DSAFBA) to identify knockout reactions that maximize the production rate of desired metabolites. The latter method develops a non-dominated searching DSAFBA (ndsDSAFBA) to investigate the trade-off relationship between production rate and its growth rate by identifying knockout reactions that maximize both objectives. These methods were assessed against three metabolic networks – E.coli core model, iAF1260 and iEM439 for production of succinic acid, acetic acid and ethanol. The results revealed that the improved methods are superior to the other state-of-the-art methods in terms of production rate, growth rate and computation time. The study has demonstrated that the two improved modelling-optimization methods could be used to identify near-optimal knockout reactions that maximize production of desired metabolites as well as the organism’s growth rate within a shorter computation time

Enhanced dynamic flux variability analysis for improving growth and production rate in microbial strains

Metabolic engineering is highly demanded currently for the production of various useful compounds such as succinate and lactate that are very useful in food, pharmaceutical, fossil fuels, and energy industries. Gene or reaction deletion known as knockout is one of the strategies used in in silico metabolic engineering to change the metabolism of the chosen microbial cells to obtain the desired phenotypes. However, the size and complexity of the metabolic network are a challenge in determining the near-optimal set of genes to be knocked out in the metabolism due to the presence of competing pathway that interrupts the high production of desired metabolite, leading to low production rate and growth rate of the required microorganisms. In addition, the inefficiency of existing algorithms in reconstructing high growth rate and production rate becomes one of the issues to be solved. Therefore, this research proposes Dynamic Flux Variability Analysis (DFVA) algorithm to identify the best knockout reaction combination to improve the production of desired metabolites in microorganisms. Based on the experimental results, DFVA shows an improvement of growth rate of succinate and lactate by 12.06% and 47.16% respectively in E. coli and by 4.62% and 47.98% respectively in S. Cerevisae. Suggested reactions to be knocked out to improve the production of succinate and lactate have been identified and validated through the biological database

Microbial production of advanced biofuels

Concerns over climate change have necessitated a rethinking of our transportation infrastructure. One possible alternative to carbon-polluting fossil fuels are biofuels produced from a renewable carbon source using engineered microorganisms. Two biofuels, ethanol and biodiesel, have been made inroads to displacing petroleum-based fuels, but their penetration has been limited by the amounts that can be used in conventional engines and by cost. Advanced biofuels that mimic petroleum-based fuels are not limited by the amounts that can be used in existing transportation infrastructure, but have had limited penetration due to costs. In this review, we will discuss the advances in engineering microbial metabolism to produce advanced biofuels and prospects for reducing their costs

Optimización de la producción aerobia de ácido succínico y ácido málico a partir de glicerol utilizando cepas de e. Coli modificadas genéticamente

Los ácidos dicarboxílicos C4 como el ácido succínico y el ácido málico son productos con alto potencial industrial al ser precursores de diferentes químicos de interés en la industria farmacéutica, alimentaria y agrícola. Estos compuestos pueden ser producidos a través de procesos de fermentación microbiana por bacterias como Actinobacillus succinogenes, Mannheimia succiniciproducens y Anaerobiospirillum succiniciproducens para el caso del ácido succínico y por hongos como Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Penicillium oxalicum y la levadura Zygosaccharomyces rouxii para el caso del ácido málico. Sin embargo, con el advenimiento de las tecnologías del ADN recombinante y a través de la ingeniería metabólica es posible direccionar la producción de este metabolito modificando genéticamente la bacteria Escherichia coli, ya que, a diferencia de los productores naturales, esta bacteria es muy versátil metabólicamente, posee bajos requerimientos nutricionales y es de rápido crecimiento. Por otro lado, se ha estudiado el uso de diferentes sustratos para la producción de ácido succínico y ácido málico; no obstante, en miras de aprovechar los residuos industriales y con el propósito de promover una producción sostenible, se está utilizando el glicerol, un subproducto de la industria del biodiesel del cual hay una alta oferta. Este compuesto posee un alto grado de reducción de los átomos de carbono lo que permite la producción de productos químicos reducidos con mayores rendimientos que con el uso de carbohidratos. Sin embargo, a pesar de los altos rendimientos de ácido succínico y ácido málico obtenidos en condiciones anaerobias, el proceso se dificulta y retarda debido a inconvenientes en el mantenimiento del equilibrio de óxido-reducción, así como también por el bajo crecimiento en estas condiciones y la baja velocidad de consumo del sustrato. Por ello, se están desarrollando diversas estrategias para mejorar la producción en condiciones de aerobiosis haciendo uso de la ingeniería metabólica, lo cual ha permitido modificar el metabolismo del E. coli a través de la sobreexpresión y/o mutación de genes y así direccionarlo hacia la síntesis de estos compuestos; sin embargo, aún los rendimientos continúan siendo bajos. El objetivo del presente trabajo fue optimizar la producción de ácido succínico y ácido málico a partir de glicerol en condiciones de aerobiosis utilizando una cepa de E. coli modificada genéticamente. Para ello, en primera medida, se analizaron las rutas metabólicas implicadas en el metabolismo de estos compuestos utilizando la base de datos EcoCyc lo que permitió identificar fugas de carbono, definir estrategias de ingeniería metabólica e identificar las enzimas clave implicadas en estas estrategias, estas últimas fueron caracterizadas con el propósito de obtener información que pueda ser relevante para la optimización de la producción de estos compuestos. Posteriormente, se realizó la modificación genética de E. coli, construyéndose un mutante base con la mutación del gen de la subunidad A de la enzima succinato deshidrogenasa (sdhA), con el propósito de linealizar el ciclo de los ácidos tricarboxilicos (TCA) y con las mutaciones de los genes de las enzimas de las vías de síntesis de ácido acético como la acetato quinasa y la fosfato acetiltransferasa (ack-pta) y la piruvato oxidasa (pox) para evitar pérdidas de carbono. A partir de este mutante se desarrollaron dos estrategias en paralelo que fueron la mutación del gen del represor de la vía del glioxilato (iclR) y la mutación del gen de la enzima 6 fosfogluconato deshidrogenasa (gnd) que participa en la rama oxidativa de la vía de las pentosas fosfato, ya que trabajos anteriores han demostrado que por sí sola esta mutación aumenta las cantidades de ácido succínico, pero en condiciones de anaerobiosis. Es así como se construyeron tres mutantes: M4: (ΔsdhAΔack-ptaΔpox), M4-ΔiclR (ΔsdhAΔack-ptaΔpoxΔiclR) y M4-Δgnd (ΔsdhAΔack-ptaΔpoxΔgnd) los cuales fueron analizados con dos herramientas de metabolómica: la espectroscopia de análisis de infrarrojo con transformada de Fourier (FT-IR) y cromatografía de gases acoplada a masas (GC-MS). Adicionalmente, se analizó la sobrexpresión de las enzimas anapleróticas y la malato deshidrogenasa bajo el promotor inducible pBAD, utilizando inicialmente una baja inducción (L-arabinosa 0,0002 %), como ensayo preliminar y posteriormente, una alta concentración (L-arabinosa 0,02 %) y a partir de este screening se seleccionaron dos cepas, una productora de ácido málico y la otra productora de ácido succínico. En cada una de estas cepas se realizó un diseño experimental Plackett-Burman para determinar qué componentes del medio M9 afectan a la producción de ambos metabolitos. Posteriormente, se procedió a estudiar el efecto de los factores más influyentes en ambos mutantes a partir del cual se optimizó el medio M9 para la producción de ácido málico, pero a raíz de que, con la evaluación de estos factores, las cantidades de ácido succínico aun no mejoraron, se realizó un diseño experimental para la optimización del medio de cultivo M9 para la mejorara de la producción de este compuesto. El medio optimizado fue entonces evaluado en cepas con la mutación de genes relacionados con la síntesis de ácidos grasos y el mutante M4-Δgnd con la sobrexpresión de la Ppc. Los resultados obtenidos en el presente trabajo mostraron inicialmente que las vías asociadas directamente a la producción de ácido málico y ácido succínico fueron el TCA, la glicolisis y la vía del glioxilato; siendo los metabolitos más importantes: el piruvato, el acetil-CoA, la D-glucopiranosa 6-fosfato y el D-gliceraldehido 3-fosfato, por ser puntos de fuga de carbono a través de vías alternas como la vía de síntesis de ácido acético, la vía de síntesis de ácidos grasos y la vía de las pentosas fosfato. Se seleccionaron y caracterizaron inicialmente 57 enzimas dentro de estas rutas incluyendo además las de la asimilación del glicerol y a partir de estas, se eligieron 14 enzimas asociadas a las estrategias para la mejora de la síntesis de ambos compuestos, cuya característica más importante reside en un amplio rango de pH. La linealización del TCA con la mutación del gen sdhA mostró una acumulación de ácido succínico, mayor que con la mutación del operón completo sdhCDAB y las subsiguientes mutaciones de las vías de síntesis ácido acético permitió la reducción de la producción de ácido acético con el consecuente aumento de la producción de ácido succínico en alrededor de un 80 %. Las mutaciones de los genes del represor transcripcional de unión al ADN de la vía del glioxilato (iclR) y gnd favorecieron el aumento de la producción de ácido succínico en el mutante M4, el análisis metabolómico mostró una disminución de la mayoría de los metabolitos de la glicolisis con estas dos mutaciones y, asimismo, se evidencia con la mutación de iclR una acumulación de los metabolitos manitol, trehalosa y Fructosa 1,6-bifosfato (FBF) y con la mutación de gnd una regulación negativa del metabolismo del nitrógeno. A continuación, se realizó sobre este mutante un screening de sobreexpresión con las enzimas anapleróticas fosfoenolpiruvato carboxilasa (Ppc), fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (Pck) y las enzimas málicas (MaeA y MaeB), además de la malato deshidrogenasa (Mdh). Con el ensayo preliminar a baja concentración de L-arabinosa, solo se observó un ligero aumento en la producción de ácido succínico y de ácido málico al sobreexpresar la Mdh. Sin embargo, cuando se utilizó una alta concentración de inductor, la sobreexpresión de la Ppc dio lugar a un aumento considerable de ácido succínico en la cepa M4, mientras que la sobreexpresión de la Pck provocó un considerable aumento en la producción de ácido málico tanto en el mutante M4 como en el M4-ΔiclR, siendo un poco mayor en el caso de esta última cepa. Del estudio mediante diseño experimental Plackett-Burman, se concluyó que el principal factor que afecta a la producción de ambos compuestos fue la concentración del inductor de la expresión (L-arabinosa) y, adicionalmente, para el caso del mutante M4-ΔiclR/pBAD-pck fueron influyentes la concentración de carbonato de sodio, bajo la forma en el medio de cultivo de hidrogeno carbonato de sodio y la de glicerol; mientras que para el mutante M4/pBAD-ppc fueron además del glicerol, la concentración de NH4Cl, MgSO4 y la cantidad de los elementos traza. Pruebas adicionales determinaron que para la producción de ácido málico en el mutante M4-ΔiclR/pBAD-pck la concentración de carbonato ideal fue de 4 g/L, lo que permitió un consumo completo de una concentración inicial de 10 g/L de glicerol. Sin embargo, en ambos mutantes a partir de 10 g/L de glicerol este no alcanza a consumirse. Por ello, el análisis de ajuste a modelos de crecimiento microbiano mostró en estos mutantes un mejor ajuste al modelo logístico que al modelo de Monod. Por otro lado, el NH4Cl fue limitante en concentraciones de hasta 0,5 g/L y fue inhibitorio a una concentración de 3,5 g/L en el mutante M4-ΔiclR/pBAD-pck. El medio optimizado fue con una concentración de 0,87 g/L de NH4Cl, 2 mL de MgSO4 1 M y 61 µL (2,3 g/L FeCl3·6H2O, 0,039 g/L CuSO4·5H2O, 0,049 g/L ZnSO4·7H2O, 0,32 g/L MnCl2-7H2O, 0,129 g/L CoCl2·6H2O, 0,037 g/L (NH3)6Mo7O24·4H2O and 0,25 g/L H3BO3) de elementos trazas. El uso de este medio con los mutantes de la síntesis de ácidos grasos permitió un ligero aumento del rendimiento del ácido succínico con la mutación del gen FabF y un aumento de la producción de ácido málico con la mutación del gen FadR. En resumen, la producción volumétrica de ácido málico alcanzada con las condiciones optimizadas de 4 g/L de carbonato y 10 g/L de glicerol fue de 5,1 g/L con el mutante M4-ΔiclR/pBAD-pck y, por su parte, con el medio optimizado para la producción de ácido succínico se obtuvieron 3,51 y 4,40 g/L de ácido succínico con los mutantes M4/pBAD-ppc y M4-Δgnd/pBAD-ppc, respectivamente. Estos hallazgos reflejan que el direccionamiento del metabolismo de la bacteria E. coli mediante herramientas de ingeniería genética, sumado a la optimización de las condiciones de cultivo permitieron el mejoramiento de la producción volumétrica de ambos metabolitos a partir del uso de glicerol en condiciones de aerobiosis, aun cuando se hace necesario mejorar la velocidad de producción, especialmente la de ácido succínico; para ello, deberían ser implementadas otras herramientas centradas en el mejoramiento del consumo de sustrato y la exportación de estos compuestos C4

In silico guided metabolic engineering of Aspergillus niger for sustainable organic acid production

The filamentous fungus Aspergillus niger is a common mould, and has risen to worldwide impact through industrial fermentation that is the chief source of the world’s citric acid. As well as the high market value chemical citric acid, A. niger fermentation supplies an array of enzymes of biotechnological importance. Industrial fermentation processes continue to be dependent on sucrose-based feed-stocks, and rising energy costs and tightening resources are prompting a shift to more sustainable methods. A. niger fermentation is also a promising platform for the sustainable production of many chemicals that could help solve coming world challenges. A. niger has within it the metabolic potential to achieve these goals, but these can only be realised with more efficient strain development techniques. This project built on the recent systems biology studies of A. niger to create in silico tools that guide rational engineering strategies. A dynamic metabolic model, relevant to the industrial setting of batch fermentation, of A. niger organic acid production was developed and shown to accurately capture physiological characteristics. An empirical characterisation of organic acid fermentation by the wild-type ATCC1015 strain was used to inform the model, and revealed new findings. The onset of citric acid production coincided with a shift to phosphate-limited growth, caused by a rapid phosphate uptake and storage of phosphate as polyphosphate. The role of polyphosphate in organic acid fermentation has not previously been described. The dynamic model was probed by the engineering of seven targets. To better inform further engineering, the genome-scale metabolic network of A. niger was updated and made specific to the ATCC1015 strain, the parent of citric acid producing strains. Finally, a genetic algorithm was developed for in silico evolution of A. niger organic acid production, and applied to suggest strategies for optimising the production of different organic acids

バイオレメディエーションとバイオエネルギー生産のための廃棄型下水余剰汚泥の有効利用

Activated sludge system is widely used in treating wastewater. However, this system creates a lot of waste activated sludge (WAS). The abundance of WAS creates serious problem to municipalities and industries in term of treatment cost and waste management. Hence, the purpose of my Ph. D. study is to seek an appropriate means for WAS management. Here, four approaches for utilizing WAS effectively are investigated; 1) WAS reduction at low temperature by using low temperature tolerant bacteria, 2) biohydrogen production from WAS and oil palm frond (OPF) juice by engineered Escherichia coli strain, 3) CO2 sequestration using microbes present in WAS, and 4) methane energy production from seawater by microbes in WAS. As a result, 1) WAS reduction at a low temperature was improved by Pseudomonas sp. VNT and Aeromonas sp. VNT which were isolated from WAS itself under a low temperature, 2) WAS was found as an effective substrate as well as an additional nutrient source when added to oil palm frond (OPF) juice for elevated biohydrogen production by an engineered Escherichia coli strain, 3) enrichment of WAS, by which active methanogen was dominated, showed great potential to sequester atmospheric CO2 for methane production, and 4) active methanogens in WAS shows the potential to use carbonate sources in seawater as well as to tolerate high salinity of seawater during methane production.Taken together, the findings in this study are indeed important as a means for effectively utilizing WAS which burdens the environment and to solve the high treatment cost of WAS. Throughout this study, the volume of WAS can be controlled by a practical way using bioremediation and bioenergy production.九州工業大学博士学位論文 学位記番号:生工博甲第233号 学位授与年月日:平成27年3月25日1. Introduction and literature review|2. General materials and methods|3. Enhanced reduction of waste activated sludge at a low temperature by locally isolated strains pseudomonas sp. VNT and Aeromonas sp. VNT|4. Biohydrogen production from oil palm frond juice and waste activated sludge by a metabolically engineered Escherichia coli|5. CO2 sequestration by methanogens in activated sludge for methane production|6. Methane production from seawater by methanogens in waste activated sludge|7. Concluding remarks and suggestions for future research九州工業大学平成26年