VarSight: prioritizing clinically reported variants with binary classification algorithms.

BackgroundWhen applying genomic medicine to a rare disease patient, the primary goal is to identify one or more genomic variants that may explain the patient's phenotypes. Typically, this is done through annotation, filtering, and then prioritization of variants for manual curation. However, prioritization of variants in rare disease patients remains a challenging task due to the high degree of variability in phenotype presentation and molecular source of disease. Thus, methods that can identify and/or prioritize variants to be clinically reported in the presence of such variability are of critical importance.MethodsWe tested the application of classification algorithms that ingest variant annotations along with phenotype information for predicting whether a variant will ultimately be clinically reported and returned to a patient. To test the classifiers, we performed a retrospective study on variants that were clinically reported to 237 patients in the Undiagnosed Diseases Network.ResultsWe treated the classifiers as variant prioritization systems and compared them to four variant prioritization algorithms and two single-measure controls. We showed that the trained classifiers outperformed all other tested methods with the best classifiers ranking 72% of all reported variants and 94% of reported pathogenic variants in the top 20.ConclusionsWe demonstrated how freely available binary classification algorithms can be used to prioritize variants even in the presence of real-world variability. Furthermore, these classifiers outperformed all other tested methods, suggesting that they may be well suited for working with real rare disease patient datasets

Dynamic scaffolds for neuronal signaling: in silico analysis of the TANC protein family.

Fiesta de Tosantos (1101001

Identification of a candidate sex determination gene in Culaea inconstans suggests convergent recruitment of an Amh duplicate in two lineages of stickleback.

Sex chromosomes vary greatly in their age and levels of differentiation across the tree of life. This variation is largely due to the rates of sex chromosome turnover in different lineages; however, we still lack an explanation for why sex chromosomes are so conserved in some lineages (e.g. mammals, birds) but so labile in others (e.g. teleosts, amphibians). To identify general mechanisms driving transitions in sex determination systems or forces which favour their conservation, we first require empirical data on sex chromosome systems from multiple lineages. Stickleback fishes are a valuable model lineage for the study of sex chromosome evolution due to variation in sex chromosome systems between closely-related species. Here, we identify the sex chromosome and a strong candidate for the master sex determination gene in the brook stickleback, Culaea inconstans. Using whole-genome sequencing of wild-caught samples and a lab cross, we identify AmhY, a male specific duplication of the gene Amh, as the candidate master sex determination gene. AmhY resides on Chromosome 20 in C. inconstans and is likely a recent duplication, as both AmhY and the sex-linked region of Chromosome 20 show little sequence divergence. Importantly, this duplicate AmhY represents the second independent duplication and recruitment of Amh as the sex determination gene in stickleback and the eighth example known across teleosts. We discuss this convergence in the context of sex chromosome turnovers and the role that the Amh/AmhrII pathway, which is crucial for sex determination, may play in the evolution of sex chromosomes in teleosts

Conflito de interpretação e desequilíbrio de ligação em variantes en-contradas nos genes BRCA1 e BRCA2

The aim of this study was to analyze BRCA1 and BRCA2 genetic variants, in order to compare in silico predictions by different tools. In addition, we investigated the disequilibrium of linkage (DL) in the genetic variants observed in the patients with cancer. ClinVar, SIFT, PolyPhen2, VEP, PROVEAN and Fathmm-MKL were performed for in silico analysis. The investigation of the disequilibrium of linkage was performed with Linkage Disequilibrium Calculator software. We observed 60 different variants and the most common was T>C variant. The programs SIFT, PolyPhen2 and PROVEAN showed similarities in the degree of pathogenicity performed. VEP, Fathmm-MKL and ClinVar predicted the majority of variants analyzed. Sixteen genetic variants, manual selected, were analyzed as DL and 33 disequilibrium of linkage were confirmed in pairs, then, were joined in 5 groups. Genetic variants observed in our sample are usually observed in others populations as in South America, in South Asia and East Asia, Africa, and Europe. Correct association of phenotype/genotype and epidemiological information can provide important epidemiological information, such as prognostic and treatment aspects, seeking a better quality of life understanding of diseases and genetic evolution factors associated.Este estudo teve como objetivo analisar variantes encontradas nos genes BRCA1 e BRCA2 com intuito de comparar as diferentes predições in silico de ferramentas distintas, além de investigar variantes candidatas à desequilíbrio de ligação (LD). Para as análises in silico foram utilizados os programas ClinVar, SIFT, PolyPhen2, VEP, PROVEAN e Fathmm-MKL. A investigação da LD foi feita pelo programa Linkage Disequilibrium Calculator. Observou-se 60 variantes distintas, predominando as trocas nucleotídicas de T>C. Os programas SIFT, PolyPhen2 e PROVEAN apresentaram semelhanças quanto ao grau de patogenicidade determinado em cada variante. O VEP, o Fathmm-MKL e o ClinVar apresentaram resultado de predição para maior parte das variantes analisadas. A partir das 16 variantes com suspeita de LD, selecionadas manualmente, foram confirmadas 33 LD quando analisadas aos pares. A combinação das variantes em LD resultou na categorização de 5 grupos. As variantes genéticas observadas em nossa amostra são encontradas com maior frequência na América, Sul da Ásia e Leste Asiático, na África e na Europa. A associação do fenótipo do paciente com seu genótipo e as informações epidemiológicas das variantes encontradas no câncer, assim como informações sobre o prognóstico e tratamento associados, podem proporcionar melhor qualidade de vida, entendimento das doenças e de fatores evolutivos associados

Comparative genomics shows differences in the electron transport and carbon metabolic pathways of Mycobacterium africanum relative to Mycobacterium tuberculosis and suggests an adaptation to low oxygen tension

YesThe geographically restricted Mycobacterium africanum lineages (MAF) are primarily found in West Africa, where they account for a significant proportion of tuberculosis. Despite this phenomenon, little is known about the co-evolution of these ancient lineages with West Africans. MAF and M. tuberculosis sensu stricto lineages (MTB) differ in their clinical, in vitro and in vivo characteristics for reasons not fully understood. Therefore, we compared genomes of 289 MAF and 205 MTB clinical isolates from the 6 main human-adapted M. tuberculosis complex lineages, for mutations in their Electron Transport Chain and Central Carbon Metabolic pathway in order to explain these metabolic differences. Furthermore, we determined, in silico, whether each mutation could affect the function of genes encoding enzymes in these pathways. We found more mutations with the potential to affect enzymes in these pathways in MAF lineages compared to MTB lineages. We also found that similar mutations occurred in these pathways between MAF and some MTB lineages. Generally, our findings show further differences between MAF and MTB lineages that may have contributed to the MAF clinical and growth phenotype and indicate potential adaptation of MAF lineages to a distinct ecological niche, which we suggest includes areas characterized by low oxygen tension.European Research CouncilINTERRUPTB starting grant nr. 311725 (to BdJ, FG, CM, LR, BO, MA) and The UK Medical Research Council and the European & Developing Countries Clinical Trials Partnership (EDCTP) Grant No. CB. 2007. 41700.007.Research Development Fund Publication Prize Award winner, January 2020

Clinical and molecular characterization of Portuguese patients with a clinical diagnosis of MODY

Dissertação de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentado à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2017.Defendida e aprovada em 7 de novembro de 2017.Trabalho de investigação realizado no Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças Não Transmissíveis do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, Grupo de Investigação Cardiovascular (Setembro 2015 – Setembro 2016).Orientadora Mafalda Bourbon - Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças Não Transmissíveis do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge.A diabetes mellitus, ou simplesmente diabetes, pode ser definida como um conjunto complexo de perturbações crónicas de cariz metabólico caracterizadas por hiperglicémia. A diabetes tipo MODY, do inglês Maturity-onset diabetes of the young, é uma forma monogénica de diabetes. Inicialmente descrita em 1974 por Tattersall, a diabetes tipo MODY engloba um grupo de fenótipos heterogéneos, clinica e geneticamente, caracterizados por alterações no funcionamento normal das células beta do pâncreas e por um padrão de hereditariedade autossómico dominante. De uma forma geral, a diabetes tipo MODY tem um perfil não-insulino dependente e manifesta-se em crianças e indivíduos jovens, sendo tipicamente diagnosticada antes dos 25 anos. A diabetes tipo MODY aparenta ser rara, estimando-se que seja responsável por 0,6-2% dos casos de diabetes na Europa. No entanto, é frequente esta forma de diabetes ser equivocamente diagnosticada como diabetes tipo 1 ou tipo 2, pelo que a sua prevalência real deverá ser superior. Um dos grandes trunfos no combate a este subdiagnóstico da diabetes tipo MODY são os testes genéticos. Desde a década de 1990, foram 13 os genes associados à MODY. Mutações em heterozigotia nos genes GCK e HNF1A são as causas mais frequentes de diabetes tipo MODY, correspondendo a cerca de 70% dos casos. Logo a seguir estão as mutações em heterozigotia nos genes HNF4A (hepatocyte nuclear factor 4 alpha) e HNF1B, que correspondem a cerca de 15% dos casos. O gene GCK, localizado no cromossoma 7 (7p13), codifica o enzima glicocinase (glucokinase - GCK), também conhecido como hexocinase IV. Este enzima monomérico possui três isoformas - a isoforma 1, presente nas células beta, e as 2 e 3, presentes no fígado - e, no interior das células, atua como um sensor do nível de glicose. Nos hepatócitos, este enzima intervém no desencadear da glicólise e glicogénese, enquanto facilita a exocitose de insulina nas células beta. A diabetes tipo MODY, subtipo GCK, resulta de mutações de perda de função em heterozigotia no gene GCK, diminuindo a atividade do enzima, e caracteriza-se por uma hiperglicémia moderada, assintomática e não progressiva que se manifesta desde o nascimento. Estas mutações acabam por diminuir a quantidade de glicogénio sintetizado e impedem a normal libertação de insulina, ao aumentar a concentração mínima de glicose necessária à sua secreção. O gene HNF1A, localizado no cromossoma 12 (12q24.31), codifica um fator de transcrição (hepatocyte nuclear factor 1 alpha - HNF1A) homodimérico. Este fator de transcrição possui três isoformas, A, B e C. As três estão presentes no fígado, rins, pâncreas e intestinos mas a primeira predomina no fígado, rins e pâncreas fetal, enquanto a isoforma B predomina no pâncreas adulto. O HNF1A integra uma complexa rede de fatores de transcrição, desempenhando um papel regulador na expressão de diversos genes durante o desenvolvimento embrionário. No fígado, o HNF1A regula a expressão de vários genes hepáticos, como o gene que codifica para a albumina. Nas células beta, intervém na expressão de insulina e na proliferação e morte celular. A diabetes tipo MODY, subtipo HNF1A, resulta de mutações em heterozigotia no gene HNF1A. Estas mutações podem ter diversos efeitos, reduzindo a secreção de insulina em resposta a glicose e aminoácidos, e alterando a expressão de genes envolvidos no transporte (GLUT2) e metabolismo de glicose, afetando processos como a glicólise, gluconeogénese e derivação de aminoácidos para o ciclo de Krebs. O subtipo HNF1A está associado a defeitos na proliferação das células beta e caracteriza-se por uma incapacidade progressiva na secreção de insulina, que não acompanha o aumento de glicose em circulação, dando origem a uma hiperglicémia mais grave que o subtipo GCK. O gene HNF1B, localizado no cromossoma 17 (17q12), codifica um fator de transcrição (hepatocyte nuclear factor 1beta - HNF1B) que atua como homodímero ou heterodímero, com HNF1A. O gene HNF1B produz três isoformas - 1, 2 e 3 - e é expresso no timo, pulmão, rim, fígado, pâncreas, estômago, intestino e trato genital. Este fator de transcrição, que integra a mesma rede regulatória que HNF1A, actua no desenvolvimento embrionário do pâncreas e do rim. A diabetes tipo MODY, subtipo HNF1B, resulta de mutações em heterozigotia no gene HNF1B e em cerca de 50% dos casos caracteriza-se por uma combinação de resistência à insulina e disfunção das células beta, exibindo, à semelhança do subtipo HNF1A, uma incapacidade na secreção de insulina em resposta a concentrações crescentes de glicose. Mutações neste gene podem também resultar em anomalias extra pancreáticas e afetar tecidos como o trato genital ou o fígado, sendo quistos renais o fenómeno mais observado. Neste estudo, foram recolhidas informações clínicas acerca de 39 indivíduos, 24 probandos e 15 familiares, através de questionários enviados por vários médicos de diferentes hospitais portugueses. Com base nestas informações, como glicémia em jejum, prova de tolerância à glicose oral e HbA1c, e no diagnóstico clínico de diabetes tipo MODY, foram-nos referenciados indivíduos com uma história familiar de diabetes que evidencie um padrão hereditário dominante; sem autoanticorpos pancreáticos; com início de sintomas antes dos 25 anos; e índice de massa corporal maioritariamente normal. Estes 24 probandos foram estudados por sequenciação de Sanger para os genes GCK e HNF1A, tendo sido também efetuada a pesquisa de inserções e deleções através da técnica MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Entre substituições pontuais e pequenas deleções, a sequenciação de Sanger detetou 46 variantes genéticas, 19 no gene GCK e 27 no gene HNF1A. Entre estas, seis podem ser classificadas como patogénicas ou provavelmente patogénicas, sendo quatro no gene GCK e duas no gene HNF1A. As variantes patogénicas ou provavelmente patogénicas detetadas no gene GCK foram c.364C>T (p.(Leu122Phe)), uma alteração missense no exão 4 que cosegrega com diabetes e está associada à diabetes tipo MODY; c.579+1_579+33del, uma deleção de 33 pares de base no intrão 5 que elimina um local de splicing e também está associada à diabetes tipo MODY; c.766G>A (p.Glu256Lys), uma alteração missense no exão 7 que induz alterações conformacionais no enzima GCK, reduzindo a sua capacidade de ligação à glicose e subsequente atividade catalítica; e, finalmente, c.1268T>A (p.(Phe423Tyr)), uma alteração missense no exão 10 que cosegrega com diabetes e está associada à diabetes tipo MODY. Estas variantes foram encontradas num total de quatro probandos e cinco familiares. No gene HNF1A, as variantes patogénicas detetadas foram c.814C>T (p.(Arg272Cys)), uma alteração missense no exão 4 que cosegrega com diabetes e impede o fator de transcrição HNF1A de se ligar ao DNA, perdendo assim a sua atividade reguladora na expressão genética; e c.872del (p.(Pro291Glnfs*51)), uma deleção também localizada no exão 4 que provoca uma alteração na grelha de leitura, cosegrega com diabetes e possivelmente resulta de um fenómeno de splippage aquando da replicação de DNA, prevendo-se que resulte numa proteína truncada. Estas variantes foram encontradas num total de três probandos e três familiares. A técnica MLPA foi aplicada na investigação de inserções e deleções em 17 probandos. Três destes probandos geraram resultados sem qualidade, sendo necessárias novas amostras para eventual repetição. Noutros 11 nenhuma inserção ou deleção foi detetada. Nos restantes três probandos foram detetadas duas deleções patogénicas: deleção em heterozigotia dos exões 5 a 8 do gene GCK (c.484-?_1019+?del) num probando; e deleção em heterozigotia do gene HNF1B (c.1-?_1674+?del) em dois probandos. A deleção no gene GCK deverá produzir uma proteína não funcional para gerar o fenótipo MODY, subtipo GCK. No entanto, não foi encontrada qualquer informação sobre esta deleção ou o seu efeito na proteína, pelo que poderemos estar na presença de uma nova mutação. Quanto à deleção do gene HNF1B, estas são frequentes e existem várias fontes que apontam deleções completas do gene como patogénicas, que muitas vezes incluem outros genes na mesma região (17q12). Um dos probandos aparenta não ter história familiar de diabetes e, sendo mutações de novo frequentes, é possível que estejamos na presença de uma. No entanto, não haviam amostras de familiares para fazer estudos de cosegregação nestes dois probandos. A hemizigotia provocada por esta deleção deve resultar em MODY, subtipo HNF1B, por haploinsuficiência. Nenhum destes dois probandos aparenta ter anomalias renais. No total, entre 24 probandos, este estudo identificou 10 indivíduos com MODY, cinco do subtipo GCK, três do subtipo HNF1A e dois do subtipo HNF1B, realçando assim a importância de um diagnóstico correto, com recurso a ferramentas de genética molecular, uma vez que estes indivíduos tinham diagnósticos de diabetes tipo 1 ou tipo 2. Dos restantes 14 probandos sem qualquer variante patogénica/provavelmente patogénica, foi detetada pelo menos uma variante associada a diabetes tipo 2. A utilização destas técnicas no âmbito do diagnóstico genético permite estabelecer o diagnóstico correcto, com implicações para a terapêutica a administrar e qualidade de vida dos utentes dos serviços de saúde.Initially described by Tattersall in 1974, maturity-onset diabetes of the young (MODY) is a form of early onset monogenic diabetes characterized by clinically heterogeneous phenotypes with autosomal dominant inheritance that generally result in β-cell dysfunction. Often misdiagnosed, MODY accounts for 0.6-2% of diabetes cases in Europe and 13 genes have been implicated in this form of diabetes, with heterozygous mutations in GCK and HNF1A being the most common etiologies, followed by heterozygous mutations in HNF4A and HNF1B. Glucokinase (GCK) is a monomeric enzyme that acts as a cellular glucose sensor, playing a role in glycogenesis and glycolysis in hepatocytes, and in insulin release in β-cells. Heterozygous loss-of-function mutations in GCK decrease enzymatic activity and result in GCK-MODY, characterized by asymptomatic mild stable hyperglycemia present from birth. HNF1A-MODY is associated with impaired β-cell proliferation and is characterized by a progressive insulin secretory defect, resulting in a more severe hyperglycemia. This form of MODY is caused by heterozygous mutations in HNF1A, a gene that codes hepatocyte nuclear factor 1 alpha, a homodimeric transcription factor that regulates gene expression in embryonic development and plays a role in insulin expression and β-cell proliferation and death. Hepatocyte nuclear factor 1 beta (HNF1B) is also a transcription factor that acts as a homodimer, or a heterodimer with HNF1A. HNF1B is part of the same regulatory network as HNF1A and regulates embryonic pancreatic development, also playing a role in nephron development. Heterozygous HNF1B mutations result in HNF1B-MODY, characterized by a combination of β-cell dysfunction and insulin resistance in approximately 50% of mutation carriers. Like in HNF1A-MODY, insulin secretion is compromised as glucose concentrations rise. Renal cysts are common. Clinical data on 24 probands and 15 relatives was collected through questionnaires sent by physicians. Subjects with a clinical diagnosis of MODY - family history of diabetes consistent with dominant inheritance pattern, no pancreatic autoantibodies, onset before 25 years of age and typically lean - were referred to this study by physicians for genetic screening via Sanger sequencing (for GCK and HNF1A) and Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). Between point substitutions and small deletions, Sanger sequencing detected 46 variants, 19 in GCK and 27 in HNF1A. Six of these were pathogenic or likely pathogenic, four in GCK and two in HNF1A. GCK pathogenic or likely pathogenic variants were c.364C>T (p.(Leu122Phe)), in exon 4; c.579+1_579+33del, in intron 5, abolishing the donor splice site; c.766G>A (p.Glu256Lys), in exon 7, which induces conformational changes, decreasing glucose binding and catalytic activity; and c.1268T>A (p.(Phe423Tyr)), in exon 10. These variants were detected in four probands and five relatives. HNF1A pathogenic variants were c.814C>T (p.(Arg272Cys)), which renders HNF1A unable to bind DNA and exert its transactivating activity; and c.872del (p.(Pro291Glnfs*51)), predicted to produce a truncated protein and likely the result of replication slippage. Both variants are located in exon 4. These variants were detected in three probands and three relatives. MLPA analysis detected two pathogenic deletions: a heterozygous GCK exons 5 through 8 deletion (c.484-?_1019+?del) in one proband; and a heterozygous HNF1B deletion (c.1-?_1674+?del) in two probands. The seemingly unreported heterozygous GCK exons 5 through 8 deletion, which should result in a null variant that decreases overall enzymatic activity, could be a novel mutation. Heterozygous HNF1B deletions should result in HNF1B-MODY via haploinsufficiency. One proband had no apparent family history but de novo mutations are frequent. Both probands had no apparent renal abnormalities. Among 24 probands, this study identified a total of 10 MODY cases, with five being GCK-MODY, three being HNF1A-MODY and two being HNF1B-MODY. Of the remaining 14 probands without any detected pathogenic/likely pathogenic variants, 11 had at least one type 2 diabetes associated variant. Hence, this study highlights the importance of genetic diagnosis in patients with diabetic phenotypes consistent with MODY, as a correct diagnosis impacts patient treatment and quality of life.N/

Identifikation genetischer Marker bei Kindern mit VACTERL-Assoziation

The VACTERL association is a rare malformation complex consisting of vertebral defects, anorectal malformation, cardiovascular defects, tracheoesophageal fistulae with esophageal atresia, renal malformation, and limb anomalies. As far as currently known, VACTERL is based on a multifactorial pathogenesis including genomic alterations. The aim of this study was to improve our understanding of the genetic processes involved in the development of VACTERL. For this purpose, the genetic background was investigated with a focus on cardiovascular development, signalling pathways and cilia function. The study was designed as a genetic association study. Whole-exome sequencing (WES) followed by functional enrichment analysis was performed in 21 patients with VACTERL or VACTERL-like phenotype. To investigate the inheritance, the parents were examined by WES respectively Sanger sequencing. In this study a genetic background for vascular disorders was identified in patients with VACTERL. This supports the theory, that congenital vascular defects may indicate other malformations in the spectrum of the VACTERL association. Additionally, this study indicates three more damage mechanisms for VACTERL. These are a general disruption of Shh- and Wnt signalling pathway by changes in signalling pathway activity, a structural cilia defect and a disruption of the ciliary signal transduction. Our work unites these damage mechanisms in different, partly hereditary combinations and thus offers an explanation for the heterogeneity of the VACTERL association. Follow-up studies in cell and animal models should further address these combined damage mechanisms

Fenilcetonuria en canarias. Estudio molecular del gen PAH en pacientes con fenilcetonuria e hiperfenilalaninemias de la comunidad canaria

Las hiperfenilalaninemias son enfermedades genéticas, de herencia autosómica recesiva, que afectan al gen codificante de la enzima fenilalanina hidroxilasa o a las enzimas responsables de la síntesis y regeneración del cofactor de la PAH, la tetrahidrobiopterina, indispensables para convertir la L-Phe en L-Tyr. Dicha enfermedad incluye desde fenotipos benignos que no requieren de tratamiento (hiperfenilalaninemias benignas) a otros más severos (retraso mental severo, microcefalia, epilepsia, rasgos psicóticos, etc.) englobados en el espectro fenotípico de la denominada fenilcetonuria. Actualmente, debido a la dificultad de mantener una dieta estricta en cantidades de Phe existe en el mercado, y se está trabajando en nuevos, fármacos que ayudan a disminuir la Phe en plasma sin necesidad de restringir su ingesta, pudiendo así liberalizar la dieta. Para recibir tratamiento con BH4, así como para el diagnóstico, categorización y establecimiento de la relación entre genotipo y fenotipo del paciente como parte del pronóstico del mismo y consejo genético, es necesario realizar un estudio molecular de las mutaciones en paciente y familiares directos (portadores sanos). En nuestra comunidad autónoma, sólo cuatro pacientes disponían del estudio mutacional (realizado en laboratorios nacionales), de un total de 45 casos. Esta carencia y su fuerte repercusión presente y futura en los pacientes PKU ha llevado a realizar el primer estudio de mutaciones en el gen PAH en Canarias, con los objetivos de describir la epidemiología en nuestra región y su relación geno-fenotípica, así como valorar el tratamiento con BH4. Las frecuencias mutacionales encontradas difieren de las encontradas en trabajos previos de la península ibérica y área mediterránea, siendo nuestra mutación más prevalente (p.R408W) la más frecuentemente hallada a nivel mundial. Las formas mayoritarias son las formas de fenotipo benigno, y se ha establecido un protocolo diagnóstico molecular para nuestra comunidad, así como hallado una nueva mutación no descrita previamente (p.P409L). Las bases de datos mutacionales y clínicas de PKU ofrecen una buena predicción de los efectos sobre el paciente. Es fundamental este tipo de estudios en enfermedades genéticas desde el nacimiento y diagnóstico de los pacientes, sobre todo en aquellas cuyo conocimiento puede suponer cambios beneficiosos en el tratamiento de los pacientes