Empirical Performance of Tree-Based Inference of Phylogenetic Networks

Phylogenetic networks extend the phylogenetic tree structure and allow for modeling vertical and horizontal evolution in a single framework. Statistical inference of phylogenetic networks is prohibitive and currently limited to small networks. An approach that could significantly improve phylogenetic network space exploration is based on first inferring an evolutionary tree of the species under consideration, and then augmenting the tree into a network by adding a set of "horizontal" edges to better fit the data. In this paper, we study the performance of such an approach on networks generated under a birth-hybridization model and explore its feasibility as an alternative to approaches that search the phylogenetic network space directly (without relying on a fixed underlying tree). We find that the concatenation method does poorly at obtaining a "backbone" tree that could be augmented into the correct network, whereas the popular species tree inference method ASTRAL does significantly better at such a task. We then evaluated the tree-to-network augmentation phase under the minimizing deep coalescence and pseudo-likelihood criteria. We find that even though this is a much faster approach than the direct search of the network space, the accuracy is much poorer, even when the backbone tree is a good starting tree. Our results show that tree-based inference of phylogenetic networks could yield very poor results. As exploration of the network space directly in search of maximum likelihood estimates or a representative sample of the posterior is very expensive, significant improvements to the computational complexity of phylogenetic network inference are imperative if analyses of large data sets are to be performed. We show that a recently developed divide-and-conquer approach significantly outperforms tree-based inference in terms of accuracy, albeit still at a higher computational cost

Molecular phylogenetic analysis: design and implementation of scalable and reliable algorithms and verification of phylogenetic properties

El término bioinformática tiene muchas acepciones, una gran parte referentes a la bioinformática molecular: el conjunto de métodos matemáticos, estadísticos y computacionales que tienen como objetivo dar solución a problemas biológicos, haciendo uso exclusivamente de las secuencias de ADN, ARN y proteínas y su información asociada. La filogenética es el área de la bioinformática encargada del estudio de la relación evolutiva entre organismos de la misma o distintas especies. Al igual que sucedía con la definición anterior, los trabajos realizados a lo largo de esta tesis se centran en la filogenética molecular: la rama de la filogenética que analiza las mutaciones hereditarias en secuencias biológicas (principalmente ADN) para establecer dicha relación evolutiva. El resultado de este análisis se plasma en un árbol evolutivo o filogenia. Una filogenia suele representarse como un árbol con raíz, normalmente binario, en el que las hojas simbolizan los organismos existentes actualmente y, la raíz, su ancestro común. Cada nodo interno representa una mutación que ha dado lugar a una división en la clasificación de los descendientes. Las filogenias se construyen mediante procesos de inferencia en base a la información disponible, que pertenece mayoritariamente a organismos existentes hoy en día. La complejidad de este problema se ha visto reflejada en la clasificación de la mayoría de métodos propuestos para su solución como NP-duros [1-3].El caso real de aplicación de esta tesis ha sido el ADN mitocondrial. Este tipo de secuencias biológicas es relevante debido a que tiene un alto índice de mutación, por lo que incluso filogenias de organismos muy cercanos evolutivamente proporcionan datos significativos para la comunidad biológica. Además, varias mutaciones del ADN mitocondrial humano se han relacionado directamente con enfermedad y patogenias, la mayoría mortales en individuos no natos o de corta edad. En la actualidad hay más de 30000 secuencias disponibles de ADN mitocondrial humano, lo que, además de su utilidad científica, ha permitido el análisis de rendimiento de nuestras contribuciones para datos masivos (Big Data). La reciente incorporación de la bioinformática en la categoría Big Data viene respaldada por la mejora de las técnicas de digitalización de secuencias biológicas que sucedió a principios del siglo 21 [4]. Este cambio aumentó drásticamente el número de secuencias disponibles. Por ejemplo, el número de secuencias de ADN mitocondrial humano pasó de duplicarse cada cuatro años, a hacerlo en menos de dos. Por ello, un gran número de métodos y herramientas usados hasta entonces han quedado obsoletos al no ser capaces de procesar eficientemente estos nuevos volúmenes de datos.Este es motivo por el que todas las aportaciones de esta tesis han sido desarrolladas para poder tratar grandes volúmenes de datos. La contribución principal de esta tesis es un framework que permite diseñar y ejecutar automáticamente flujos de trabajo para la inferencia filogenética: PhyloFlow [5-7]. Su creación fue promovida por el hecho de que la mayoría de sistemas de inferencia filogenética existentes tienen un flujo de trabajo fijo y no se pueden modificar ni las herramientas software que los componen ni sus parámetros. Esta decisión puede afectar negativamente a la precisión del resultado si el flujo del sistema o alguno de sus componentes no está adaptado a la información biológica que se va a utilizar como entrada. Por ello, PhyloFlow incorpora un proceso de configuración que permite seleccionar tanto cada uno de los procesos que formarán parte del sistema final, como las herramientas y métodos específicos y sus parámetros. Se han incluido consejos y opciones por defecto durante el proceso de configuración para facilitar su uso, sobre todo a usuarios nóveles. Además, nuestro framework permite la ejecución desatendida de los sistemas filogenéticos generados, tanto en ordenadores de sobremesa como en plataformas hardware (clusters, computación en la nube, etc.). Finalmente, se han evaluado las capacidades de PhyloFlow tanto en la reproducción de sistemas de inferencia filogenética publicados anteriormente como en la creación de sistemas orientados a problemas intensivos como el de inferencia del ADN mitocondrial humano. Los resultados muestran que nuestro framework no solo es capaz de realizar los retos planteados, sino que, en el caso de la replicación de sistemas, la posibilidad de configurar cada elemento que los componen mejora ampliamente su aplicabilidad.Durante la implementación de PhyloFlow descubrimos varias carencias importantes en algunas bibliotecas software actuales que dificultaron la integración y gestión de las herramientas filogenéticas. Por este motivo se decidió crear la primera biblioteca software en Python para estudios de filogenética molecular: MEvoLib [8]. Esta biblioteca ha sido diseñada para proveer una sola interfaz para los conjuntos de herramientas software orientados al mismo proceso, como el multialineamiento o la inferencia de filogenias. MEvoLib incluye además configuraciones por defecto y métodos que hacen uso de conocimiento biológico específico para mejorar su precisión, adaptándose a las necesidades de cada tipo de usuario. Como última característica relevante, se ha incorporado un proceso de conversión de formatos para los ficheros de entrada y salida de cada interfaz, de forma que, si la herramienta seleccionada no soporta dicho formato, este es adaptado automáticamente. Esta propiedad facilita el uso e integración de MEvoLib en scripts y herramientas software.El estudio del caso de aplicación de PhyloFlow al ADN mitocondrial humano ha expuesto los elevados costes tanto computacionales como económicos asociados a la inferencia de grandes filogenias. Por ello, sistemas como PhyloTree [9], que infiere un tipo especial de filogenias de ADN mitocondrial humano, recalculan sus resultados con una frecuencia máxima anual. Sin embargo, como ya hemos comentado anteriormente, las técnicas de secuenciación actuales permiten la incorporación de cientos o incluso miles de secuencias biológicas nuevas cada mes. Este desfase entre productor y consumidor hace que dichas filogenias queden desactualizadas en unos pocos meses. Para solucionar este problema hemos diseñado un nuevo algoritmo que permite la actualización de una filogenia mediante la incorporación iterativa de nuevas secuencias: PHYSER [10]. Además, la propia información evolutiva se utiliza para detectar posibles mutaciones introducidas artificialmente por el proceso de secuenciación, inexistentes en la secuencia original. Las pruebas realizadas con ADN mitocondrial han probado su eficacia y eficiencia, con un coste temporal por secuencia inferior a los 20 segundos.El desarrollo de nuevas herramientas para el análisis de filogenias también ha sido una parte importante de esta tesis. En concreto, se han realizado dos aportaciones principales en este aspecto: PhyloViewer [11] y una herramienta para el análisis de la conservación [12]. PhyloViewer es un visualizador de filogenias extensivas, es decir, filogenias que poseen al menos un millar de hojas. Esta herramienta aporta una novedosa interfaz en la que se muestra el nodo seleccionado y sus nodos hijo, así como toda la información asociada a cada uno de ellos: identificador, secuencia biológica, ... Esta decisión de diseño ha sido orientada a evitar el habitual “borrón” que se produce en la mayoría de herramientas de visualización al mostrar este tipo de filogenias enteras por pantalla. Además, se ha desarrollado en una arquitectura clienteservidor, con lo que el procesamiento de la filogenia se realiza una única vez por parte el servidor. Así, se ha conseguido reducir significativamente los tiempos de carga y acceso por parte del cliente. Por otro lado, la aportación principal de nuestra herramienta para el análisis de la conservación se basa en la paralelización de los métodos clásicos aplicados en este campo, alcanzando speed-ups cercanos al teórico sin pérdida de precisión. Esto ha sido posible gracias a la implementación de dichos métodos desde cero, incorporando la paralelización a nivel de instrucción, en vez de paralelizar implementaciones existentes. Como resultado, nuestra herramienta genera un informe que contiene las conclusiones del análisis de conservación realizado. El usuario puede introducir un umbral de conservación para que el informe destaque solo aquellas posiciones que no lo cumplan. Además, existen dos tipos de informe con distinto nivel de detalle. Ambos se han diseñado para que sean comprensibles y útiles para los usuarios.Finalmente, se ha diseñado e implementado un predictor de mutaciones patógenas en ADN mitocondrial desarollado en máquinas de vectores de soporte (SVM): Mitoclass.1 [13]. Se trata del primer predictor para este tipo de secuencias biológicas. Tanto es así, que ha sido necesario crear el primer repositorio de mutaciones patógenas conocidas, mdmv.1, para poder entrenar y evaluar nuestro predictor. Se ha demostrado que Mitoclass.1 mejora la clasificación de las mutaciones frente a los predictores más conocidos y utilizados, todos ellos orientados al estudio de patogenicidad en ADN nuclear. Este éxito radica en la novedosa combinación de propiedades a evaluar por cada mutación en el proceso de clasificación. Además, otro factor a destacar es el uso de SVM frente a otras alternativas, que han sido probadas y descartadas debido a su menor capacidad de predicción para nuestro caso de aplicación.REFERENCIAS[1] L. Wang and T. Jiang, “On the complexity of multiple sequence alignment,” Journal of computational biology, vol. 1, no. 4, pp. 337–348, 1994.[2] W. H. E. Day, D. S. Johnson, and D. Sankoff, “The Computational Complexity of Inferring Rooted Phylogenies by Parsimony,” Mathematical Biosciences, vol. 81, no. 1, pp. 33–42, 1986.[3] S. Roch, “A short proof that phylogenetic tree reconstruction by maximum likelihood is hard,” IEEE/ACM Transactions on Computational Biology and Bioinformatics (TCBB), vol. 3, no. 1, p. 92, 2006.[4] E. R. Mardis, “The impact of next-generation sequencing technology on genetics,” Trends in genetics, vol. 24, no. 3, pp. 133–141, 2008.[5] J. Álvarez-Jarreta, G. de Miguel Casado, and E. Mayordomo, “PhyloFlow: A Fully Customizable and Automatic Workflow for Phylogeny Estimation,” in ECCB 2014, 2014.[6] J. Álvarez-Jarreta, G. de Miguel Casado, and E. Mayordomo, “PhyloFlow: A Fully Customizable and Automatic Workflow for Phylogenetic Reconstruction,” in IEEE International Conference on Bioinformatics and Biomedicine (BIBM), pp. 1–7, IEEE, 2014.[7] J. Álvarez, R. Blanco, and E. Mayordomo, “Workflows with Model Selection: A Multilocus Approach to Phylogenetic Analysis,” in 5th International Conference on Practical Applications of Computational Biology & Bioinformatics (PACBB 2011), vol. 93 of Advances in Intelligent and Soft Computing, pp. 39–47, Springer Berlin Heidelberg, 2011.[8] J. Álvarez-Jarreta and E. Ruiz-Pesini, “MEvoLib v1.0: the First Molecular Evolution Library for Python,” BMC Bioinformatics, vol. 17, no. 436, pp. 1–8, 2016.[9] M. van Oven and M. Kayser, “Updated comprehensive phylogenetic tree of global human mitochondrial DNA variation,” Human Mutation, vol. 30, no. 2, pp. E386–E394, 2009.[10] J. Álvarez-Jarreta, E. Mayordomo, and E. Ruiz-Pesini, “PHYSER: An Algorithm to Detect Sequencing Errors from Phylogenetic Information,” in 6th International Conference on Practical Applications of Computational Biology & Bioinformatics (PACBB 2012), pp. 105–112, 2012.[11] J. Álvarez-Jarreta and G. de Miguel Casado, “PhyloViewer: A Phylogenetic Tree Viewer for Extense Phylogenies,” in ECCB 2014, 2014.[12] F. Merino-Casallo, J. Álvarez-Jarreta, and E. Mayordomo, “Conservation in mitochondrial DNA: Parallelized estimation and alignment influence,” in 2015 IEEE International Conference on Bioinformatics and Biomedicine (BIBM 2015), pp. 1434–1440, IEEE, 2015.[13] A. Martín-Navarro, A. Gaudioso-Simón, J. Álvarez-Jarreta, J. Montoya, E. Mayordomo, and E. Ruiz-Pesini, “Machine learning classifier for identification of damaging missense mutations exclusive to human mitochondrial DNA-encoded polypeptides,” BMC Bioinformatics, vol. 18, no. 158, pp. 1–11, 2017.<br /

Toward a Self-Updating Platform for Estimating Rates of Speciation and Migration, Ages, and Relationships of Taxa.

Rapidly growing biological data-including molecular sequences and fossils-hold an unprecedented potential to reveal how evolutionary processes generate and maintain biodiversity. However, researchers often have to develop their own idiosyncratic workflows to integrate and analyze these data for reconstructing time-calibrated phylogenies. In addition, divergence times estimated under different methods and assumptions, and based on data of various quality and reliability, should not be combined without proper correction. Here we introduce a modular framework termed SUPERSMART (Self-Updating Platform for Estimating Rates of Speciation and Migration, Ages, and Relationships of Taxa), and provide a proof of concept for dealing with the moving targets of evolutionary and biogeographical research. This framework assembles comprehensive data sets of molecular and fossil data for any taxa and infers dated phylogenies using robust species tree methods, also allowing for the inclusion of genomic data produced through next-generation sequencing techniques. We exemplify the application of our method by presenting phylogenetic and dating analyses for the mammal order Primates and for the plant family Arecaceae (palms). We believe that this framework will provide a valuable tool for a wide range of hypothesis-driven research questions in systematics, biogeography, and evolution. SUPERSMART will also accelerate the inference of a "Dated Tree of Life" where all node ages are directly comparable. [Bayesian phylogenetics; data mining; divide-and-conquer methods; GenBank; multilocus multispecies coalescent; next-generation sequencing; palms; primates; tree calibration.]

A roadmap for global synthesis of the plant tree of life

Providing science and society with an integrated, up-to-date, high quality, open, reproducible and sustainable plant tree of life would be a huge service that is now coming within reach. However, synthesizing the growing body of DNA sequence data in the public domain and disseminating the trees to a diverse audience are often not straightforward due to numerous informatics barriers. While big synthetic plant phylogenies are being built, they remain static and become quickly outdated as new data are published and tree-building methods improve. Moreover, the body of existing phylogenetic evidence is hard to navigate and access for non-experts. We propose that our community of botanists, tree builders, and informaticians should converge on a modular framework for data integration and phylogenetic analysis, allowing easy collaboration, updating, data sourcing and flexible analyses. With support from major institutions, this pipeline should be re-run at regular intervals, storing trees and their metadata long-term. Providing the trees to a diverse global audience through user-friendly front ends and application development interfaces should also be a priority. Interactive interfaces could be used to solicit user feedback and thus improve data quality and to coordinate the generation of new data. We conclude by outlining a number of steps that we suggest the scientific community should take to achieve global phylogenetic synthesis

Fast and accurate supertrees: towards large scale phylogenies

Phylogenetics is the study of evolutionary relationships between biological entities; phylogenetic trees (phylogenies) are a visualization of these evolutionary relationships. Accurate approaches to reconstruct hylogenies from sequence data usually result in NPhard optimization problems, hence local search heuristics have to be applied in practice. These methods are highly accurate and fast enough as long as the input data is not too large. Divide-and-conquer techniques are a promising approach to boost scalability and accuracy of those local search heuristics on very large datasets. A divide-and-conquer method breaks down a large phylogenetic problem into smaller sub-problems that are computationally easier to solve. The sub-problems (overlapping trees) are then combined using a supertree method. Supertree methods merge a set of overlapping phylogenetic trees into a supertree containing all taxa of the input trees. The challenge in supertree reconstruction is the way of dealing with conflicting information in the input trees. Many different algorithms for different objective functions have been suggested to resolve these conflicts. In particular, there are methods that encode the source trees in a matrix and the supertree is constructed applying a local search heuristic to optimize the respective objective function. The most widely used supertree methods use such local search heuristics. However, to really improve the scalability of accurate tree reconstruction by divide-and-conquer approaches, accurate polynomial time methods are needed for the supertree reconstruction step. In this work, we present approaches for accurate polynomial time supertree reconstruction in particular Bad Clade Deletion (BCD), a novel heuristic supertree algorithm with polynomial running time. BCD uses minimum cuts to greedily delete a locally minimal number of columns from a matrix representation to make it compatible. Different from local search heuristics, it guarantees to return the directed perfect phylogeny for the input matrix, corresponding to the parent tree of the input trees if one exists. BCD can take support values of the source trees into account without an increase in complexity. We show how reliable clades can be used to restrict the search space for BCD and how those clades can be collected from the input data using the Greedy Strict Consensus Merger. Finally, we introduce a beam search extension for the BCD algorithm that keeps alive a constant number of partial solutions in each top-down iteration phase. The guaranteed worst-case running time of BCD with beam search extension is still polynomial. We present an exact and a randomized subroutine to generate suboptimal partial solutions. In our thorough evaluation on several simulated and biological datasets against a representative set of supertree methods we found that BCD is more accurate than the most accurate supertree methods when using support values and search space restriction on simulated data. Simultaneously BCD is faster than any other evaluated method. The beam search approach improved the accuracy of BCD on all evaluated datasets at the cost of speed. We found that BCD supertrees can boost maximum likelihood tree reconstruction when used as starting tree. Further, BCD could handle large scale datasets where local search heuristics did not converge in reasonable time. Due to its combination of speed, accuracy, and the ability to reconstruct the parent tree if one exists, BCD is a promising approach to enable outstanding scalability of divide-and-conquer approaches.Die Phylogenetik studiert die evolutionären Beziehungen zwischen biologischen Entitäten. Phylogenetische Bäume sind eine Visualisierung dieser Beziehungen. Akkurate Ansätze zur Rekonstruktion von Phylogenien aus Sequenzdaten führen in der Regel zu NP-schweren Optimierungsproblemen, sodass in der Praxis lokale Suchheuristiken angewendet werden müssen. Diese Methoden liefern akkurate Bäume und sind schnell genug, solange die Eingabedaten nicht zu groß werden. Teile-und-herrsche-Verfahren sind ein vielversprechender Ansatz, um Skalierbarkeit und Genauigkeit dieser lokalen Suchheuristiken auf sehr großen Datensätzen zu verbessern. Beim Teile-und-herrsche-Ansatz zerlegt man ein großes phylogenetisches Problem in kleinere Teilprobleme, die einfacher und schneller zu lösen sind. Die Teilprobleme, in diesem Fall überlappende Teilbäume, müssen dann zu einem gesamtheitlichen Baum kombiniert werden. Superbaummethoden verschmelzen solche überlappenden phylogenetischen Bäume zu einem Superbaum, der alle Taxa der Eingangsbäume enthält. Die Herausforderung bei der Superbaumrekonstruktion besteht darin, mit widersprüchlichen Eingabebäumen umzugehen. Es wurden viele verschiedene Algorithmen mit unterschiedlichen Zielfunktionen entwickelt, um solche Widersprüche möglichst sinnvoll aufzulösen. Verfahren, die auf der Kodierung der Eingabebäume als Matrixrepräsentation basieren, sind am weitesten verbreitet. Die zum Auflösen der Konflikte verwendeten Zielfunktionen führen in der Regel zu NP-schweren Optimierungsproblemen, sodass in der Praxis auch hier lokale Suchheuristiken zum Einsatz kommen. Da diese Ansätze nicht wesentlich besser mit der Größe der Eingabedaten skalieren als die direkte Rekonstruktion aus Sequenzdaten, werden für die Superbaumrekonstruktion in Teile-undherrsche-Ansätzen akkurate Polynomialzeitmethoden benötigt. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der akkuraten Rekonstruktion von Superbäumen in Polynomialzeit. Wir präsentieren Bad Clade Deletion (BCD), eine neue Polynomialzeitheuristik zur Superbaumrekonstruktion. BCD verwendet minimale Schnitte in Graphen, um eine minimale Anzahl von Spalten aus der Matrixrepräsentation zu löschen, sodass diese konfliktfrei wird. Im Gegensatz zu lokalen Suchheuristiken garantiert BCD die Rekonstruktion einer perfekten Phylogenie, sofern eine solche für die Eingabematrix existiert. BCD ermöglicht es, Gütekriterien der Eingabebäume zu berücksichtigen, ohne dass sich dadurch die Komplexität erhöht. Weiterhin zeigen wir, wie zuverlässige Kladen verwendet werden können, um den Suchraum für BCD einzuschränken und wie man diese mit Hilfe des Greedy Strict Consensus Mergers aus den Eingabedaten gewinnen kann. Schließlich stellen wir eine Strahlensuche für BCD vor. Diese erlaubt es eine bestimmte Anzahl suboptimaler Teillösungen (anstatt nur der optimalen) zu berücksichtigen, um so das Gesamtergebnis zu verbessern. Die Worst-Case-Laufzeit der Strahlensuche ist immer noch polynomiell. Zur Berechnung suboptimaler Teillösungen stellen wir einen exakten und einen randomisierten Algorithmus vor. In einer ausführlichen Evaluation auf mehreren simulierten und biologischen Datensätzen vergleichen wir BCD mit einer repräsentativen Auswahl an Superbaummethoden. Wir haben herausgefunden, dass BCD bei Verwendung von Gütekriterien und Suchraumbeschränkung auf simulierten Daten genauer ist als die akkuratesten evaluierten Superbaummethoden. Gleichzeitig ist BCD deutlich schneller als alle evaluierten Methoden. Die Strahlensuche verbessert die Qualität der BCD-Bäume auf allen Datensätzen, allerdings auf Kosten der Laufzeit. Weiterhin fanden wir heraus, dass ein BCD-Superbaum, der als Startbaum verwendet wird, die Qualität einer Maximum-Likelihood-Baumrekonstruktion verbessern kann. Außerdem kann BCD Datensätze verarbeiten, die so groß sind, dass lokale Suchheuristiken auf diesen nicht mehr in angemessener Zeit konvergieren. Aufgrund der Kombination aus Geschwindigkeit, Genauigkeit und der Fähigkeit, den Elternbaum zu rekonstruieren, sofern ein solcher existiert, ist BCD ein vielversprechender Ansatz um die Skalierbarkeit von Teile-und-herrsche-Methoden entscheidend zu verbessern

Phylogenetics in the Genomic Era

Molecular phylogenetics was born in the middle of the 20th century, when the advent of protein and DNA sequencing offered a novel way to study the evolutionary relationships between living organisms. The first 50 years of the discipline can be seen as a long quest for resolving power. The goal – reconstructing the tree of life – seemed to be unreachable, the methods were heavily debated, and the data limiting. Maybe for these reasons, even the relevance of the whole approach was repeatedly questioned, as part of the so-called molecules versus morphology debate. Controversies often crystalized around long-standing conundrums, such as the origin of land plants, the diversification of placental mammals, or the prokaryote/eukaryote divide. Some of these questions were resolved as gene and species samples increased in size. Over the years, molecular phylogenetics has gradually evolved from a brilliant, revolutionary idea to a mature research field centred on the problem of reliably building trees. This logical progression was abruptly interrupted in the late 2000s. High-throughput sequencing arose and the field suddenly moved into something entirely different. Access to genome-scale data profoundly reshaped the methodological challenges, while opening an amazing range of new application perspectives. Phylogenetics left the realm of systematics to occupy a central place in one of the most exciting research fields of this century – genomics. This is what this book is about: how we do trees, and what we do with trees, in the current phylogenomic era. One obvious, practical consequence of the transition to genome-scale data is that the most widely used tree-building methods, which are based on probabilistic models of sequence evolution, require intensive algorithmic optimization to be applicable to current datasets. This problem is considered in Part 1 of the book, which includes a general introduction to Markov models (Chapter 1.1) and a detailed description of how to optimally design and implement Maximum Likelihood (Chapter 1.2) and Bayesian (Chapter 1.4) phylogenetic inference methods. The importance of the computational aspects of modern phylogenomics is such that efficient software development is a major activity of numerous research groups in the field. We acknowledge this and have included seven "How to" chapters presenting recent updates of major phylogenomic tools – RAxML (Chapter 1.3), PhyloBayes (Chapter 1.5), MACSE (Chapter 2.3), Bgee (Chapter 4.3), RevBayes (Chapter 5.2), Beagle (Chapter 5.4), and BPP (Chapter 5.6). Genome-scale data sets are so large that statistical power, which had been the main limiting factor of phylogenetic inference during previous decades, is no longer a major issue. Massive data sets instead tend to amplify the signal they deliver – be it biological or artefactual – so that bias and inconsistency, instead of sampling variance, are the main problems with phylogenetic inference in the genomic era. Part 2 covers the issues of data quality and model adequacy in phylogenomics. Chapter 2.1 provides an overview of current practice and makes recommendations on how to avoid the more common biases. Two chapters review the challenges and limitations of two key steps of phylogenomic analysis pipelines, sequence alignment (Chapter 2.2) and orthology prediction (Chapter 2.4), which largely determine the reliability of downstream inferences. The performance of tree building methods is also the subject of Chapter 2.5, in which a new approach is introduced to assess the quality of gene trees based on their ability to correctly predict ancestral gene order. Analyses of multiple genes typically recover multiple, distinct trees. Maybe the biggest conceptual advance induced by the phylogenetic to phylogenomic transition is the suggestion that one should not simply aim to reconstruct “the” species tree, but rather to be prepared to make sense of forests of gene trees. Chapter 3.1 reviews the numerous reasons why gene trees can differ from each other and from the species tree, and what the implications are for phylogenetic inference. Chapter 3.2 focuses on gene trees/species trees reconciliation methods that account for gene duplication/loss and horizontal gene transfer among lineages. Incomplete lineage sorting is another major source of phylogenetic incongruence among loci, which recently gained attention and is covered by Chapter 3.3. Chapter 3.4 concludes this part by taking a user’s perspective and examining the pros and cons of concatenation versus separate analysis of gene sequence alignments. Modern genomics is comparative and phylogenetic methods are key to a wide range of questions and analyses relevant to the study of molecular evolution. This is covered by Part 4. We argue that genome annotation, either structural or functional, can only be properly achieved in a phylogenetic context. Chapters 4.1 and 4.2 review the power of these approaches and their connections with the study of gene function. Molecular substitution rates play a key role in our understanding of the prevalence of nearly neutral versus adaptive molecular evolution, and the influence of species traits on genome dynamics (Chapter 4.4). The analysis of substitution rates, and particularly the detection of positive selection, requires sophisticated methods and models of coding sequence evolution (Chapter 4.5). Phylogenomics also offers a unique opportunity to explore evolutionary convergence at a molecular level, thus addressing the long-standing question of predictability versus contingency in evolution (Chapter 4.6). The development of phylogenomics, as reviewed in Parts 1 through 4, has resulted in a powerful conceptual and methodological corpus, which is often reused for addressing problems of interest to biologists from other fields. Part 5 illustrates this application potential via three selected examples. Chapter 5.1 addresses the link between phylogenomics and palaeontology; i.e., how to optimally combine molecular and fossil data for estimating divergence times. Chapter 5.3 emphasizes the importance of the phylogenomic approach in virology and its potential to trace the origin and spread of infectious diseases in space and time. Finally, Chapter 5.5 recalls why phylogenomic methods and the multi-species coalescent model are key in addressing the problem of species delimitation – one of the major goals of taxonomy. It is hard to predict where phylogenomics as a discipline will stand in even 10 years. Maybe a novel technological revolution will bring it to yet another level? We strongly believe, however, that tree thinking will remain pivotal in the treatment and interpretation of the deluge of genomic data to come. Perhaps a prefiguration of the future of our field is provided by the daily monitoring of the current Covid-19 outbreak via the phylogenetic analysis of coronavirus genomic data in quasi real time – a topic of major societal importance, contemporary to the publication of this book, in which phylogenomics is instrumental in helping to fight disease