Régulation acoustique de la cavitation ultrasonore pour la transfection cellulaire in vitro.

La transfection ultrasonore de matériel génétique au sein de la cellule implique le phénomène de cavitation ultrasonore, qui apparaît souvent comme non reproductible et instationnaire. Afin de trouver un compromis acceptable entre mortalité cellulaire et taux de transfection, un système de régulation de la cavitation ultrasonore basé sur un critère acoustique a été mis en œuvre et validé pour la transfection cellulaire dans une configuration de transducteur plan en tir continu

Streaming acoustique dans un puits de culture cellulaire : application à la sonoporation

Le phénomène de sonoporation est intimement lié à l'interaction entre une cellule et une bulle de cavitation. Pour obtenir une information sur le caractère spatial de la cavitation ultrasonore générée, et en vue de la transfection de cellules adhérentes dans un puits de culture biologique, cette étude vise à caractériser le champ acoustique et le streaming dans une cavité non rectangulaire. Pour ce faire, des particules fluorescentes (3µm) sont utilisées sous microscope et permettent de quantifier le champ de déplacement au voisinage de la paroi

Régulation acoustique de la cavitation ultrasonore pour la transfection cellulaire in vitro.

Colloque avec actes et comité de lecture. Internationale.International audienceLa transfection ultrasonore de matériel génétique au sein de la cellule implique le phénomène de cavitation ultrasonore, qui apparaît souvent comme non reproductible et instationnaire. Afin de trouver un compromis acceptable entre mortalité cellulaire et taux de transfection, un système de régulation de la cavitation ultrasonore basé sur un critère acoustique a été mis en œuvre et validé pour la transfection cellulaire dans une configuration de transducteur plan en tir continu

Caractérisation d'un processus de régulation de la cavitation acoustique

National audienceLa cavitation acoustique est un phénomène stochastique, un niveau d'insonification fixé ne donnant pas lieu à une activité de cavitation reproductible ni régulière. Lors d'une insonification, des collapses inertiels de bulles peuvent apparaitre de manière intermittente, se traduisant par un bruit de fond sur les spectres du signal de réception, qui est un bon indicateur de la cavitation inertielle. Basé sur cet indicateur une méthode de contrôle dynamique du niveau de cavitation dans un milieu placé dans un champ ultrasonore stationnaire est proposée. Cette méthode consiste à maintenir un indice de cavitation CI, image de l'intensité de cavitation dans le milieu insonifié (Jhony El Maalouf, Ultrasonics 2008), au niveau de celui désiré par une boucle de rétroaction modulant l'intensité ultrasonore appliqué dans la plage comprise entre 0.2 et 3.44 W/cm2. Le dispositif expérimental est constitué d'un transducteur ultrasonore piézoélectrique plan (diamètre : 20 mm, fréquence 445 KHz), et d'un hydrophone récepteur du signal acoustique induit par la cavitation dans le milieu. L'apport d'un tel processus de contrôle est évalué par l'émission acoustique de la cavitation induite dans le milieu irradié (eau ou 2μM d'acide téréphtalique) et par la production de radicaux hydroxyles issus de la sonolyse du milieu (2μM d'acide téréphtalique). Le système de régulation permet de reproduire des indices de cavitation avec une variabilité inférieure à 3 % dans la plage des puissances appliquées, alors que, sans le contrôle de l'activité de la cavitation, cette variabilité peut atteindre 40 % en milieu de plage d'excitation ultrasonore. En conclusion, le générateur de cavitation régulé permet de reproduire parfaitement les niveaux de cavitation et cela indépendamment des faibles variations des conditions extérieures comme la température, et la pression atmosphérique. Ainsi, il apparait comme un outil très intéressant pour des applications de transfection in vitro

Evaluation of inertial cavitation activity in tissue through measurement of oxidative stress

International audienc

Stabilisation of Cavitation Zone for Therapeutic Applications

National audienceCavitating bubbles in the focal area of a focused ultrasonic beam form a zone of cavitation. One can observe fluctuations of the zone in terms of its size and position around focal point. Complex distribution of acoustic pressure, radiation force and streaming determine bubble cloud formation. The cloud modifies the ultrasonic field distribution. That explains fluctuations of size and position of the cavitation zone relative to ultrasonic source. For therapeutic applications of cavitation such instability in space and in time is often problematic as the treatment cannot be controlled spatially and the cavitation dose cannot be quantified. The authors propose a practical and simple solution by mixing several ultrasonic beams. A smaller cavitation zone is achieved compared to a single focused beam. Fluctuations are significantly reduced. Bubble activity is illustrated by in-vitro experiments with ultrasonic imaging. Bioeffects of different exposure conditions are evaluated in-vivo on subcutaneous tumors on rats. Histological analysis shows that a necrotic zone caused by cavitation is in the spatial location as it is expected. This EUREKA labeled project (E! 4056 UMDD) is supported by the Franco-Norwegian Foundation (convention FNS 07-01) and OSEO (A0712014V)

Evaluation of Eventual Risks of Unseeded Inertial Cavitation for Enhancing the Delivery of Chemotherapies

National audienceAcoustic cavitation is widely used to improve drug delivery in tumors. In this study, we evaluate the safety of using unseeded inertial cavitation (without external nucleation agents) for this application. We show that unseeded inertial cavitation (UIC) does not degrade doxorubicin molecules or alter its cytotoxicity. Moreover, histopathologic analysis shows only slight or reversible moderate effects on healthy tissues. Finally, UIC does not promote metastatic spreading. Thus, the particular conditions used in this study provide the possibility of safe UIC concerning these three points

Générateur de cavitation reproductible : exemples d'application biologique in-vitro

National audienceLa cavitation ultrasonore peut conduire à différents types d'effets biologiques en fonction de son intensité. Ces effets, très destructeurs, présents en lithotritie, en hyperthermie par HIFU ou en histotritie, peuvent aussi réaliser, pour des intensités moindres, des pores cellulaires de taille suffisante pour permettre l'entrée de particules, de matériels génétiques ou de produits chimiques. Dans ces dernières applications, la cavitation n'apparait pas systématiquement et les expérimentations nécessitent souvent des adjuvants comme les produits de contraste utilisés comme germes de cavitation. Nous avons développé un générateur continu de cavitation, travaillant dans la plage d'intensité acoustique de 0.2 à 3.5 W/cm2, et régulé (cadencement : 5 ms) sur un indice de cavitation (CI) établi à partir du signal acoustique émis par la cavitation. Ce dispositif, de part la reproductibilité du processus de cavitation générée, a permis de caractériser en sonodynamothérapie les effets potentialisateurs d'un photosensibilisant (Photofrin©) et de transfecter des cellules non-adhérentes ( RL du lymphome folliculaire ou LLC de Leucémie Lymphoïde Chronique) très difficiles à transfecter de par ailleurs (électroporation, lipofection). Le Photofrin, additionné au milieu de culture (incubation de 30 min), potentialise l'effet cytotoxique induit par cavitation de sa phase stable à transitoire avec une liaison très forte avec le CI (r2>0.95). Nos travaux ont montré une plus grande sensibilité des membranes cellulaires aux contraintes mécaniques induite par le Photofrin. Dans l'étude du dysfonctionnement des mécanismes régulateurs de l'apoptose des LLC par le ciblage des gènes responsables de la chimiorésistance, la transfection de siRNAs correspondants a pu être réalisée. Les taux de transfection sont reproductibles de 10% pour le plasmide PeGFP à près de 60% pour un SiRNA (fluoroscein) avec une mortalité résiduelle réduite à 10%. Ce dispositif a aussi permis d'élaborer un modèle de tumeur fluorescent par une transfection « stable » de plasmides pour des études de tumorogénèse

A causal study of the phenomenon of ultrasound neurostimulation applied to an in vivo invertebrate nervous model

International audienceFocused ultrasound are considered to be a promising tool for the treatment of neurological conditions, overcoming the limitations of current neurostimulation techniques in terms of spatial resolution and invasiveness. Much evidence to support the feasibility of ultrasound activation of neurons at the systemic level has already been provided, but to this day, the biophysical mechanisms underlying ultrasound neurostimulation are still widely unknown. In order to be able to establish a clear and robust causality between acoustic parameters of the excitation and neurobiological characteristics of the response, it is necessary to work at the cellular level, or alternatively on very simple animal models. The study reported here responds to three objectives. Firstly, to propose a simple nervous model for the study of the ultrasound neurostimulation phenomenon, associated with a clear and simple experimental protocol. Secondly, to compare the characteristics of this model’s nervous response to ultrasound neurostimulation with its nervous response to mechanical and electrical stimulation. Thirdly, to study the role played by certain acoustic parameters in the success rate of the phenomenon of ultrasound stimulation. The feasibility of generating action potentials (APs) in the giant axons of an earthworm’s ventral nerve cord, using pulsed ultrasound stimuli (f = 1.1 MHz, Ncycles = 175–1150, PRF = 25–125 Hz, Npulses = 20, PA = 2.5–7.3 MPa), was demonstrated. The time of generation (TOG) of APs associated with ultrasound stimulation was found to be significantly shorter and more stable than the TOG associated with mechanical stimulation (p < 0.001). By applying a causal approach to interpret the results of this study, it was concluded that, in this model, the nervous response to focused ultrasound is initiated along the afferent neurons, in between the mechanosensors and the synaptic connections with the giant axons. Additionally, early results are provided, highlighting a trend for the success rate of ultrasound neurostimulation and number of APs triggered per response to increase with increasing pulse repetition frequency (p < 0.05 and p < 0.001, respectively), increasing pulse duration and increasing pulse amplitude

Data from: Ultrasonic cavitation induces necrosis and impairs growth in three-dimensional models of pancreatic ductal adenocarcinoma

Introduction: Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a rapidly increasing cause of mortality whose dismal prognosis is mainly due to overwhelming chemoresistance. New therapeutic approaches include physical agents such as ultrasonic cavitation, but clinical applications require further insights in the mechanisms of cytotoxicity. Three dimensional in vitro culture models such as spheroids exploit realistic spatial, biochemical and cellular heterogeneity that may bridge some of the experimental gap between conventional in vitro and in vivo experiments. Purpose: to assess the feasibility and efficiency of inertial cavitation associated or not with chemotherapy, in a spheroid model of PDAC. Methods: we used DT66066 cells ,derived from a genetically-engineered murine PDAC, isolated from KPC-transgenic mice (LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1- Cre). Spheroids were obtained by either a standard centrifugation-based method, or by using a magnetic nano-shuttle method allowing the formation of spheroids within 24 hours and facilitating their handling. The spheroids were exposed to ultrasonic inertial cavitation in a specially designed setup. Four conditions were studied: control, gemcitabine alone , US cavitation alone , US cavitation + gemcitabine. Five US inertial cavitation indexes, corresponding to increased US intensities, were evaluated . The effectiveness of treatment was assessed after 24 hours with the following criteria: spheroid size (growth), ratio of phase S cells (proliferation), proportion of cells in apoptosis or necrosis (cellular mortality). These parameters were assessed by quantitative immunofluorescence techniques. Results: The 3D culture model presented excellent reproducibility. Eight or nine spheroids were analyzed for each condition. Cavitation induced a significant decrease in the size of spheroids , an effect significantly correlated to an increasing cavitation index (p < 0.0001). The treatment induced cell death whose predominant mechanism was necrosis (p < 0.0001). There was a tendency to a synergistic effect of US cavitation and gemcitabine at 5μM concentration, however significant in only one of the cavitation indexes used (p = 0. 013). Conclusion: Ultrasonic inertial cavitation induced a significant reduction of tumor growth in a spheroid model of PDAC., with necrosis rather than apoptosis as a Cell dominant mechanism of cell death. More investigations are needed to understand the potential role of inertial cavitation in overcoming chemoresistance