La transfection ultrasonore de matériel

            génétique au sein de la cellule implique le phénomène de cavitation ultrasonore, qui

            apparaît souvent comme non reproductible et instationnaire. Afin de trouver un compromis

            acceptable entre mortalité cellulaire et taux de transfection, un système de régulation

            de la cavitation ultrasonore basé sur un critère acoustique a été mis en œuvre et validé

            pour la transfection cellulaire dans une configuration de transducteur plan en tir

            continu

BÉRA, Jean-Christophe

GILLES, Bruno

MESTAS, Jean-louis

French

I-Revues

19ème Congrès Français de Mécanique                                                                                       Marseille, 24-28 août 2009 
  1
Régulation acoustique de la cavitation ultrasonore 
pour la transfection cellulaire in vitro 
J.-L. MESTASa,b, B. GILLESa,b, J.-C. BERAa,b 
a. INSERM, U556, Applications des Ultrasons à la Thérapie, 151 cours Albert Thomas, Lyon, F-69003  
b. Université Lyon 1, Lyon, F-69003 
Résumé : 
La transfection ultrasonore de matériel génétique au sein de la cellule implique le phénomène de cavitation 
ultrasonore, qui apparaît souvent comme non reproductible et instationnaire. Afin de trouver un compromis 
acceptable entre mortalité cellulaire et taux de transfection, un système de régulation de la cavitation 
ultrasonore basé sur un critère acoustique a été mis en œuvre et validé pour la transfection cellulaire dans 
une configuration de transducteur plan en tir continu. 
Abstract : 
Ultrasound transfection, i.e. internalization of genetic material into cells promoted by ultrasound, is linked 
to cavitation, which generally appears to be a non reproductible and unstationary phenomenon. In order to 
obtain an acceptable trade-off between cell mortality and transfection, a regulated cavitation generator 
based on an acoustical cavitation measurement was developed and it was tested for transfection in a 
continuous plan wave configuration. 
Mots clefs : cavitation, ultrasons, régulation, sonoporation, transfection 
1 Problématique de la transfection ultrasonore 
La transfection génique est l’internalisation de matériaux génétiques au sein de la cellule vivante. Le 
développement de vecteurs de transfection fiables et peu invasifs constitue actuellement un enjeu majeur 
pour le développement de la thérapie génique. Les ultrasons sont proposés à ce titre depuis une vingtaine 
d’années [1] et ont fait l’objet de nombreuses études de transfection (par exemple [2-3]). Bien que les 
mécanismes exacts de sonoporation restent mal connus, le phénomène de cavitation ultrasonore, qui 
comprend l’oscillation et éventuellement l’implosion de bulles sous l’effet du champ acoustique, apparaît 
jouer un rôle majeur dans ce phénomène. En effet, s’il est vrai que les ultrasons, même à faible niveau, 
peuvent modifier le comportement cellulaire (on peut citer par exemple l’accélération ultrasonore de la 
reconstruction osseuse [4]), l’effet direct des ultrasons sur la perméabilité cytoplasmique ne semble pas 
prépondérant. La transfection apparaît pour des intensités acoustiques conséquentes (typiquement 
supérieures à quelques centaines de mW/cm²), suffisantes pour créer de la cavitation. D’une part, 
l’oscillation de microbulles au voisinage des cellules et les microcourants qui en découlent pourraient 
générer des contraintes significatives sur les parois cellulaires et modifier leur perméabilité ; d’autre part, 
l’implosion de ces bulles (correspondant au phénomène de cavitation inertielle) sous l’effet de fluctuations 
acoustiques intenses se caractérise par des concentrations très intenses et très localisées d’énergie, qui sont 
notamment à l’origine de microjets très violents, susceptibles de trouer n’importe quelle paroi cytoplasmique, 
voire de sectionner ou déchiqueter totalement des cellules. 
La cavitation ultrasonore peut donc modifier la porosité cellulaire et détruire les cellules. Cet effet de 
destruction tissulaire est d’ailleurs plus ou moins mis à contribution en appui de l’effet thermique de 
« cuisson » des tissus dans les traitements d’ablation des tumeurs cancéreuses par ultrasons de forte intensité. 
Il fait également l’objet de recherches spécifiques pour la destruction des tumeurs par cavitation ultrasonore, 
notamment en combinaison avec des agents pharmacologiques, comme en sonodynamothérapie [5]. En tout 
état de cause, l’utilisation des ultrasons pour la transfection est délicate car la sonoporation et la destruction 
cellulaire apparaissent pour des niveaux ultrasonores apparemment similaires. Et même si l’utilisation 
d’agents de contrastes ultrasonores ou l’augmentation de la quantité de gaz dissous dans le milieu permettent 
19ème Congrès Français de Mécanique                                                                                       Marseille, 24-28 août 2009 
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de favoriser la transfection [6], il reste cependant  difficile d’obtenir de forts taux de transfection sans effet 
cytotoxique notable. 
De plus, la cavitation ultrasonore apparaît comme un phénomène très aléatoire, notamment quand on 
souhaite travailler au voisinage du seuil de cavitation inertielle. On constate ainsi que pour une intensité 
acoustique donnée, l’état de cavitation peut être très différent et instationnaire. Afin d’améliorer le 
compromis entre mortalité et taux de transfection, nous proposons de transfecter à niveau de cavitation fixé, 
au lieu de travailler à niveau acoustique fixé. Un système de régulation de la cavitation ultrasonore pour la 
transfection a donc été développé. Le principe de ce système et le résultat d’expériences préliminaires de 
validation sont présentés dans ce qui suit dans une configuration simple en l’absence d’agent de contraste. 
2 Dispositif expérimental 
2.1 Système d’insonification cellulaire 
Le dispositif d’insonification est présenté sur la figure 1. Le milieu à insonifier est placé dans les puits d’une 
plaque de culture cellulaire, à raison de 2 ml par puits. L’onde ultrasonore est générée par un traducteur 
piézoélectrique plan de diamètre 20 mm, situé à 9 mm en dessous du puits. Le tout est placé dans un bain 
d’eau dégazée qui assure le couplage acoustique. L’excitation ultrasonore est une onde sinusoïdale continue 
de fréquence f0 = 445 kHz. La durée d’insonification choisie sera généralement de 60 s. L’intensité 
acoustique maximale délivrée est de 1,7 W.cm-2 en moyenne spatiale, et la pression maximale est de 
0,46 MPa. Un hydrophone PVDF de diamètre 10 mm permet de mesurer le signal acoustique diffusé. 
                      
FIG. 1 – Système d’insonification : vue plongeante et section latérale. 
2.2 Générateur de cavitation ultrasonore régulée   
               
FIG. 2 – Schéma général du dispositif de contrôle de cavitation. 
Preamplifier
20 dB
Amplifier
50 dB
MXI-3 Bus 
80 Mo/s 
AD Converter 
64 MS/s 
14 bits
Sinus 
Generator
Bus
Control
System
Control
Frequency
In
te
n
si
ty
CI
- Spectrum acquisition every 5 ms
PXI Module
Analogic              Digital
Hydrophone
Transducer
hydrophone 
source 
ultrasonore 
eau dégazée 
milieu de 
culture 
plaque de 
culture 
air 
source 
capteur 
plaque de culture 
19ème Congrès Français de Mécanique                                                                                       Marseille, 24-28 août 2009 
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L’insonification est pilotée par ordinateur. Pendant l’insonification, le signal acoustique diffusé est numérisé 
par une carte d’acquisition, les données sont transférées à un ordinateur, qui fixe l’intensité acoustique 
envoyée (figure 2). 
2.2.1 Mesure acoustique de la cavitation 
La cavitation est caractérisée par le bruit acoustique émis par les mouvements des microbulles au sein du 
milieu exposé aux ultrasons. Le spectre de ce signal est formé de différentes raies et bruit de fond (figure 3). 
La raie principale correspond à la fréquence d’émission f0 de la source ultrasonore. Les raies aux fréquences 
multiples de f0 peuvent avoir différentes origines non-linéaires. Les raies intermédiaires positionnées sur les 
fréquences 1/2, 3/2, 5/2 etc de f0 sont des raies spécifiques de la présence d’oscillation de bulles. Le niveau 
large bande du spectre est, pour sa part, caractéristique de l’implosion de bulles liée au phénomène de 
cavitation inertielle. 
 
FIG. 3 – Exemple de spectre de signal acoustique diffusé en présence de cavitation. 
Ici on a essentiellement de la cavitation non inertielle (oscillation de bulles). 
Afin de contrôler la cavitation de façon simple, l’idée adoptée ici est de définir un critère scalaire global de 
cavitation, qui tienne compte de façon continu de l’activité d’oscillation des bulles et de l’activité de 
cavitation inertielle. Notre indice de cavitation (IDC) est construit à partir du spectre acoustique sur la bande 
0,1 à 7,1 MHz, comme la moyenne arithmétique des intensités acoustiques en dB sur les fréquences 
considérées [7]. Ainsi par exemple, compte tenu des paramètres de nos spectres, une augmentation de 1 dB 
de l’IDC peut correspondre à une augmentation globale de tout le spectre de 1 dB, ou bien une augmentation 
globale du bruit de fond large bande du spectre d’environ 2 dB, ou bien une égale augmentation de tous les 
harmoniques de l’excitation d’environ 4 dB, ou bien une augmentation de la seule raie fondamentale 
d’environ 50 dB : on voit bien que ce critère est essentiellement un compromis entre cavitation inertielle et 
non inertielle. 
Des essais de cavitation à intensité acoustique constante confirment, par la mesure de l’évolution de l’IDC, le 
caractère parfois instationnaire de la cavitation dans notre configuration (figure 4). Au démarrage, le temps 
caractéristique d’établissement de l’IDC est typiquement de 200 ms, pour un temps caractéristique 
d’établissement du champ acoustique inférieur à la milliseconde. 
2.2.2 Système de régulation 
Notre critère de cavitation acoustique IDC est maintenant pris comme consigne dans une boucle de 
régulation. Le synopsis du système mis en œuvre est donné sur la figure 5. Dans une phase préliminaire, une 
identification dynamique est réalisée en boucle ouverte pour une succession de consignes préétablie ; le 
processus n’étant pas déterministe, un moyennage et un lissage de la courbe intensité-IDC sont effectués. 
Dans la phase de fonctionnement en boucle fermée, l’IDC mesuré est comparé à la consigne d’IDC et une 
correction différentielle de l’intensité acoustique envoyée est alors effectuée sur la base de l’identification. 
La cadence de régulation est de 5 ms. 
0
10
20
30
40
50
0 1 2 3 4 5 6 7
Frequency (MHz)
In
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B
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Spectrum Mean
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In
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  4
  
 
FIG. 4 – Exemples d’évolution temporelle de l’IDC pour des insonifications à intensité acoustique constante : 
(1)  0,48 W/cm² : on observe ici des oscillations de l’activité de cavitation, 
(2)  0,66 W/cm² : la cavitation ne déclenche ici qu’au bout de 52 secondes, 
(3)  0,92 W/cm² : ici le niveau de cavitation est constant (mais pour cette même intensité, le 
niveau de cavitation n’est pas pour autant reproductible entre différentes réalisations). 
 
Algorithme
Traitement
données
Horloge
Système 
à
Régler
D
A
D
A 
n(t)
Bruit sur 
la mesure
Grandeur
 réglée
y(t) csm(kh)
X(t) u(t) u(kh)
w(kh)
Commande Commande
Consigne
kh
w(kh)
kh
y(kh)
kh
u(kh)
t
u(t)
t
x(t)
t
h
ANALOGIQUE        NUMÉRIQUE  
FIG. 5 – Synopsis du système de régulation. 
3 Validation du système pour l’internalisation cellulaire 
Les résultats présentés dans ce qui suit concernent la transfection de cellules AT2 de rats (tumeur de 
Dunning). Il s’agit de cellules adhérentes en culture qui sont mises en suspension avant insonification. 
3.1 Internalisation de marqueurs quantum dots 
Dans une première approche, on s’est intéressé à l’internalisation de marqueur de type quantum dots (QDots), 
qui sont des marqueurs fluorescents colloïdaux non organiques de taille nanométrique qui présentent 
l’avantage d’être opaques aux électrons et que nous avons donc pu visualiser à l’intérieur des cellules au 
microscope électronique. En outre, leur petite taille facilite l’internalisation.  
Les résultats ci-après (figure 6) présentent l’évolution de l’internalisation des QDots au cours du temps en 
fonction d’une consigne associant le niveau de cavitation IDC et sa durée d’application. L’évaluation des 
taux de mortalité (par le marqueur Sytox G) et des cellules marquées par les QDots est réalisée par 
cytométrie en flux respectivement sur les bandes fréquentielles lumineuses FL1 et FL3. Les effets de la 
cavitation sont observés immédiatement après irradiation à J0, le lendemain à J1 et le surlendemain J2. Il est 
noté, pour certains milieux irradiés, une reprise nette de la croissance cellulaire à J1 qui se confirme pour 
l’ensemble des milieux à J2. Les cellules en présence de QDots sont fortement marquées à J0 (FL3). Ce 
marquage tend à disparaître à l’image du milieu témoin pour les milieux faiblement irradiés. La présence de 
20
16
12
8
4
0In
di
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ca
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(3)
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(2) 
19ème Congrès Français de Mécanique                                                                                       Marseille, 24-28 août 2009 
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cellules marquées persiste dans les milieux ayant subi une forte irradiation. A un niveau de cavitation de 
IDC=20, il est ainsi noté près de 90% de cellules vivantes marquées à J2. Cette internalisation est confirmée 
par les images issues de microscopie électronique (figure 7). On identifie clairement des agglomérats de 
QDots sur la face externe mais aussi sur la face interne de la paroi cellulaire. Pour ce niveau de cavitation, il 
est aussi noté un taux de mortalité important (supérieur à 60%). 
a) Mortalité cellulaire (milieu avec QDots) 
0
10
20
30
40
50
60
70
80
10 30 30
20 18 16
t(s)
CIa
M
or
ta
lit
é 
(%
)
J0 J1 J2
 
b) Taux d’internalisation intracellulaire des QDots 
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
10 30 30
20 18 16
t(s)
CIa
In
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rn
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n 
(%
)
J0 J1 J2
 
FIG. 6 – Taux de mortalité cellulaire et taux d’internalisation de QDots 
pour différentes conditions expérimentales indiquées sous les graphes 
(différentes durées d’insonification t et différents niveaux de cavitation IDC). 
  
FIG. 7 – Visualisation au microscope électronique d’une cellule après internalisation ultrasonore de Qdots. 
A gauche, vision globale de la cellule ; à droite, détail de la paroi cellulaire. 
3.2 Transfection génique 
Des essais de transfection ont été réalisés sur les cellules AT2 en utilisant le plasmide DsRed2. Lorsque ce 
gène s’exprime au sein d’une cellule, il génère une fluorescence rouge. Les cellules vivantes transfectées 
sont ainsi directement repérables et peuvent être comptées par cytométrie en flux. 
Nos mesures montrent une augmentation monotone du taux de transfection avec le niveau de cavitation 
(figure 8). On note également une dispersion modérée des points autour de la courbe de régression, ce qui 
met en avant le caractère déterministe de la relation entre transfection et cavitation. Le taux de mortalité suit 
une loi similaire au taux de transfection. Ces résultats indiquent que la régulation de la cavitation permet 
d’obtenir des taux de transfection et de mortalité relativement stables et reproductibles, contrairement à ceux 
obtenus lors d’irradiation à intensité acoustique constante proche du seuil de cavitation inertielle. Cependant 
pour les forts taux de transfection, la mortalité reste élevée malgré la régulation (figure 8), mettant peut-être 
en évidence une limite de la transfection ultrasonore si la mortalité et la transfection s’avéraient procéder 
exactement de la même cause physique. 
IDC IDC
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  6
 
3 Essais Red (tir 60 sec)
y = 0.17x2 - 0.12x
R2 = 0.93
y = 0.09x2 - 0.27x
R2 = 0.93
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 5 10 15 20 25
IDC
T
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n 
(%
)
0
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M
or
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é 
(%
)
Transfection Mortalité J0
 
FIG. 8 – Taux de transfection du plasmide DsRed2 (losange) et mortalité cellulaire à J0 (carré) 
pour 16 valeurs différentes de l’indice de cavitation IDC. 
4 Discussion et conclusion 
La cavitation reste un phénomène très aléatoire dont l’apparition et le maintien au sein d’un milieu 
dépendent d’un grand nombre de facteur, en particulier sa température, sa viscosité, et surtout la présence de 
particules diverses et de microbulles jouant le rôle de germes de cavitation. Un système de régulation du 
niveau de cavitation a été spécifiquement élaboré afin de mieux maîtriser ce phénomène, avec pour objectif 
l’application à la transfection ultrasonore in vitro. Ce système a été validé pour l’internalisation de 
marqueurs QDots et de plasmide DsRed2 sur des cellules AT2. Des taux d’internalisation importants sont 
atteints de façon reproductible. La régulation de cavitation semble donc bien jouer son rôle en empêchant les 
bouffées intempestives de cavitation inertielle intense qui peuvent survenir quand on travaille à intensité 
acoustique constante et qui sont la cause d’une mortalité cellulaire accrue. En outre, le niveau de cavitation 
apparaît comme un paramètre plus pertinent que l’intensité acoustique pour fixer un compromis entre 
transfection et mortalité. La mise en œuvre de ce procédé de régulation de cavitation en présence d’agents de 
contraste ultrasonores et en utilisant une excitation ultrasonore focalisée pulsée est maintenant envisagée 
pour permettre d’évaluer sa possible application in vivo. 
Remerciements 
Ces travaux ont été soutenus par l’Association Française de Myopathie et bénéficient d’une subvention de 
l’Agence Nationale de la Recherche (ANR06-BLAN0405). Les auteurs remercient S. Chesnais pour les 
cultures cellulaires, ainsi que C. Vanbelle de la plateforme d’imagerie de l’IFR62 et L. Alberti du Centre 
Léon Bérard de recherche contre le cancer pour leur aide concernant les essais biologiques.  
References 
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cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading, Proc Natl Acad Sci USA 84, 8463-8467, 
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mammalian cells, Human Gene Ther 7, 1339-1346, 1996. 
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acoustic noise power measurement, J Acoust Soc Am 108, 2012, 2000. 
 
Transfection 
Mortalité 


Régulation acoustique de la cavitation ultrasonore pour la transfection

            cellulaire in vitro.

http://documents.irevues.inist.fr/bitstream/2042/36598/1/667.pdf

Régulation acoustique de la cavitation ultrasonore pour la transfection cellulaire in vitro.

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