Le phénomène de sonoporation est intimement lié à l'interaction entre une cellule et une bulle de cavitation. Pour obtenir une information sur le caractère spatial de la cavitation ultrasonore générée, et en vue de la transfection de cellules adhérentes dans un puits de culture biologique, cette étude vise à caractériser le champ acoustique et le streaming dans une cavité non rectangulaire. Pour ce faire, des particules fluorescentes (3µm) sont utilisées sous microscope et permettent de quantifier le champ de déplacement au voisinage de la paroi

BÉRA, Jean-Christophe

INSERRA, Claude

MESTAS, Jean-louis

SABRAOUI, Abbas

VANBELLE C.

I-Revues

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 Congrès Français de Mécanique                                                                  Besançon, 29 août au 2 septembre 2011 
 
1 
 
Streaming acoustique dans un puits de culture cellulaire : 
application à la sonoporation 
 
A. Sabraoui, C. Inserra, C. Vanbelle, J.-L. Mestas, J.-C. Béra 
INSERM, U1032, Lyon F-69003, France; Université de lyon 1, Lyon F-69003, France 
 
 
Resumé  
 
Le phénomène de sonoporation est intimement lié à l’interaction entre une cellule, des micro-écoulements et 
une bulle de cavitation. Pour obtenir une information sur ces écoulements générés par les ultrasons et en 
vue de la transfection de cellules adhérentes dans un puits de culture biologique, des visualisations optiques 
ont été réalisées sur une cavité approximativement rectangulaire correspondant à un puits de culture 
soumise à un champ ultrasonore. Pour ce faire, des particules fluorescentes (2 µm) sont utilisées sous 
microscope et permettent de quantifier le champ de déplacement fluide dans le milieu et les micro-
écoulements au voisinage des bulles. Pour les faibles intensités ultrasonores (0,48 W/cm
2
), on observe des 
écoulements stationnaires et reproductibles, et les particules se déplacent à une vitesse qui peut atteindre 6 
mm/s (au milieu du puits). Pour les fortes intensités ultrasonores (3,34 W/cm
2), un effet d’attraction et 
d’éjection des particules est remarqué autour des bulles de cavitation. 
 
Abstract 
 
The sonoporation phenomenon is closely related to the interaction between cells, microflows and cavitation 
bubbles.  To get information about flow generated by ultrasound and in the scope of adherent cell 
transfection in culture, visualizations were carried out in an approximately rectangular cavity corresponding 
to a cell well submitted to ultrasound. In this aim, fluorescent particles are visualized under microscope, to 
quantify the fluid displacement and the microstreaming near cavitation bubbles. For low ultrasound intensity 
(0.48 W/cm²), stationary and reproducible flows were observed with local velocity up to 6 mm/s (in the 
middle of the well). For high ultrasound intensity (3.34 W/cm²), an effect of attraction and ejection of 
microparticles is noticed around the cavitation bubbles. 
Mots clés : streaming acoustique, cavitation ultrasonore, sonoporation. 
1    Introduction  
L’utilisation des ultrasons pour la thérapie a énormément progressé ces dernières décennies et le 
développement de nouvelles technologies ouvre de nouvelles perspectives dans le domaine de la thérapie par 
cavitation ultrasonore. Il a été démontré que les ultrasons augmentent la perméabilité membranaire des 
cellules, permettant notamment le transfert de gène. Ce phénomène est appelé sonoporation [1]. Il est 
communément admis que le principal mécanisme de la sonoporation est étroitement lié avec le phénomène 
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2 
 
de cavitation acoustique [2, 3, 4]. De plus, la propagation d’ondes acoustiques dans un milieu peut entrainer 
la création d’écoulements, phénomène connu sous le nom de streaming acoustique [5]. Dans notre étude 
nous nous intéressons à caractériser ces écoulements dans un puits de culture cellulaire et nous cherchons 
aussi à appréhender l’effet de la présence des bulles de cavitation sur les micro-écoulements. Pour ce faire, 
des microparticules fluorescentes sont diluées dans 2 ml d’eau et sont observées par microscopies 
photoniques; ces particules vont se déplacer en suivant le milieu liquide. Différentes intensités ultrasonores 
sont appliquées, une faible intensité ultrasonore de 0,48 W/cm
2
 (sans bulles de cavitation) pour évaluer le 
champ acoustique, et une forte intensité ultrasonore de 3,34 W/cm
2
 pour voir l’effet des bulles de cavitation 
sur le déplacement des particules.  
 
2    Matériels et méthodes 
2.1   Système d’irradiation ultrasonore 
Le système d’irradiation est composé de 2 transducteurs piézo-électriques plans (fréquence : 405 kHz ; 
dimension : 20 x 3,5 mm). Ces transducteurs électriquement connectés en parallèle et adaptés à 50 Ω sont 
excités par un signal sinusoïdal continu issu d’un générateur de fonction (HP33120 Agilent), amplifié par u 
module d’amplification de puissance (20 W). Les puissances électriques appliquées sont comprises entre 
0,25 W et 3 W, ces limites correspondant à des intensités acoustiques mesurées en champ libre par la 
méthode de pesée acoustique sur un transducteur de respectivement 0,24 W/cm
2
 et 1,67 W/cm
2
. 
Les milieux à exposer sont placés dans des puits d’une plaque de culture en polystyrène (2 puits; puits de 
base carrée de côté 20 mm, et de parois obliques rentrantes avec un angle de 6°). Le puits est disposé entre 
les 2 transducteurs dans son champ proche (figure 1), le couplage utilisé est le gel échographique. La hauteur 
de liquide dans le puits est d’environ 5 mm, correspondant à un volume de liquide de 2 ml. 
Ressort
Puits de culture
Support PVC
Transducteur
air
Couplage
gel
 
FIG. 1 – Schéma du dispositif expérimental 
Perpendiculairement aux axes acoustiques des transducteurs est fixé un hydrophone (bande passante : 10 
MHz). Il permet l’écoute du bruit de cavitation dans le milieu exposé. Le signal de réception est numérisé 
(carte d’acquisition PXI-5620, résolution 14 bits, fréquence d’échantillonnage 64 MHz, National 
Instruments
®
), transféré sur le calculateur (PC + Labview), puis traité. Ce traitement consiste, dans un 
premier temps, à déterminer le spectre instantané dans la bande de 0,1 à 7.1 MHz, comme indiqué dans une 
précédente étude [7]. Ce système d’écoute va nous permettre de vérifier la présence des bulles de cavitation 
(stable ou inertielle) dans le milieu en analysant les spectres instantanées du signal.  
 
 
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2.2    Système de visualisation 
Deux systèmes de microscopie photoniques sont utilisés pour observer les micro-écoulements dans le puits 
de culture. Ce puits est rempli de 2 ml d’eau distillée dans lesquels sont ajoutés 5 µl de solution de 
microsphères fluorescentes (SPHERO
TM
, particules de diamètre 2,13 ± 0,05 µm). Deux types d’observation 
sont effectués : 
- des mesures par microscopie à épifluorescence (objectif x 2,5 ; épaisseur du plan de visualisation 1.3 µm), 
qui permettent de ne visualiser que les microparticules et de mesurer les vitesses du fluide, avec une 
résolution de 400 nm ; afin de visualiser suffisamment finement les écoulements, on travaille sur des champs 
de 1,7x1,3 mm, ce qui pour une image de 696x520 pixels fournit une résolution spatiale de 2.4 µm ; 
- des mesures par microscopie confocale à fluorescence (épaisseur du plan de visualisation 0,7 µm), couplées 
à des mesures en transmission en champ clair (épaisseur du plan de visualisation de 6 µm), qui permettent de 
visualiser simultanément les microparticules et les bulles de cavitation. 
Dans la présente étude, on s’intéresse aux écoulements dans le puits de culture et plus particulièrement aux 
micro-écoulements liés aux bulles au voisinage du fond de puits, qui est la zone qui nous intéresse pour 
l’application finale visée : l’objectif est d’étudier les mécanismes de sonoporation et  de transfection sur des 
cellules adhérentes qui seraient  attachées sur cette paroi inférieure du puits. 
Pour les mesures de vitesse, le système de vidéo-acquisition est utilisé pour réaliser des films avec une 
cadence d’image de 8 Hz. Le temps d’ouverture de l’objectif est de la moitié de la période entre deux 
images. 
 
2.3    Méthode d’analyse des images 
Des films sont réalisés en différentes positions du plan d’analyse. La comparaison des images des particules 
sur une même position permet d’étudier le caractère stationnaire des écoulements. 
Dans le cas d’un écoulement à caractère stationnaire et reproductible (cas des faibles intensités acoustiques), 
une caractérisation du champ global est effectuée par un balayage du plan d’observation. Afin d’alléger les 
mesures, on peut se contenter de ne scanner qu’un quart du plan en raison des symétries du problème. La 
figure 2 décrit la méthode d’investigation. Sur chaque secteur d’observation correspondant à un petit carreau 
sur la figure, est effectuée une vidéo de 51 images (de durée totale 6 secondes). A partir de cette vidéo, on 
peut obtenir simplement une visualisation des lignes de courant en prenant sur chaque pixel la valeur 
maximale d’intensité lumineuse obtenue sur les 51 images. En assemblant ces 8x11 images on reconstitue 
l’allure de l’écoulement global. 
 
a) Image instantanée
B
Transducteur
Puits
Axe de symétrie
A B
C D
T1
T2
b) Image d’intensités
maximales
Transducteur
Compilation de 51 images 
instantanées
Concaténation 
de 88 images
c) Principe de balayage du puits
 
FIG. 2 – Méthode d’acquisition d’un plan complet de visualisation. 
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4 
 
Pour évaluer les vitesses des particules, deux méthodes sont utilisées. Tout d’abord, pour calculer les faibles 
vitesses, une évaluation manuelle peut être réalisée sur les images des maxima d’intensité, en suivant la 
formule : (distance entre 2 points) / (temps entre 2 images). Prenons l’exemple de la figure 4a, la distance 
entre 2 points est de 0,018 mm, le temps entre 2 images est de 120 ms ;  donc la vitesse est de l’ordre de 0.15 
mm/s près de la paroi du puits. 
 
a)   b)  
FIG. 3 – Principes des mesures de vitesse de déplacement : 
a) image compilée d’un film (exemple d’une particule se déplaçant à faible vitesse), 
b) image instantanée (exemple d’une particule se déplaçant à forte vitesse). 
 
Cette vitesse augmente lorsqu’on s’éloigne des parois latérales du puits, et les particules vont apparaitre sous 
forme de traits sur les images instantanées. Dans la mesure où la particule se déplace dans le plan 
d’observation (ce qui est généralement observé, avec des traits qui sont d’intensité approximativement 
uniforme), les vitesses peuvent être évaluées sur les images instantanées en suivant la formule : (longueur du 
trait) / (temps d’ouverture de la caméra). Prenons l’exemple de la figure 4b, la longueur du trait est de 0.35 
mm ; le temps d’ouverture de la camera est 60 ms ; donc la vitesse est d’environ 6 mm/s. 
 
3    Résultats  
3.1   Streaming à faible intensité ultrasonore 
Pour des très faibles intensités ultrasonores (inférieures à 0,15 W/cm²), aucun effet significatif de la présence 
des ultrasons n’est observé. Pour des intensités modérées (0,48 W/cm²), on constate qu’après 2 à 3 secondes 
de régime transitoire, il s’établit des écoulements quasi-stationnaires et approximativement reproductibles 
entre les acquisitions. Dans ce cas, on peut étudier le streaming global présent dans le puits (figure 4).  
a)       b)
10
0
X ( mm)
Y
 (
 m
m
)
1
0
1 mm 
λ = 3,7 mm
 
FIG. 4 – Visualisation de l’écoulement sur le plan situé à 1 mm du fond de puits : 
a) images assemblées du quart du puits, b) allure de l’écoulement correspondant. 
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5 
 
Dans certaines zones, on remarque l’existence de tourbillons (figure 5.a). Globalement, on constate que les 
trajectoires sont dans le plan de l’observation ; cependant, on observe des points de singularité du champ au 
voisinage desquels des particules sortent du plan d’observation (figure 5.b). 
 
a)    b)   
FIG. 5 – Exemples d’images compilées obtenues (1,7x1.3 mm) : 
a) tourbillon, b) singularité du champ bidimensionnel. 
 
3.2   Écoulements à forte intensité ultrasonore 
Une seconde série d’expériences a été réalisée en appliquant une forte intensité ultrasonore (3,34 W/cm2). 
Les mesures acoustiques de cavitation mettent en évidence par un bruit large bande la présence de bulles qui 
implosent. Les visualisations en fluorescence font apparaître des écoulements instationnaires, et les 
visualisations en transmission montrent la présence de nombreuses bulles. On s’intéresse tout 
particulièrement au fond du puits où l’interaction entre les bulles et le milieu nous intéresse le plus pour une 
application à la transfection de cellules adhérentes. On observe des bulles sur la paroi inférieure du puits : 
leur distribution est inhomogène et instationnaire mais leur durée de vie peut être de l’ordre de plusieurs 
secondes et leur mouvement peut rester faible, ce qui permet de les suivre visuellement. 
Pour mettre en évidence les micro-écoulements liés à une bulle de cavitation, il a été effectué simultanément 
des visualisations confocales (pour détecter les particules fluorescentes) et des visualisations en transmission 
(pour détecter les bulles de cavitation). La figure 6 montre des images instantanées d’une même bulle de 
cavitation. Comme on le voit sur la figure 6a, les particules fluorescentes vont être attirées par la bulle de 
cavitation, pour être ensuite projetées sous forme de paquets tout autour de la bulle (cf. fig. 6b). Dans le cas 
de cette bulle, le rythme est maintenu jusqu'à la fin de l’irradiation. 
 
 
a) b)
 
FIG. 6 – Images instantanée d’une bulle de cavitation entourée de microparticules : 
a) effet d’attraction des particules autour de la bulle ; 
b) un jet des particules dans le sens d’implosion de la bulle. 
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6 
 
On remarque que les bulles de cavitation présentes dans le milieu ont une taille moyenne comprise entre (7 et  
10 μm), ce qui correspond à la taille moyenne de la bulle en théorie suivant l’équation simplifiée : feau. Reau = 
3, avec f = 0.4 MHz et  Reau= 7,5 μm. 
Les bulles de cavitation ont un effet apparent d’attraction sur les particules fluorescentes, qui se trouvent 
ensuite projetées dans le milieu. En réalité, il s’agit d’observations très sous-échantillonnées : le temps 
d’acquisition d’une image confocale est approximativement de 33 ms, soit plus de 13000 périodes 
ultrasonores. La pulsation volumique des bulles n’apparaît donc pas sur les films réalisés. On peut supposer 
que certaines bulles implosent et émettent des microjets de gaz de grande vitesse permettant la dispersion des 
particules dans la direction du microjet. Si une bulle implose, elle va former des germes dans le milieu qui 
vont évoluer en quelques cycles (soit en une dizaine de microsecondes) pour reformer une nouvelle bulle de 
cavitation. Compte tenu du sous-échantillonnage, on peut avoir l’impression d’avoir toujours la même bulle, 
avec des jets de particules dans différentes directions. Pour certaines bulles, on observe l’émission d’un 
nuage de particules dans un petit angle directionnel (comme sur la figure 6b) ; dans d’autres cas, les 
particules semblent projetées alternativement dans toutes les directions, ce qui pourrait correspondre à une 
succession de microjets très directionnels. 
4    Conclusion  
L’objectif de cette  étude était de caractériser les écoulements dans un puits de culture cellulaire microscopie 
photonique, dans le but d’obtenir des informations sur les micro-écoulements générés par les ultrasons dans 
la zone où devront se trouver les cellules à transfecter. Pour les faibles intensités ultrasonores, alors qu’il n’y 
a pas de cavitation, on peut observer des écoulements stationnaires et reproductibles, qui augmenteront le 
mélange au sein du milieu. Pour les fortes intensités, alors qu’il y a de la cavitation inertielle, les 
écoulements deviennent instationnaires et des écoulements intenses sont mis en évidence au voisinage des 
bulles. D’après ces observations, on peut dire que la présence des bulles de cavitation dans un milieu 
cellulaire n’a pas juste un effet sur la membrane de la cellule, mais aussi peut aider à une meilleure 
distribution des produits à transfecter dans le milieu (sous l’effet des micro-écoulements et tout 
particulièrement des microjets). 
Des mesures avec une caméra rapide pourraient permettre de mieux cerner les micro-écoulements 
instantanés autours des bulles de cavitation. D’ores et déjà nos résultats permettent d’envisager des tirs sur 
cellules sous microscope avec le système d’irradiation ultrasonore présenté ici. Concernant l’efficacité de la 
transfection, la distribution des bulles dans le milieu reste à optimiser. 
 
Références 
[1] Bailey M.R., Khokholova V.A., Sapozhnikov O.A., Kargl S.G., Crum L.A., "Physical mechanisms of the 
therapeutic effect of ultrasound", Acoustical Physics, 49(4):369-388 (2003). 
[2] El Maalouf J., Béra JC., Alberti L., Cathignol D., Mestas J.-L., "In vitro sonodynamic cytotoxicity in 
regulated cavitation conditions", Ultrasonics, 49(2):238-43 (2009). 
[3] Reslan L., Mestas J.-L., Herveau S., Béra JC., Dumontet C., "Transfection of cells in suspension by 
ultrasound cavitation ", J. Control Release  ;142(2):251-258. (2010). 
[4] Hallow DM., Mahajan AD., McCutchen TE., Prausnitz MR., "Measurement and correlation of acoustic 
cavitation with cellular bioeffects", Ultrasound Med. Biol., 32(7):1111-22 (2006). 
[5] Barnett SB., Kossof G., "Acoustic streaming and radiation pressure in diagnostic applications: what are 
the implications? Safety of diagnostic ultrasound". New York: Parthenon, 1998:87-98. 
[6] Miller DL., Song J., "Tumor growth reduction and DNA transfer by cavitation-enhanced high-intensity 
focused ultrasound in vivo", Ultrasound Med. Biol., 29(6):887-93 (2003). 
[7] Sabraoui A., Béra JC., Inserra C., Mestas J.-L.,”Feedback loop process to control acoustic cavitation: 
experimental evidence”, Ultrasonics sonochemistry, 18(2):589-594 (2010). 


Streaming acoustique dans un puits de culture cellulaire : application à la sonoporation

http://documents.irevues.inist.fr/bitstream/2042/46427/1/cfm2011_686.pdf

Streaming acoustique dans un puits de culture cellulaire : application à la sonoporation

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