113 research outputs found
Structural and functional aspects of site-specific IGF-II mRNA cleavage
Het humane insuline-achtige groeifactor II (IGF-II) speelt een belangrijke rol
bij de embryonale ontwikkeling en is geassocieerd met tumorgroei. In gekweekte
cellen kan IGF-II diverse effecten veroorzaken, afhankelijk van het celtype waarin
het tot expressie komt, zoals groeistimulatie, of juist remming van groei en
stimulatie van celdifferentiatie. Terwijl IGF-II een overlevingsfactor is in sommige
systemen, induceert het in andere celtypes juist geprogrammeerde celdood
(apoptose). IGF-II is dus betrokken bij diverse fysiologische processen, en het is
derhalve waarschijnlijk dat IGF-II genexpressie nauwkeurig gereguleerd wordt.
Inderdaad vindt er op verscheidene niveaus regulatie plaats; op het niveau van
transcriptie (i.e. synthese van het ´boodschapper´ mRNA) door middel van
ontwikkelings- en weefselspecifieke activiteit van vier verschillende promoters (i.e.
de startplaats van transcriptie)(P1-P4) in het IGF-II gen. Transcriptie vanaf deze
promoters leidt tot de vorming van mRNA moleculen die onderling verschillen in de
lengte en samenstelling van hun 5´ onvertaalde deel (5-UTR). Dit leidt vervolgens
tot verschillen in de translatie (eiwitproductie)-efficiëntie van deze mRNAs en
genereert de mogelijkheid om IGF-II expressie te reguleren op het niveau van
translatie. Verder is nog bekend dat IGF-II expressie gereguleerd wordt op het
niveau van post-translationele bewerking van het IGF-II eiwit.
Tijdens de karakterisering van het humane IGF-II gen en de IGF-II mRNAs
werd een RNA met een grootte van 1.8 kb gedetecteerd dat co-lineair is met het 3
uiteinde van het IGF-II gen. Dit RNA bleek gevormd te worden door plaats-specifieke
endonucleolytische klieving in het 3 onvertaalde deel (3-UTR) van de
IGF-II mRNAs en niet door transcriptie vanaf een extra promoter. Het 1.8 kb RNA
vertegenwoordigt dus het 3 klievingsproduct; het bestaat uit 3-UTR sequentie en
een poly(A) staart, en is zeer stabiel. Klieving van de IGF-II mRNAs genereert ook
een 5 klievingsproduct, hetgeen de IGF-II coderende sequentie bevat. Dit 5
klievingsproduct is in tegenstelling tot het 1.8 kb 3 klievingsproduct onstabiel, en
wordt niet meer getransleerd. Deze observaties hebben geleid tot de hypothese dat
klieving van de IGF-II mRNAs kan fungeren als een additioneel mechanisme om
IGF-II genexpressie te reguleren.
Begonnen werd met het in kaart brengen van de RNA gebieden die nodig zijn
voor in vivo klieving. Hiertoe werden deleties aangebracht in een IGF-II minigen in
een expressieplasmide voor transfectie-studies. Deze experimenten toonden aan dat
er twee gebieden in de IGF-II 3-UTR nodig zijn voor klieving: een sequentie van
323 nucleotiden rondom de klievingsplaats (element II), en een sequentie van 104
nucleotiden lang dat 2013 nucleotiden stroomopwaards gelegen is (element I).
RNA-vouwings-studies lieten vervolgens zien dat element I, dat zeer rijk is aan
C-nucleotiden, een stabiele duplex kan vormen met een G-rijk stroomafwaards
gelegen gebied in element II. Direct stroomopwaards van de klievingsplaats in
element II kunnen twee haarspeldlussen gevormd worden, en de klievingsplaats
zelf wordt vooorspeld in een interne lus gelegen te zijn. De RNA gebieden die nodig
zijn voor klieving kunnen dus onderverdeeld worden in drie verschillende
vouwingsdomeinen: (1) het duplex domein, gevormd door de interactie tussen nucleotiden -2108/-2029 (posities ten opzichte van de klievingsplaats) van element I
en +18/+101 van element II, (2) het haarspeldlussen domein in het stroomopwaards
gelegen deel (posities -133 tot -7) van element II, en (3) het klievingsplaatsdomein,
gevormd door nucleotiden -161/-136 en -6/+16, met de klievingsplaats gelegen in
een interne lus.
De studies beschreven in dit proefschrift begonnen met pogingen om eiwitten
te identificeren die specifiek aan de hierboven beschreven RNA gebieden binden, en
zo een rol zouden kunnen spelen bij klieving (Hoofdstuk 3). Hiertoe werden in vitro
gesynthetiseerde RNA moleculen die deze gebieden bevatten geïncubeerd met
extracten van humane Hep3B cellen, die endogeen IGF-II tot expressie brengen. Dit
leverde een specifiek RNA-eiwit complex op dat alleen gevormd wordt in de
aanwezigheid van het haarspeldlussen domein. Met behulp van puntmutaties werd
de bindingsplaats van het eiwit nauwkeurig in kaart gebracht. Het complex bleek
gevormd te worden halverwege de eerste van de twee haarspeldlussen. Wanneer
puntmutaties die de eiwitbinding verstoren in het IGF-II minigen werden
geïntroduceerd, leverde dit een gematigde reductie in klievingsefficientie op,
hetgeen suggereert dat het RNA-eiwitcomplex niet essentieel is voor klieving, maar
een modulerende rol in klieving zou kunnen hebben.
Hoofdstuk 3 beschrijft ook experimenten waarin het belang van de
nucleotiden rondom de klievingsplaats voor klieving werd onderzocht. Verscheidene
puntmutaties werden geïntroduceerd rondom de klievingsplaats in het IGF-II
minigen, en het effect hiervan op de in vivo klievingsefficientie werd onderzocht. De
resultaten tonen duidelijk aan dat de identiteit van specifieke nucleotiden rondom de
klievingsplaats zeer belangrijk is, omdat vrijwel alle puntmutaties de klieving
ernstig verstoren. De nucleotiden in het gebied direct naast de klievingsplaats van
posities 6 tot +16 lijken belangrijker te zijn dan de nucleotiden in het hier
tegenover liggende deel van posities -161 tot 136. Interessant genoeg is dit gebied
ook duidelijk meer geconserveerd in de evolutie, hetgeen het belang van deze
nucleotiden voor klieving onderstreept.
Hoofdstuk 4 beschrijft verdere experimenten om meer inzicht te krijgen in de
rol van de verschillende RNA vouwingsdomeinen in klieving. Verscheidene deleties
werden geïntroduceerd in het haarspeldlussen domein en de effecten op de
voorspelde RNA vouwing en in vivo klievingsefficiëntie werden bestudeerd. Hieruit
bleek dat alle deleties die de voorspelde RNA vouwing veranderen ook de klieving
vrijwel volledig verstoren. Deleties die de wild type RNA vouwing intact laten
hebben echter een veel minder drastisch effect op klieving, hetgeen aangeeft dat een
specifieke vouwing rondom de klievingsplaats belangrijk is. Het haarspeldlussen
domein is op zichzelf niet nodig voor klieving, omdat het geheel verwijderd kan
worden zonder de klieving drastisch te verstoren, zolang de vouwing rondom de
klievingsplaats maar intact blijft. Dit blijkt uit de resultaten met een mutant (D-135/-18)
waarbij het gehele haarspeldlussen domein verwijderd is; deze mutant laat een
redelijke klievingsefficientie zien van 47% van de wild type. Een opvallend resultaat
echter werd verkregen met een mutant waarbij op een deel van de tweede
haarspeldlus na het gehele haarspeldlussendomein verwijderd was (D-135/-72,D-60/-18).
Hoewel de klievingsplaats zich bij deze mutant in de voorspelde wild type configuratie bevindt, is de klievingsefficiëntie ernstig verstoord. Dit resultaat gaf
aanleiding de computervoorspelling van de RNA-vouwing te verifiëren door middel
van biochemische structuuranalyse van het RNA (Hoofdstuk 4). De resultaten van
deze studies suggereren dat zowel in het wild type RNA als in mutant D-135/-18 de
nucleotiden in de lus rondom de klievingsplaats niet ongepaard zijn, maar betrokken
bij niet-Watson-Crick interacties, hetgeen een specifieke conformatie genereert. In
mutant D-135/-72,D-60/-18 echter, gedragen deze nucleotiden zich als vrij in
oplossing. Deze resultaten suggereren dat een specifieke conformatie, gevormd door
niet-Watson-Crick interacties, belangrijk is voor klieving. In overeenstemming met
deze hypothese werd gevonden dat puntmutaties rondom de klievingsplaats die de
klieving verstoren ook de conformatie rondom de klievingsplaats veranderen in
tegenstelling tot mutaties die geen effect hebben op klieving.
Hoofdstuk 5 laat experimenten zien die uitgevoerd zijn om meer inzicht te
verkrijgen in de fysiologische functie van klieving van IGF-II mRNA. De kinetiek
van klieving en de rol van klieving in de afbraak van IGF-II mRNA en
eiwitproductie werd getest met behulp van IGF-II constructen onder controle van
een tetracycline-induceerbare promoter. De niveaus van het IGF-II mRNA en het 3´
klievingsproduct werden bepaald door Northern blot analyse. Na inductie van
transcriptie werd een snelle toename gezien van de niveaus van het IGF-II mRNA;
de niveaus van het 3´ klievingsproduct begonnen pas geruime tijd later toe te nemen,
hetgeen aangeeft dat klieving een traag proces is. In het omgekeerde experiment
waarbij de transcriptie werd geremd, werd de afbraaksnelheid van wild type IGF-II
mRNA vergeleken met de afbraaksnelheid van mutant IGF-II mRNA dat niet meer
gekliefd wordt. Beide mRNAs werden met dezelfde snelheid afgebroken. Ook op
het niveau van eiwitsynthese werd geen significant verschil gezien tussen het wild
type IGF-II mRNA en de gemuteerde versie. Deze resultaten laten zien dat in het
gebruikte testsysteem klieving een gering effect heeft op mRNA afbraak en ook op
eiwitsynthese.
Regulatie van klieving onder invloed van externe factoren werd onderzocht in
humane Hep3B cellen, die endogeen IGF-II tot expressie brengen en het mRNA
klieven. Het effect van verscheiden externe factoren op de efficientie van klieving
werd getest. De invloed van trichostatine A (TSA), een histon deacetylase remmer,
dexamethason, een synthetisch glucocorticoïde, aan- of afwezigheid van serum
(groeifactoren) in het medium, en celdichtheid werden onderzocht. De verkregen
resultaten suggereren dat TSA, dexamethason, en serum geen invloed hebben op
klieving. Celdichtheid echter, heeft wel effect op klieving; bij een toename van de
celdichtheid werd een toename van de niveaus van het 3´ klievingsproduct
waargenomen, terwijl de niveaus van het volle lengte IGF-II mRNA gelijkbleven of
afnamen, afhankelijk van de frequentie van medium verversing. We hebben dus
waargenomen dat klieving in Hep3B cellen gereguleerd wordt afhankelijk van de
dichtheid van de cellen. De betekenis van de toename van klieving bij hoge
celdichtheid is echter niet duidelijk. De ongebruikelijke stabiliteit van het 3´
klievingsproduct, die waarschijnlijk veroorzaakt wordt door de geconserveerde G-rijke
sequentie aan het 5´uiteinde, maakt het aantrekkelijk te speculeren dat dit RNA wellicht een intrinsieke functie vervult in de cel. Het zal interessant zijn deze
mogelijkheid experimenteel te testen
Ultrasound markers for prediction of complex gastroschisis and adverse outcome: longitudinal prospective nationwide cohort study
Objectives: To identify antenatal ultrasound markers that can differentiate between simple and complex gastroschisis and assess their predictive value. Methods: This was a prospective nationwide study of pregnancies with isolated fetal gastroschisis that underwent serial longitudinal ultrasound examination at regular specified intervals between 20 and 37 weeks' gestation. The primary outcome was simple or complex (i.e. involving bowel atresia, volvulus, perforation or necrosis) gastroschisis at birth. Fetal biometry (abdominal circumference and estimated fetal weight), the occurrence of polyhydramnios, intra- and extra-abdominal bowel diameters and the pulsatility index (PI) of the superior mesenteric artery (SMA) were assessed. Linear mixed modeling was used to compare the individual trajectories of cases with simple and those with complex gastroschisis, and logistic regression analysis was used to estimate the strength of association between the ultrasound parameters and outcome. Results: Of 104 pregnancies with isolated fetal gastroschisis included, four ended in intrauterine death. Eighty-one (81%) liveborn infants with simple and 19 (19%) with complex gastroschisis were included in the analysis. We found no relationship between fetal biometric variables and complex gastroschisis. The SMA-PI was significantly lower in fetuses with gastroschisis than in healthy controls, but did not differentiate between simple and complex gastroschisis. Both intra- and extra-abdominal bowel diameters were larger in cases with complex, compared to those with simple, gastroschisis (P < 0.001 and P < 0.005, respectively). The presence of intra-abdominal bowel diameter ≥ 97.7th percentile on at least three occasions, not necessarily on successive examinations, was associated with an increased risk of the fetus having complex gastroschisis (relative risk, 1.56 (95% CI, 1.02–2.10); P = 0.006; positive predictive value, 50.0%; negative predictive value, 81.4%). Conclusions: This large prospective longitudinal study found that intra-abdominal bowel dilatation when present repeatedly during fetal development can differentiate between simple and complex gastroschisis; however, the positive predictive value is low, and therefore the clinical usefulness of this marker is limited
Study of the doubly charmed tetraquark T+cc
Quantum chromodynamics, the theory of the strong force, describes interactions of coloured quarks and gluons and the formation of hadronic matter. Conventional hadronic matter consists of baryons and mesons made of three quarks and quark-antiquark pairs, respectively. Particles with an alternative quark content are known as exotic states. Here a study is reported of an exotic narrow state in the D0D0π+ mass spectrum just below the D*+D0 mass threshold produced in proton-proton collisions collected with the LHCb detector at the Large Hadron Collider. The state is consistent with the ground isoscalar T+cc tetraquark with a quark content of ccu⎯⎯⎯d⎯⎯⎯ and spin-parity quantum numbers JP = 1+. Study of the DD mass spectra disfavours interpretation of the resonance as the isovector state. The decay structure via intermediate off-shell D*+ mesons is consistent with the observed D0π+ mass distribution. To analyse the mass of the resonance and its coupling to the D*D system, a dedicated model is developed under the assumption of an isoscalar axial-vector T+cc state decaying to the D*D channel. Using this model, resonance parameters including the pole position, scattering length, effective range and compositeness are determined to reveal important information about the nature of the T+cc state. In addition, an unexpected dependence of the production rate on track multiplicity is observed
Cell and molecular biology of the exosome: how to make or break an RNA
Item does not contain fulltex
Simultaneous and selective decarboxylation of l-serine and deamination of l-phenylalanine in an amino acid mixture—a means of separating amino acids for synthesizing biobased chemicals
Amino acids (AAs) obtained from the hydrolysis of biomass-derived proteins are interesting feedstocks for the chemical industry. They can be prepared from the byproduct of biofuel production and agricultural wastes. They are rich in functionalities needed in petrochemicals, providing the opportunity to save energy, reagents, and process steps. However, their separation is required before they can be applied for further applications. Electrodialysis (ED) is a promising separation method, but its efficiency needs to be improved when separating AAs with similar isoelectric points. Thus, specific conversions are required to form product with different charges. Here we studied the enzymatic conversions which can be used as a means to aid the ED separation of neutral AAs. A model mixture containing l-serine, l-phenylalanine and l-methionine was used. The reactions of l-serine decarboxylase and l-phenylalanine ammonia-lyase were employed to specifically convert serine and phenylalanine into ethanolamine and trans-cinnamic acid. At the isoelectric point of methionine (pH 5.74), the charge of ethanolamine and trans-cinnamic acid are +1 and –1, therefore facilitating potential separation into three different streams by electrodialysis. Here the enzyme kinetics, specificity, inhibition and the operational stabilities were studied, showing that both enzymes can be applied simultaneously to aid the ED separation of neutral AAs
Synthesis of bio-based methacrylic acid by decarboxylation of itaconic acid and citric acid catalyzed by solid transition-metal catalysts
Methacrylic acid, an important monomer for the plastics industry, was obtained in high selectivity (up to 84%) by the decarboxylation of itaconic acid using heterogeneous catalysts based on Pd, Pt and Ru. The reaction takes place in water at 200–2508C without any external added pressure, conditions significantly milder than those described previously for the same conversion with better yield and selectivity. A comprehensive study of the reaction parameters has been performed, and the isolation of methacrylic acid was achieved in 50% yield. The decarboxylation procedure is also applicable to citric acid, a more widely available bio-based feedstock, and leads to the production of methacrylic acid in one pot in 41% selectivity. Aconitic acid, the intermediate compound in the pathway from citric acid to itaconic acid was also used successfully as a substrate
- …