Synthesis of an Antimicrobial Enterobactin-Muraymycin Conjugate for Improved Activity Against Gram-Negative Bacteria

Overcoming increasing antibiotic resistance requires the development of novel antibacterial agents that address new targets in bacterial cells. Naturally occurring nucleoside antibiotics (such as muraymycins) inhibit the bacterial membrane protein MraY, a clinically unexploited essential enzyme in peptidoglycan (cell wall) biosynthesis. Even though a range of synthetic muraymycin analogues has already been reported, they generally suffer from limited cellular uptake and a lack of activity against Gram-negative bacteria. We herein report an approach to overcome these hurdles: a synthetic muraymycin analogue has been conjugated to a siderophore, i. e. the enterobactin derivative EntKL, to increase the cellular uptake into Gram-negative bacteria. The resultant conjugate showed significantly improved antibacterial activity against an efflux-deficient E. coli strain, thus providing a proof-ofconcept of this novel approach and a starting point for the future optimisation of such conjugates towards potent agents against Gram-negative pathogens

HICFD – Highly Efficient Implementation of CFD Codes for HPC Many-Core Architectures

The objective of the German BMBF research project Highly Efficient Implementation of CFD Codes for HPC Many-Core Architectures (HICFD) is to develop new methods and tools for the analysis and optimization of the performance of parallel computational fluid dynamics (CFD) codes on high performance computer systems with many-core processors. In the work packages of the project it is investigated how the performance of parallel CFD codes written in C can be increased by the optimal use of all parallelism levels. On the highest level MPI is utilized. Furthermore, on the level of the many-core architecture, highly scaling, hybrid OpenMP/MPI methods are implemented. On the level of the processor cores the parallel SIMD units provided by modern CPUs are exploited

Photochemical characterization of a novel fungal rhodopsin from Phaeosphaeria nodorum

Eukaryotic microbial rhodopsins are widespread bacteriorhodopsin-like proteins found in many lower eukaryotic groups including fungi. Many fungi contain multiple rhodopsins, some significantly diverged from the original bacteriorhodopsin template. Although few fungal rhodopsins have been studied biophysically, both fast-cycling light-driven proton pumps and slow-cycling photosensors have been found. The purpose of this study was to characterize photochemically a new subgroup of fungal rhodopsins, the so-called auxiliary group. The study used the two known rhodopsin genes from the fungal wheat pathogen, Phaeosphaeria nodorum. One of the genes is a member of the auxiliary group while the other is highly similar to previously characterized proton-pumping Leptosphaeria rhodopsin. Auxiliary rhodopsin genes from a range of species form a distinct group with a unique primary structure and are located in carotenoid biosynthesis gene cluster. Amino acid conservation pattern suggests that auxiliary rhodopsins retain the transmembrane core of bacteriorhodopsins, including all residues important for proton transport, but have unique polar intramembrane residues. Spectroscopic characterization of the two yeast-expressed Phaeosphaeria rhodopsins showed many similarities: absorption spectra, conformation of the retinal chromophore, fast photocycling, and carboxylic acid protonation changes. It is likely that both Phaeosphaeria rhodopsins are proton-pumping, at least in vitro.We suggest that auxiliary rhodopsins have separated from their ancestors fairly recently and have acquired the ability to interact with as yet unidentified transducers, performing a photosensory function without changing their spectral properties and basic photochemistry

PIV Application for Investigation of the Rotor Blade Tip Interaction with a Casing Treatment in a Transonic Compressor Stage

This contribution describes the experimental investigation of the blade tip interaction with a casing treatment implemented to a transonic compressor stage using particle image velocimetry (PIV). The results obtained allowed for direct comparison with numerical simulations of the same compressor stage including the CT geometry, carried out using the DLR TRACE code following a new approach to efficiently perform time-accurate casing-treatment simulations. The single-stage transonic axial compressor was equipped with a casing treatment (CT), consisting of 3.5 axial slots per rotor pitch in order to investigate the predicted extension of the stall margin characteristics. Contrary to most other studies, the CT was designed especially accounting for an optimized optical access in the immediate vicinity of the CT, rather than giving maximum benefit in terms of stall margin extension. The nearly rectangular geometry of the CT cavities allowed one dividing bridge between two slots to be made of quartz glass with curvatures matching the casing. Thus the flow phenomena could be observed with essentially no disturbance caused by the optical access. Two periscope light sheet probes were specifically designed for this application to allow for precise alignment of the laser light sheet at three different radial positions in the rotor tip region (at 87.5%, 95% and 99% blade height). For the outermost radial position the light sheet probe was placed behind the rotor and aligned to pass the light sheet through the blade tip clearance. It was demonstrated that the PIV technique is capable of providing velocity information of high quality even in the tip clearance region of the rotor blades. Phase-constant measurements were carried out with a resolution of 8 phase angles per blade pitch in relation to the CT slots visible in the camera’s field of view. The chosen type of smoke-based seeding with very small particles (about 0.5 µm in diameter) supported data evaluation with high spatial resolution, resulting in a final grid size of 0.5 x 0.5 mm. The PIV data base established in this project forms the basis for further detailed evaluations of the flow phenomena present in the transonic compressor stage with CT and allows validation of accompanying CFD calculations using the DLR TRACE code. Based on the combined results of PIV measurements and CFD calculations of the same compressor and CT geometry a better understanding of the complex flow characteristics can be achieved

Aplication of collaborative presentation tools in ICT education

This diploma thesis addresses use of cloud computing and collaborative presentation tools in ICT education in schools. It also devotes to representative applications and their evaluation and indetifies key questions which help to chose suitable application to education. Questionnaire survey evaluates application among students and proposes activities that are effective with use of these tools. This work tracks activity of students with collaborative tools and evaluates their engagement in education. Action research watches students and their work in order to evaluate engagement in education process

Entwicklung von artifiziellen Siderophoren, antibakteriellen Wirkstoffen und Siderophor-Wirkstoff-Konjugaten gegen pathogene Bakterien

The growing number of pathogenic bacteria, resistant to commonly used antibiotics, lead to a serious threat to global health systems. Especially, Gram-negative pathogens provide big challenges in drug development due to the effective permeation barrier provided by their complex cell envelope. As a result, many potential drugs displaying an antibacterial activity against Gram-positive bacteria remain inactive against Gram-negative bacteria, although their biological targets are generally present. A smart approach to tackle this issue is based on the conjugation of antibiotics to siderophores to form siderophore-drug conjugates. Siderophores are small molecule iron chelators, possessing an active uptake mechanism over the cell envelope of Gram-negative bacteria and thereby acting as carrier for the translocation of antimicrobial drugs across the bacterial cell envelope. In the context of this work, (AcO)EntKL 147, which is an artificial analogue of the naturally occurring tris-catechol siderophore enterobactin 10, was synthesized via total synthesis and utilized for the formation of siderophore-cargo and siderophore-drug conjugates. In growth recovery assays under iron-limiting conditions, it was demonstrated that (AcO)EntKL 147 and a series of corresponding cargo-conjugates is capable to mediate iron-uptake into the cells of the Gram-negative bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. These findings were further substantiated by fluorescent labeling experiments followed by confocal fluorescence microscopy with bacterial cultures of E. coli and P. aeruginosa utilizing siderophore-dye conjugates based on (AcO)EntKL 147. In a next step, it was shown that (AcO)EntKL 147 can also function as carrier in a siderophore-drug conjugate to either activate the antibacterial activity of the attached antibiotic against the Gram-negative bacteria E. coli or P. aeruginosa, respectively, or to enhance the activity compared to the parent drug. In the course of this work a total of 14 siderophore-drug conjugates based on (AcO)EntKL 147 were synthesized while six of them provided a significant antimicrobial activity against E. coli and/or P. aeruginosa and four of them exhibited an increased activity against at least one of the tested strains compared to parent antibiotic or enabled a turn-on in antimicrobial activity. Even if these results are preliminary as the total biological evaluation about the efficacy of the drug conjugates has not been finished yet, the gained information further encourages for closer investigation on enterobactin-drug conjugates based on (AcO)EntKL 147. A second subproject dealt with the semi-synthetic modification of the antituberculous agent griselimycin (GM) 329 in order to improve its activity against different mycobacteria and its pharmacokinetic properties. Therefore, the side chain of GM 329 was cleaved under acidic conditions to generate the cyclopeptide A 330 which was utilized as building block for the formation of GM-derivatives with modified side chains. By biological evaluation of the synthesized compounds, several structural motives improving the antimicrobial activity, the pharmacokinetic properties and significantly reducing a known off-target toxicity were identified. However, griselimycin 329 shows a reduced metabolic stability as well as a reduced antibacterial activity against different mycobacteria compared to its derivatives methylgriselimycin 470 and cyclohexylgriselimycin 471. Therefore, beneficial side chains found in the course of this work should be incorporated in the corresponding methylgriselimycin and cyclohexylgriselimycin derivatives via total synthesis. The total synthesis of these compounds was not part of this work but was conducted by my colleague Dr. Elmira Ghabraie. Consequently, the data obtained through this study provided a basis for the development of novel methyl- and cyclohexylgriselimycin derivatives which are potentially integrated in improved drug regimen against tuberculosis. A third subproject covered the modification of the antifungal polyene macrolide amphotericin B 540 to enable the formation of antifungal antibody conjugates. Accordingly, the amphotericin-B-derivatives AMP-PEG4-N3 544 and AMP Lys PEG4 N3 545 were synthesized. Following biological evaluation revealed that AMP-PEG4-N3 544 has lost its antifungal properties while the evaluation of AMP Lys PEG4 N3 545 is still pending. If AMP Lys PEG4 N3 545 maintains the biological activity of amphotericin B 540, it will be used as precursor for an antifungal antibody conjugate.Die wachsende Zahl pathogener Bakterien, die gegen gängige Antibiotika resistent sind, stellt eine ernste Bedrohung für die globalen Gesundheitssysteme dar. Vor allem Gram-negative Pathogene stellen aufgrund der wirksamen Permeationsbarriere, die durch ihre komplexe Zellhülle gebildet wird, eine große Herausforderung für die Wirkstoffentwicklung dar. Diese hat zur Folge, dass viele potenzielle Wirkstoffe, die eine antibakterielle Wirkung gegen Gram-positive Bakterien aufweisen, gegen Gram-negative Bakterien inaktiv bleiben, obwohl ihre biologischen Zielstrukturen im Allgemeinen vorhanden sind. Ein intelligenter Ansatz zur Lösung dieses Problems basiert auf der Konjugation von Antibiotika mit Siderophoren, um Siderophor-Wirkstoff-Konjugate zu bilden. Siderophore sind niedermolekulare Eisen-Chelatoren, die einen aktiven Aufnahmemechanismus über die Zellhülle von Gram-negativen Bakterien besitzen und dadurch als Transportmolekül (Carrier) für die Translokation von antimikrobiellen Wirkstoffen in Bakterienzellen fungieren können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde (AcO)EntKL 147, ein artifizielles Analogon des natürlich vorkommenden Triscatechol-Siderophors Enterobactin 10, mittels Totalsynthese hergestellt und für die Bildung von Siderophor-Cargo- und Siderophor-Wirkstoff-Konjugaten verwendet. Durch biologische Evaluation mittels Wachstum-Wiederherstellungs-Experimenten in Eisen-limitiertem Medium konnte gezeigt werden, dass (AcO)EntKL 147 und eine Reihe von abgeleiteten Cargo-Konjugaten die Eisenaufnahme in die Zellen der Gram-negativen Bakterien Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa vermitteln können. Diese Ergebnisse wurden durch Fluoreszenzmarkierungsexperimente mit anschließender konfokaler Fluoreszenzmikroskopie an Bakterienkulturen von E. coli und P. aeruginosa unter Verwendung von Siderophor-Farbstoff-Konjugaten auf Basis von (AcO)EntKL 147 weiter untermauert. In einem nächsten Schritt wurde gezeigt, dass (AcO)EntKL 147 auch als Carrier in einem Siderophor-Wirkstoff-Konjugat fungieren kann, um entweder die antibakterielle Aktivität des angehängten Antibiotikums gegen die Gram-negativen Bakterien E. coli bzw. P. aeruginosa zu aktivieren oder die Aktivität im Vergleich zum Ausgangsstoff zu erhöhen. Dafür wurden insgesamt 14 Siderophor-Wirkstoff-Konjugate auf Basis von (AcO)EntKL 147 synthetisiert, von denen sechs eine signifikante antimikrobielle Aktivität gegen E. coli und/oder P. aeruginosa aufwiesen und vier eine erhöhte Aktivität gegen mindestens einen der getesteten Stämme im Vergleich zum Ausgangsstoff zeigten oder einen Turn-on der antimikrobiellen Aktivität ermöglichten. Auch wenn es sich hierbei um vorläufige Ergebnisse handelt, da die vollständige biologische Bewertung der Wirksamkeit der Wirkstoffkonjugate noch nicht abgeschlossen ist, ermutigen die gewonnenen Informationen zu einer genaueren Untersuchung von Enterobactin-Wirkstoff-Konjugaten auf Basis von (AcO)EntKL 147. Ein zweites Teilprojekt befasste sich mit der semi-synthetischen Derivatisierung des Antituberkulosemittels Griselimycin (GM) 329, um dessen Aktivität gegen verschiedene Mykobakterien sowie seine pharmakokinetischen Eigenschaften zu verbessern. Dafür wurde die Seitenkette von GM 329 unter sauren Bedingungen abgespalten, um das Cyclopeptid A 330 zu erzeugen, welches als Baustein für die Bildung von GM-Derivaten mit modifizierten Seitenketten verwendet wurde. Durch biologische Evaluation der hergestellten Verbindungen konnten mehrere Strukturmotive identifiziert werden, welche die antimikrobielle Aktivität und die pharmakokinetischen Eigenschaften verbessern und eine bekannte Off-Target-Toxizität deutlich verringern. Allerdings weist GM 329 im Vergleich zu seinen Derivaten Methylgriselimycin (MGM) 470 und Cyclohexylgriselimycin (CGM) 471 eine geringere metabolische Stabilität sowie eine geringere antibakterielle Aktivität gegen verschiedene Mykobakterien auf. Daher sollten die im Rahmen dieser Arbeit gefundenen vorteilhaften Seitenketten über eine Totalsynthese in die entsprechenden MGM- und CGM-Derivate eingebaut werden. Die Totalsynthese dieser Verbindungen war nicht Teil dieser Arbeit, sondern wurde von meiner Kollegin Dr. Elmira Ghabraie durchgeführt. Die im Rahmen dieser Studie gewonnenen Daten bilden somit die Grundlage für die Entwicklung neuer MGM und CGM-Derivate, die in eine verbesserte Therapie gegen Tuberkulose integriert werden könnten. Ein drittes Teilprojekt befasste sich mit der Modifizierung des antimykotischen Polyenmakrolids Amphotericin B 540, um die Bildung von antimykotischen Antikörperkonjugaten zu ermöglichen. Dementsprechend wurden die Amphotericin-B-Derivate AMP-PEG4-N3 544 und AMP-Lys-PEG4-N3 545 synthetisiert. Die anschließende biologische Bewertung ergab, dass AMP-PEG4-N3 544 seine antimykotischen Eigenschaften verloren hat, während die Evaluation von AMP-Lys-PEG4-N3 545 noch aussteht. Wenn AMP-Lys-PEG4-N3 545 über die biologische Aktivität von Amphotericin B 540 verfügt, wird es als Vorläufer für ein antimykotisches Antikörperkonjugat verwendet werden

Der Protonentransport durch das Membranprotein Bacteriorhodopsin, untersucht mittels zeitaufgelöster lnfrarotspektroskopie

Am Beispiel der Photoreaktion der lichtgetriebenen Protonenpumpe BR konnte gezeigt werden, daß zeitaufgelöste Infrarotdifferenzspektren hoher Qualität nicht nurmit Hilfe der Transmissionstechnik, sondern auch unter Verwendung der ATR-Technik gewonnen werden können. Der Vorteil der ATR-Methode besteht in der Kontrolle wichtiger Parameter wie Temperatur, pH-Wert und Salzkonzentration. Durch die zeitaufgelöste ATR/FT-IR-Spektroskopie ist deshalb eine saubere Trennung der Intermediate der Photoreaktion möglich. Dadurch konnte erstmals das O-BR-Differenzspektrum des Wildtyps ohne Überlagerungen von anderen Intermediaten gewonnen werden. Es zeigte sich, daß die großen strukturellen Änderungen, die im N-Intermediat auftreten, bereits im Übergang von N nach O weitgehend rückgängig gemacht werden. Zur näheren Charakterisierung der Protonentransferschritte in BR ist die Bestimmung der pK$_{a}$-Werte derjenigen Aminosäuren, die am Transportvorgang beteiligt sind, wichtig. Weil die ATR-Technik die Variation des pH-Wertes erlaubt, ist diese Methode zur Messung von pK$_{a}$-Werten geeignet und kann in Kombination mit zeitauflösenden Techniken sogar zur Quantifizierung der pK$_{a}$-Änderungen in transienten Zuständen des Proteins verwendet werden.D96 ist der interne Protonendonor der Schiffschen Base. Um diese Funktion erfüllen zu können, muß der pK$_{a}$ dieser Gruppe im Laufe der Photoreaktion gesenkt werden. Für den pK$_{a}$-Wert von D96 im Grundzustand kann mit Hilfe von Titrationsexperimenten eine untere Grenze von 12 angegeben werden. Wie aus denzeitauflösenden Infrarotmessungen ermittelt wurde, wird er im N-Intermediat auf 7.2 abgesenkt. Dieser Wert bestimmt auch die pH-Abhängigkeit der transientenKonzentrationen der Intermediate N und O. An der Freisetzung des Protons auf der extrazellulären Seite ist E204 maßgeblich beteiligt. Der pK$_{a}$ dieser Aminosäure im Grundzustand konnte durch Vergleich von Experimenten am Wildtyp und an der E204Q Mutante zu 9.2 bestimmt werden. Dabei war die Zuordnung einer Bande zu E204 aber nicht möglich. Wahrscheinlich teilt E204 ein Proton mit einer oder mehreren anderen Aminosäuren, die Teil eines Netzwerkes von Wasserstoffbrücken sind, so daß die Absorptionsänderungen, die mit der Änderung des Protonierungszustandes verbunden sind, sehr gering ausfallen. Der pK$_{a}$-Wert von E204 in den Intermediaten der Photoreaktion kann deshalb nicht angegeben werden. Andere Arbeitsgruppen haben festgestellt, daß bei pH-Werten über 6 die Freisetzung des Protons zu einem früheren Zeitpunkt (L-M-Übergang) erfolgt als bei pH-Werten darunter (mit dem Übergang in den Grundzustand). Abgesehen von einer leichten Freguenzverschiebung der D85-Bande schlägt sich dies nicht in Unterschieden der M-BR Differenzspektren nieder. Im Grundzustand kann aber eine Carbonsäure mit [...

Time-resolved FT-IR spectroscopic investigation of the pH-dependent proton transfer reactions in the E194Q mutant of Bacteriorhodopsin

The photoreaction of the E194Q mutant of bacteriorhodopsin has been investigated at various pH values by time-resolved step-scan Fourier-transform infrared difference spectroscopy employing the attenuated total reflection technique. The difference spectrum at pH 8.4 is comparable to the N-BR difference spectra of the wild type with the remarkable exception that D85 is deprotonated. Since the retinal configuration is not perturbed by the E194Q mutation, it is concluded that there is no interaction of D85 with retinal during the lifetime of the N state. At pH 6, a consecutive state to the O intermediate is detected in which D212 is transiently protonated. The comparison with wild-type bacteriorhodopsin reveals that protonation of D212 represents an intermediate step during proton transfer from D85 to the proton release group in the final stage of the reaction cycle. The described effects are more pronounced in the E194Q mutant than in the E204Q mutant demonstrating different roles of these two glutamates/glutamic acids at least in the final stages of the catalytic cycle of bacteriorhodopsin