Der Protonentransport durch das Membranprotein Bacteriorhodopsin, untersucht mittels zeitaufgelöster lnfrarotspektroskopie

Abstract

Am Beispiel der Photoreaktion der lichtgetriebenen Protonenpumpe BR konnte gezeigt werden, daß zeitaufgelöste Infrarotdifferenzspektren hoher Qualität nicht nurmit Hilfe der Transmissionstechnik, sondern auch unter Verwendung der ATR-Technik gewonnen werden können. Der Vorteil der ATR-Methode besteht in der Kontrolle wichtiger Parameter wie Temperatur, pH-Wert und Salzkonzentration. Durch die zeitaufgelöste ATR/FT-IR-Spektroskopie ist deshalb eine saubere Trennung der Intermediate der Photoreaktion möglich. Dadurch konnte erstmals das O-BR-Differenzspektrum des Wildtyps ohne Überlagerungen von anderen Intermediaten gewonnen werden. Es zeigte sich, daß die großen strukturellen Änderungen, die im N-Intermediat auftreten, bereits im Übergang von N nach O weitgehend rückgängig gemacht werden. Zur näheren Charakterisierung der Protonentransferschritte in BR ist die Bestimmung der pK$_{a}$-Werte derjenigen Aminosäuren, die am Transportvorgang beteiligt sind, wichtig. Weil die ATR-Technik die Variation des pH-Wertes erlaubt, ist diese Methode zur Messung von pK$_{a}$-Werten geeignet und kann in Kombination mit zeitauflösenden Techniken sogar zur Quantifizierung der pK$_{a}$-Änderungen in transienten Zuständen des Proteins verwendet werden.D96 ist der interne Protonendonor der Schiffschen Base. Um diese Funktion erfüllen zu können, muß der pK$_{a}$ dieser Gruppe im Laufe der Photoreaktion gesenkt werden. Für den pK$_{a}$-Wert von D96 im Grundzustand kann mit Hilfe von Titrationsexperimenten eine untere Grenze von 12 angegeben werden. Wie aus denzeitauflösenden Infrarotmessungen ermittelt wurde, wird er im N-Intermediat auf 7.2 abgesenkt. Dieser Wert bestimmt auch die pH-Abhängigkeit der transientenKonzentrationen der Intermediate N und O. An der Freisetzung des Protons auf der extrazellulären Seite ist E204 maßgeblich beteiligt. Der pK$_{a}$ dieser Aminosäure im Grundzustand konnte durch Vergleich von Experimenten am Wildtyp und an der E204Q Mutante zu 9.2 bestimmt werden. Dabei war die Zuordnung einer Bande zu E204 aber nicht möglich. Wahrscheinlich teilt E204 ein Proton mit einer oder mehreren anderen Aminosäuren, die Teil eines Netzwerkes von Wasserstoffbrücken sind, so daß die Absorptionsänderungen, die mit der Änderung des Protonierungszustandes verbunden sind, sehr gering ausfallen. Der pK$_{a}$-Wert von E204 in den Intermediaten der Photoreaktion kann deshalb nicht angegeben werden. Andere Arbeitsgruppen haben festgestellt, daß bei pH-Werten über 6 die Freisetzung des Protons zu einem früheren Zeitpunkt (L-M-Übergang) erfolgt als bei pH-Werten darunter (mit dem Übergang in den Grundzustand). Abgesehen von einer leichten Freguenzverschiebung der D85-Bande schlägt sich dies nicht in Unterschieden der M-BR Differenzspektren nieder. Im Grundzustand kann aber eine Carbonsäure mit [...