Missense mutations in the perforin (PRF1) gene as a cause of hereditary cancer predisposition

Perforin, a pore-forming toxin released from secretory granules of NK cells and CTLs, is essential for their cytotoxic activity against infected or cancerous target cells. Bi-allelic loss-of-function mutations in the perforin gene are invariably associated with a fatal immunoregulatory disorder, familial haemophagocytic lymphohistiocytosis type 2 (FHL2), in infants. More recently, it has also been recognized that partial loss of perforin function can cause disease in later life, including delayed onset FHL2 and haematological malignancies. Herein we report a family in which a wide range of systemic inflammatory and neoplastic manifestations have occurred across three generations. We found that disease was linked to two missense perforin gene mutations (encoding A91V, R410W) that cause protein misfolding and partial loss of activity. These cases link the partial loss of perforin function with some solid tumours that are known to be controlled by the immune system, as well as haematological cancers. Our findings also demonstrate that perforin gene mutations can contribute to hereditary cancer predisposition

Lipid specificity of the immune effector perforin

Perforin is a pore forming protein used by cytotoxic T lymphocytes to remove cancerous or virus-infected cells during immune response. During the response, the lymphocyte membrane becomes refractory to perforin function by accumulating densely ordered lipid rafts and externalizing negatively charged lipid species. The dense membrane packing lowers the capacity of perforin to bind, and negatively charged lipids scavenge any residual protein before pore formation. Using atomic force microscopy on model membrane systems, we here provide insight into the molecular basis of perforin lipid specificity

Естери та аміди 3-R-2,8-діоксо-7,8-дигідро-2Н-піроло[1,2-а][1,2,4]триазино[2,3-с]-хіназолін-5а(6Н)-карбонових(-пропанових) кислот: синтез та біологічна активність

It is known that carboxyl groups bonded to aryl or hetaryl moieties play a role of the “pharmacophore” fragment in most NSAID molecules. It should be mentioned that the carboxyl group may cause the appearance of toxic effects and is characterized by unsatisfactory pharmacokinetic properties. The structural modification of the carboxyl group, including its bioisosteric replacement, is among the most widely used approaches in medicinal chemistry to improve pharmacodynamic, pharmacokinetic and technological characteristics.Aim. To develop the synthetic procedures for functional derivatives of 3-R-2,8-dioxo-7,8-dihydro-2Н-pyrrolo[1,2-а][1,2,4]triazino[2,3-с]quinazoline-5а(6Н)-carboxylic(-propanoic) acids, study the effect of the carboxyl group chemical modification on the LOX-inhibiting and antiradical activity as a possible mechanism of the pharmacological activity.Results and discussion. The synthesis of esters of 3-(2,8-dioxo-3-R1-7,8-dihydro-2H-pyrrolo[1,2-a][1,2,4]triazino[2,3-c]quinazolin-5a(6H)-yl)carboxylic(propanoic) acids was conducted by esterification of the corresponding acids and tandem heterocyclization of 2-(6-R1-2,5-dihydro-5-оxo-1,2,4-triazino-3-yl)anilines with diethyl 4-oxoheptanedioate. The synthesis of amides was conducted by aminolysis of N-acylimidazolides generated in situ. The antiradical and LOX-inhibiting activities of the compounds obtained were studied as possible mechanisms of the anti-inflammatory activity. The series of the compounds revealed the LOX-inhibiting activity that was comparable with the effect of the reference compound – nordihydroguaiaretic acid.Experimental part. The synthetic procedures were conducted according to the commonly used methods. The purity and the structure of the compounds obtained were proven by modern physicochemical methods (1H and 13C NMR-spectroscopy, LC-MS-spectrometry). The antiradical activity was measured by the ability to scavenge a DPPH-radical. The study of the LOX-inhibiting activity was performed using soybean LOX as an enzyme and linolenic acid as a substrate.Conclusions. The methods for the synthesis of esters and amides of 2,8-dioxo-3-R1-7,8-dihydro-2H-pyrrolo[1,2-a][1,2,4]triazino[2,3-c]quinazolin-5a(6H)-carboxilic(propanoic) acids have been developed. The abovementioned transformations were conducted by alcoholysis of generated in situ acyl halides and aminolysis of N-acylimidazolides, respectively. The more efficient approach for the synthesis of the target esters via condensation of 2-(6-R1-2,5-dihydro-5-oxo-1,2,4-triazino-3-yl)anilines with diethyl 4-oxoheptanedioate has been proposed. It has been found that the highest radical scavenging and LOX-inhibiting activities are characteristic for hetarylpropanoic acids that contain electron withdrawing substituents in position 3, as well as fluorine atoms in positions 11 and 12. The chemical modification of the carboxylic group in most cases results in a decrease or the loss of the activity. Received: 10.01.2019Revised: 04.02.2020Accepted: 27.02.2020Известно, что карбоксильные группы, связанные с арильным или гетарильным фрагментами, играют роль «фармакофора» в молекулах большинства НПВС. Следует отметить, что карбоксильная группа может привести к появлению токсического действия и характеризуется неудовлетворительными фармакокинетическими свойствами. Структурная модификация карбоксильной группы, включая ее биоизостерическую замену, является одним из наиболее широко применяемых подходов медицинской химии для совершенствования фармакодинамических, фармакокинетических и технологических характеристик.Цель. Разработать методы синтеза ряда функциональных производных 3-R-2,8-диоксо-7,8-дигидро-2Н-пирроло­[1,2-а][1,2,4]триазино[2,3-с]хиназолин-5а(6Н)-карбоновых(-пропановых) кислот, изучить влияние структурной модификации карбоксильной группы на ЛОГ-ингибирующее и антирадикальное действие как одного из возможных механизмов фармакологической активности.Результаты и их обсуждение. Реакцией этерификации 3-(2,8-диoксо-3-R1-7,8-дигидро-2H-пирроло[1,2-a][1,2,4]триазино[2,3-c]хиназолин-5a(6H)-ил)пропановых кислот или тандемной гетероциклизацией 2-(6-R1-2,5-дигидро-5-оксо-1,2,4-триазино-3-ил)анилинов с диэтил-4-oксогептандионатом синтезированы эфиры соответствующих кислот. Синтез амидов проведен аминолизом активированных кислот, где в качестве активирующей компоненты использован 1,1’-карбонилдиимидазол. В рамках исследования проведено изучение ЛОГ-ингибирующего и антирадикального действия как одного из возможных механизмов противовоспалительной активности. Выявлен ряд соединений, которые проявляют ЛОГ-ингибирующую активность на уровне стандарта нордигидрогваяретовой кислоты.Экспериментальная часть. Синтетические процедуры были выполнены согласно общепринятым подходам. Чистота и структура соединений установлены с помощью современных физико-химических методов (1H и 13C ЯМР-спектроскопия, ВЭЖХ-МС-спектрометрия). Антирадикальную активность устанавливали путем измерения способности синтезированных соединений связывать DPPH-радикал. Изучение ЛОГ-ингибирующей активности веществ было проведено с использованием соевой липооксигеназы в качестве фермента и линоленовой кислоты в качестве субстрата.Выводы. Разработаны методы синтеза сложных эфиров и амидов 2,8-диоксо-3-R1-7,8-дигидро-2H-пирроло[1,2-a][1,2,4]­триазино[2,3-c]хиназолин-5a(6H)-карбоновых(-пропановых) кислот. Указанные превращения проведены алкоголизом образованных in situ ацилгалогенидов и аминолизом N-ацилимидазолидов. Более эффективным методом синтеза сложных эфиров оказалась тандемная гетероциклизация 2-(6-R1-2,5-дигидро-5-оксо-1,2,4-триазино-3-ил)анилинов с диэтил-4-oксогептандионатом. Установлено, что наиболее высокая ЛОГ-ингибирующая и антирадикальная активность характерны для гетарилпропановых кислот, которые имеют электроноакцепторные заместители в положении 3, а также атомы фтора в положениях 11 и 12. Модификация карбоксильной группы соответствующих кислот в большинстве случаев приводит к снижению или потере активности. Received: 10.01.2019Revised: 04.02.2020Accepted: 27.02.2020Відомо, що карбоксильні групи, пов’язані з арильним або гетарильним фрагментами, відіграють роль «фармакофору» у молекулах більшості НПЗЗ. Слід зазначити, що карбоксильна група може спричинити появу токсичної дії і характеризується незадовільними фармакокінетичними властивостями. Структурна модифікація карбоксильної групи, включаючи її біоізостеричну заміну, є однією з найбільш широко застосовуваних підходів медичної хімії для вдосконалення фармакодинамічних, фармакокінетичних та технологічних характеристик.Мета. Розробити методи синтезу ряду функціональних похідних 3-R-2,8-діоксо-7,8-дигідро-2Н-піроло[1,2-а][1,2,4]триазино[2,3-с]хіназолін-5а(6Н)-карбонових(-пропанових) кислот, вивчити вплив структурної модифікації карбоксильної групи на ЛОГ-інгібуючу та антирадикальну дію як одного з можливих механізмів фармакологічної активності.Результати та їх обговорення. Реакцією естерифікації 3-(2,8-діoксо-3-R1-7,8-дигідро-2H-піроло[1,2-a][1,2,4]триазино[2,3-c]хіназолін-5a(6H)-іл)пропанових кислот або тандемною гетероциклізацією 2-(6-R1-2,5-дигідро-5-оксо-1,2,4-триазин-3-іл)анілінів з діетил-4-oксогептандіонатом синтезовано естери відповідних кислот. Синтез амідів проведено амінолізом активованих кислот, де як активуючу компоненту використано 1,1’-карбонілдіімідазол. У рамках дослідження проведено вивчення ЛОГ-інгібуючої і антирадикальної дії як одного з можливих механізмів протизапальної активності. Виявлено ряд сполук, які проявляють ЛОГ-інгібуючу активність на рівні фармакологічного стандарту нордигідрогваяретової кислоти.Експериментальна частина. Синтетичні процедури були виконані згідно з загальноприйнятими підходами. Чистоту і структуру сполук встановлено за допомогою сучасних фізико-хімічних методів (1H і 13C ЯМР-спектроскопія, ВЕРХ-МС-спектрометрія). Антирадикальну активність встановлювали за здатністю синтезованих сполук інгібувати DPPH-радикал. Вивчення ЛОГ-інгібуючої активності сполук було проведено з використанням соєвої ліпооксигенази як ферменту і ліноленової кислоти як субстрату.Висновки. Розроблено методи синтезу естерів і амідів 2,8-діоксо-3-R1-7,8-дигідро-2H-піроло[1,2-a][1,2,4]триазино[2,3-c]хіназолін-5a(6H)-карбонових (пропанових) кислот. Вищезазначені перетворення проведено алкоголізом утворених in situ ацилгалогенідів та амінолізом N-ацилімідазолідів. Більш ефективним методом синтезу естерів виявилася тандемна гетероциклізація 2-(6-R1-2,5-дигідро-5-оксо-1,2,4-триазин-3-іл)анілінів з діетил-4-oксогептандіонатом. Встановлено, що найбільш висока ЛОГ-інгібуюча і антирадикальна активність характерні для гетарилпропанових кислот, які мають електроноакцепторні замісники у положенні 3, а також атоми флуору у положеннях 11 та 12. Модифікація карбоксильної групи відповідних кислот у більшості випадків призводить до зниження або втрати активності. Received: 10.01.2019Revised: 04.02.2020Accepted: 27.02.202

ЗАМІЩЕНІ 3-R-7,8-ДИГІДРО-2Н-ПІРОЛО[1,2-а][1,2,4]ТРИАЗИНО[2,3-с]ХІНАЗОЛІН-5а(6Н)-АЛКІЛКАРБОНОВІ КИСЛОТИ – ПЕРСПЕКТИВНИЙ КЛАС МАЛОТОКСИЧНИХ ПРОТИЗАПАЛЬНИХ АГЕНТІВ

The aim of the work. Evaluation of the anti-inflammatory activity and acute toxicity of new 3-R-7,8-dihydro-2H-pyrrolo[1,2-a][1,2,4]triazino[2,3-c]quinazolin-5a (6H)-alkyl-carboxylic acids as potential anti-inflammatory agents. Materials and Methods. The study of anti-inflammatory activity was conducted on a model of carrageenan-induced paw edema on white male Wistar rats weighing 140- 220 g. The tested compounds were administered orally using an atraumatic probe at a dose of 25 mg/kg, sodium diclofenac was used as reference drug and was administrated in dose 10 mg/kg. The acute toxicity of the studied compounds was predicted by in silico methods (GUSAR and TEST software packages), as well, as evaluated experimentally on outbred white mice of both sexes weighing 16-24 g. The synthesized compounds were administered intraperitoneally in the form of a fine suspension in physiological saline, which was stabilized by Tween 80. Median lethal doses (LD50) were determined by the Prozorovsky method. Statistical processing was conducted by appropriate approaches using the STATISTICA® for Windows 6.0 software (StatSoft Inc, No. AXXR712D833214FAN5). Results and Discussion. The study of the anti-inflammatory activity of pyrrolo[1,2-a][1,2,4]triazino[2,3-c]quinazolines derivatives showed that the studied compounds are highly active anti-inflammatory agents, that compete or exceed activity of reference drug “Sodium diclofenac”. The most active was 3-(3-methyl-2,8-dioxo-7,8-dihydro-2H-pyrrolo[1,2-a][1,2,4]triazino[2,3-c]quinazolin-5a(6H)-yl)propanoic acid (5) which by the level of pharmacological effect exceeded reference drug by more than 20%. The results of in silico and in vivo study of the pyrrolo[1,2-a][1,2,4]triazino[2,3-c]quinazoline derivatives acute toxicity showed their mutual correlation. Intraperitoneal administration of the studied compounds to white mice at doses of 500 to 1500 mg/kg allowed assign them to toxicity classes IV and V (low-toxic and practically non-toxic compounds, respectively, classification of toxicity with parenteral routes of administration). Conclusion. The anti-inflammatory activity and acute toxicity of new pyrrolo[1,2-a][1,2,4]triazino[2,3-c]quinazolines were studied. It was found that most of the studied compounds exhibit significant anti-inflammatory activity being low-toxic or practically non-toxic (IV-V class). “Chemical structure – anti-inflammatory activity” relationship analysis showed, that the introduction of propanoic acid moiety in position 5a may be considered as rational approach for search for new anti-inflammatory agents. Described compounds are a promising group for further purposeful synthesis and in-depth pharmacological studies aimed at creating new non-steroidal anti-inflammatory drugs.Мета роботи. Дослідження протизапальної активності та гострої токсичності оригінальних 3-R-7,8-дигідро-2Н-піроло[1,2-а][1,2,4]триазино[2,3-с]хіназолін-5а(6Н)-алкілкарбонових кислот. Матеріали і методи. Дослідження протизапальної активності проводили на моделі карагенінового набряку лапки білих щурів-самців лінії «Вістар» масою 140 – 220 г. Досліджувані речовини вводили перорально у вигляді водної суспензії, стабілізованої Твіном 80, за допомогою атравматичного зонда в дозі 25 мг/кг, натрію диклофенак – 10 мг/кг. Показники гострої токсичності досліджуваних сполук було спрогнозовано in silico (програмні пакети GUSAR і TEST) та встановлено in vivo на білих безпородних мишах обох статей масою 16 – 24 г. Синтезовані сполуки вводили одноразово внутрішньоочеревинно у вигляді тонкої суспензії у фізіологічному розчині, стабілізованої Твіном 80. Середньолетальні дози (ЛД50) визначали за методом В. Прозоровського. Статистичну обробку даних проводили за загальноприйнятими підходами за допомогою статистичного пакета програм «STATISTICA® for Windows 6.0» (StatSoft Inc, № АХХR712D833214FAN5). Результати й обговорення. Вивчення протизапальної дії похідних піроло[1,2-a][1,2,4]триазино[2,3-c]хіназоліну показало, що досліджувані сполуки є високоактивними протизапальними агентами, які за рівнем дії конкурують або перевищують препарат порівняння «Натрію диклофенак». Найбільш активною виявилась 3-(3-метил-2,8-діоксо-7,8-дигідро-2H-піроло[1,2-a][1,2,4]триазино[2,3-c]хіназолін-5a(6H)-іл)пропанова кислота (5), яка за рівнем дії перевищує препарат порівняння більше ніж на 20 %. Результати вивчення гострої токсичності похідних піроло[1,2-a][1,2,4]триазино[2,3-c]хіназолінів, проведені методами in silico та in vivo, корелюють поміж собою. Внутрішньоочеревинне введення досліджуваних сполук білим безпородним мишам у дозах від 500 до 1500 мг/кг дозволило віднести їх до IV та V класу токсичності (малотоксичні та практично нетоксичні сполуки, згідно із класифікацією токсичності при парентеральних способах введення). Висновки. Досліджено протизапальну активність та гостру токсичність серед оригінальних піроло[1,2-а][1,2,4]триазино[2,3-с]хіназолінів і встановлено, що більшість досліджуваних сполук проявляють виражену протизапальну дію при внутрішньошлунковому введенні та належать до практично нетоксичних або малотоксичних сполук (IV-V клас). Обговорено взаємозв’язок «хімічна будова – протизапальна активність» і показано, що введення залишку пропанової кислоти в положення 5а зазначеної системи є виправданим у плані пошуку сполук з антиексудативною дією, а зазначені структури є перспективною групою для проведення подальшого спрямованого синтезу і фармакологічних досліджень із метою створення на їх основі нових нестероїдних протизапальних засобів

Molecular study of the perforin gene in familial hematological malignancies

Perforin gene (PRF1) mutations have been identified in some patients diagnosed with the familial form of hemophagocytic lymphohistiocytosis (HLH) and in patients with lymphoma. The aim of the present study was to determine whether patients with a familial aggregation of hematological malignancies harbor germline perforin gene mutations. For this purpose, 81 unrelated families from Tunisia and France with aggregated hematological malignancies were investigated. The variants detected in the PRF1 coding region amounted to 3.7% (3/81). Two of the three variants identified were previously described: the p.Ala91Val pathogenic mutation and the p.Asn252Ser polymorphism. A new p.Ala 211Val missense substitution was identified in two related Tunisian patients. In order to assess the pathogenicity of this new variation, bioinformatic tools were used to predict its effects on the perforin protein structure and at the mRNA level. The segregation of the mutant allele was studied in the family of interest and a control population was screened. The fact that this variant was not found to occur in 200 control chromosomes suggests that it may be pathogenic. However, overexpression of mutated PRF1 in rat basophilic leukemia cells did not affect the lytic function of perforin differently from the wild type protein

Calcium and copper transport ATPases: analogies and diversities in transduction and signaling mechanisms

The calcium transport ATPase and the copper transport ATPase are members of the P-ATPase family and retain an analogous catalytic mechanism for ATP utilization, including intermediate phosphoryl transfer to a conserved aspartyl residue, vectorial displacement of bound cation, and final hydrolytic cleavage of Pi. Both ATPases undergo protein conformational changes concomitant with catalytic events. Yet, the two ATPases are prototypes of different features with regard to transduction and signaling mechanisms. The calcium ATPase resides stably on membranes delimiting cellular compartments, acquires free Ca2+ with high affinity on one side of the membrane, and releases the bound Ca2+ on the other side of the membrane to yield a high free Ca2+ gradient. These features are a basic requirement for cellular Ca2+ signaling mechanisms. On the other hand, the copper ATPase acquires copper through exchange with donor proteins, and undergoes intracellular trafficking to deliver copper to acceptor proteins. In addition to the cation transport site and the conserved aspartate undergoing catalytic phosphorylation, the copper ATPase has copper binding regulatory sites on a unique N-terminal protein extension, and has also serine residues undergoing kinase assisted phosphorylation. These additional features are involved in the mechanism of copper ATPase intracellular trafficking which is required to deliver copper to plasma membranes for extrusion, and to the trans-Golgi network for incorporation into metalloproteins. Isoform specific glyocosylation contributes to stabilization of ATP7A copper ATPase in plasma membranes

Safety profile of a multi-antigenic DNA vaccine against hepatitis C virus

Despite direct acting antivirals (DAAs) curing >95% of individuals infected with hepatitis C (HCV), in order to achieve the World Health Organization HCV Global Elimination Goals by 2030 there are still major challenges that need to be overcome. DAAs alone are unlikely to eliminate HCV in the absence of a vaccine that can limit viral transmission. Consequently, a prophylactic HCV vaccine is necessary to relieve the worldwide burden of HCV disease. DNA vaccines are a promising vaccine platform due to their commercial viability and ability to elicit robust T-cell-mediated immunity (CMI). We have developed a novel cytolytic DNA vaccine that encodes non-structural HCV proteins and a truncated mouse perforin (PRF), which is more immunogenic than the respective canonical DNA vaccine lacking PRF. Initially we assessed the ability of the HCV pNS3-PRF and pNS4/5-PRF DNA vaccines to elicit robust long-term CMI without any adverse side-effects in mice. Interferon-γ (IFN-γ) enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assay was used to evaluate CMI against NS3, NS4 and NS5B in a dose-dependent manner. This analysis showed a dose-dependent bell-curve of HCV-specific responses in vaccinated animals. We then thoroughly examined the effects associated with reactogenicity of cytolytic DNA vaccination with the multi-antigenic HCV DNA vaccine (pNS3/4/5B). Hematological, biochemical and histological studies were performed in male Sprague Dawley rats with a relative vaccine dose 10–20-fold higher than the proposed dose in Phase I clinical studies. The vaccine was well tolerated, and no toxicity was observed. Thus, the cytolytic multi-antigenic DNA vaccine is safe and elicits broad memory CMI.Jason Gummow, Makutiro G. Masavuli, Zelalem A. Mekonnen, Yanrui Li, Danushka K. Wijesundara, Ashish C. Shrestha, Ilia Voskoboinik, Eric J. Gowans and Branka Grubor-Bau

Perforin proteostasis is regulated through its C2 domain: supra-physiological cell death mediated by T431D-perforin

The pore forming, Ca2+-dependent protein, perforin, is essential for the function of cytotoxic lymphocytes, which are at the frontline of immune defence against pathogens and cancer. Perforin is a glycoprotein stored in the secretory granules prior to release into the immune synapse. Congenital perforin deficiency causes fatal immune dysregulation, and is associated with various haematological malignancies. At least 50% of pathological missense mutations in perforin result in protein misfolding and retention in the endoplasmic reticulum. However, the regulation of perforin proteostasis remains unexplored. Using a variety of biochemical assays that assess protein stability and acquisition of complex glycosylation, we demonstrated that the binding of Ca2+ to the C2 domain stabilises perforin and regulates its export from the endoplasmic reticulum to the secretory granules. As perforin is a thermo-labile protein, we hypothesised that by altering its C2 domain it may be possible to improve protein stability. On the basis of the X-ray crystal structure of the perforin C2 domain, we designed a mutation (T431D) in the Ca2+ binding loop. Mutant perforin displayed markedly enhanced thermal stability and lytic function, despite its trafficking from the endoplasmic reticulum remaining unchanged. Furthermore, by introducing the T431D mutation into A90V perforin, a pathogenic mutation, which results in protein misfolding, we corrected the A90V folding defect and completely restored perforin’s cytotoxic function. These results revealed an unexpected role for the Ca2+-dependent C2 domain in maintaining perforin proteostasis and demonstrated the possibility of designing perforin with supra-physiological cytotoxic function through stabilisation of the C2 domain

Activation of Fas/FasL pathway and the role of c-FLIP in primary culture of human cholangiocarcinoma cells

Intrahepatic cholangiocarcinoma (iCCA) represents a heterogeneous group of malignancies emerging from the biliary tree, often in the context of chronic bile ducts inflammation. The immunological features of iCCA cells and their capability to control the lymphocytes response have not yet been investigated. The aims of the present study were to evaluate the interaction between iCCA cells and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and the role of Fas/FasL in modulating T-cells and NK-cells response after direct co-culture. iCCA cells express high levels of Fas and FasL that increase after co-culture with PBMCs inducing apoptosis in CD4(+), CD8(+) T-cells and in CD56(+) NK-cells. In vitro, c-FLIP is expressed in iCCA cells and the co-culture with PBMCs induces an increase of c-FLIP in both iCCA cells and biliary tree stem cells. This c-FLIP increase does not trigger the caspase cascade, thus hindering apoptotis of iCCA cells which, instead, underwent proliferation. The increased expression of Fas, FasL and c-FLIP is confirmed in situ, in human CCA and in primary sclerosing cholangitis. In conclusion our data indicated that iCCA cells have immune-modulatory properties by which they induce apoptosis of T and NK cells, via Fas/FasL pathway, and escape inflammatory response by up-regulating c-FLIP system