A role of efflux pumps in intrinsic drug resistance and virulence of Mycobacterium tuberculosis

Las bombas de eflujo son proteínas de membrana que transportan distintos compuestos al exterior de la bacteria. Se ha descrito que están implicadas en resistencia intrínseca y adquirida a varios antibióticos, así como en colonización y persistencia de bacterias patógenas en el hospedador. Además, diversos procesos fisiológicos pueden verse afectados por estas proteínas de membrana, con dependencia de cuál sea el sustrato natural de la bomba de eflujo. En la actualidad, las cepas de Mycobacterium tuberculosis resistentes a antibióticos suponen un grave problema de salud. No sólo se han descrito cepas multi y extremadamente resistentes, si no también resistentes a todos los antibióticos testados. Por ello es necesario un esfuerzo a nivel global que permita controlar esta situación de emergencia. Algunas de las estrategias seguidas son: el desarrollo de nuevos antibióticos contra la tuberculosis y el programa DOTS (Directly Observed Treatment Short Course) de la OMS. Un mejor conocimiento de los mecanismos de resistencia a antibióticos nos proporcionaría buenas herramientas para mejorar el tratamiento anti-tuberculosis. Las bombas de eflujo MFS Rv1258c (Tap), Rv2333 (Stp) y Rv1410c (P55) de M. tuberculosis se habían estudiado previamente en el organismo heterólogo M. bovis BCG, la cepa vacunal. Se observó como resultado que éstas estaban implicadas en la resistencia intrínseca a varios compuestos. Aunque el modelo de M. bovis BCG es una buena aproximación, debido al alto porcentaje de identidad entre M. tuberculosis y M. bovis BCG, las diferencias en el fondo genético pueden afectar a la función de estos transportadores, y el carácter no-virulento de la cepa BCG impide el estudio de la implicación de estas bombas de eflujo en la virulencia de M. tuberculosis. Por ello, nuestro objetivo principal fue estudiar estas tres bombas de eflujo (Tap, Stp y P55) en el microorganismo del que provienen, M. tuberculosis. Se construyeron, derivadas la cepa de referencia M. tuberculosis H37Rv, mutantes knock-out para cada una de las bombas, así como sus respectivas complementadas, además de las cepas que sobreexpresan el gen de la bomba de eflujo. Los ensayos de sensibilidad a antibióticos realizados con estas cepas confirmaron la mayoría, aunque no todos, de los resultados en M. bovis BCG. Además, se llevaron a cabo experimentos de infección en modelo celular y de ratón, para comprobar si la deleción del gen de la correspondiente bomba de eflujo afectaba a la virulencia de M. tuberculosis. Atendiendo al modelo celular, las tres bombas de eflujo parecían ser necesarias para la virulencia completa de H37Rv; sin embargo, en modelo de ratón inmunocompetente, solamente el mutante knock-out de P55 resultó ser atenuado. En búsqueda de otra estrategia para detectar posibles sustratos de bombas de eflujo de M. tuberculosis, decidimos intentar expresarlas en Escherichia coli. Además de los ensayos de Concentración Inhibitoria Mínima, se realizaron varios ensayos que permiten visualizar la acumulación y el eflujo de compuestos el tiempo real. En caso de éxito, esta técnica permitiría comprobar rápida y fácilmente una batería de sustratos potenciales de la bomba de eflujo. Desafortunadamente, no se obtuvieron resultados significativos; es necesario continuar con varios experimentos para confirmar la expresión de las bombas de eflujo micobacterianas en E. coli. En paralelo, caracterizamos el fenotipo de dos cepas de M. tuberculosis mutantes knock-out para las bombas de eflujo MmpL7 y MmpL10. La cepa con el gen mmpL7 delecionado resultó tener una velocidad de crecimiento mayor, y formaba menos agregados al cultivarse en medio líquido que su respectiva cepa wild-type. Finalmente, se realizó un análisis de cepas clínicas de M. tuberculosis resistentes a estreptomicina. Se secuenciaron los tres genes relacionados con resistencia a estreptomicina (rpsL, rrs y gidB) en búsqueda de posibles mutaciones. Un cuarto gen se incluyó en el experimento: Rv1258c, que codifica la bomba de eflujo Tap, y que previamente se había descrito que está implicado en la resistencia a estreptomicina. Nuestra hipótesis era que una posible mutación en el promotor o en el gen podría conferir resistencia a este antibiótico. Aunque no encontramos ninguna mutación en el gen Rv1258c que cumpliera este criterio, sí que descubrimos una mutación que estaba presente en varias cepas. El análisis en detalle reveló que este SNP (Single Nucleotide Polymorphism), denominado Tap580, era específico de las cepas de la familia Beijing. Se diseño un método PCR-RFLP que permite detectar fácil y rápidamente esta mutación, y posteriormente se validó con un lote de 220 DNA de aislados clínicos pertenecientes a diferentes familias de M. tuberculosis

Los precios de transferencia: una aproximación multidisciplinar

Las operaciones vinculadas son uno de los factores más relevantes en la planificación fiscal de las empresas. Estas operaciones representan el 60% del comercio internacional y su complejidad surge cuando partes vinculadas establecen acuerdos que partes independientes no aceptarían y que son el resultado de una planificación fiscal agresiva con objetivos que superan el ámbito comercial y que persiguen la elusión o evasión fiscal.Atendiendo a la naturaleza particular de estas operaciones, el objetivo de este trabajo es desarrollar un análisis exhaustivo de los precios de transferencia desde un enfoque multidisciplinar, combinando la perspectiva de la economía pública con la contable y la jurídico-mercantil; haciendo especial hincapié en la vertiente internacional del problema. Para alcanzar este objetivo general, en primer lugar, se evalúan las estrategias, proyectos y mecanismos desarrollados por las instituciones internacionales y nacionales; especialmente se analizan las propuestas de la OCDE y de la Comisión Europea, entre otras. Puesto que las normas fiscales aplicables en el ámbito nacional son competencia exclusiva de los países, el segundo objetivo es examinar cómo la norma fiscal española aborda la gestión de las operaciones vinculadas para adaptar la normativa nacional a un escenario empresarial globalizado; este análisis se complementa teniendo en cuenta las normas mercantil y contable. En relación a estos objetivos, los resultados alcanzados indican, por un lado, que existe un elevado grado de heterogeneidad normativa, tanto en el ámbito internacional como en el entorno nacional; una circunstancia que es responsable de conflictos internacionales que limitan el comercio y son motivo de confrontación a todos los niveles. Por otro, que el establecimiento de mandatos legales para la adecuación de las operaciones vinculadas al principio de plena competencia no limita la transferencia de beneficios.Teniendo en cuenta estas conclusiones, se cuestiona la efectividad del principio de plena competencia como estándar internacional, se proponen alternativas para incrementar la efectividad de los sistemas fiscales vigentes y se desarrollan propuestas armonizadoras aplicables dentro del ámbito nacional español.El tercer propósito de esta tesis es identificar los problemas relativos a los precios de transferencia que subsisten en el ámbito internacional y estudiar las iniciativas más ambiciosas disponibles: el Plan de Acción BEPS (Base Erosion and Profit Shifting) desarrollado por la OCDE y la propuesta de Directiva relativa a una Base Imponible Consolidada Común del Impuesto sobre Sociedades (BICCIS/CCCTB: Common Consolidated Corporate Tax Base) planteada por la Comisión Europea. Se analiza el origen de estas propuestas, su fundamento económico y jurídico, su efectividad y si su adopción representaría un cambio relevante en la fiscalidad internacional. También se hace referencia a las diferentes alternativas tributarias consideradas por el Fondo Monetario Internacional.<br /

Unexpected high prevalence of resistance-associated Rv0678 variants in MDR-TB patients without documented prior use of clofazimine or bedaquiline.

YesObjectives: Resistance-associated variants (RAVs) in Rv0678, a regulator of the MmpS5-MmpL5 efflux pump, have been shown to lead to increased MICs of bedaquiline (2- to 8- fold) and clofazimine (2- to 4-fold). The prevalence of these Rv0678 RAVs in clinical isolates and their impact on treatment outcomes are important factors to take into account in bedaquiline treatment guidelines. Methods: Baseline isolates from two bedaquiline MDR-TB clinical trials were sequenced for Rv0678 RAVs and corresponding bedaquiline MICs were determined on 7H11 agar. Rv0678 RAVs were also investigated in non-MDRTB sequences of a population-based cohort. Results: Rv0678 RAVs were identified in 23/347 (6.3%) of MDR-TB baseline isolates. Surprisingly, bedaquiline MICs for these isolates were high (>0.24 mg/L, n¼8), normal (0.03 0.24 mg/L, n¼11) or low(<0.03 mg/L, n¼4). A variant at position 11 in the intergenic region mmpS5–Rv0678 was identified in 39 isolates (11.3%) and appeared to increase the susceptibility to bedaquiline. In non-MDR-TB isolates, the frequency of Rv0678 RAVs was lower (6/ 852 or 0.7%). Competition experiments suggested that rifampicin was not the drug selecting for Rv0678 RAVs. Conclusions: RAVs in Rv0678 occur more frequently in MDR-TB patients than previously anticipated, are not associated with prior use of bedaquiline or clofazimine, and in the majority of cases do not lead to bedaquiline MICs above the provisional breakpoint (0.24mg/L). Their origin remains unknown. Given the variety of RAVs in Rv0678 and their variable effects on the MIC, only phenotypic drug-susceptibility methods can currently be used to assess bedaquiline susceptibility.This work was supported by Janssen Pharmaceutica. N. C. was supported by a Baekeland PhD scholarship from the Flemish Institute for Scientific Technology (IWT 130308, Belgium). C. J. M., L. R. and B. d. J. were supported by a European Research Council Starting Grant INTERRUPTB (311725)

TFG 2014/2015

Amb aquesta publicació, EINA, Centre universitari de Disseny i Art adscrit a la Universitat Autònoma de Barcelona, dóna a conèixer el recull dels Treballs de Fi de Grau presentats durant el curs 2014-2015. Voldríem que un recull com aquest donés una idea més precisa de la tasca que es realitza a EINA per tal de formar nous dissenyadors amb capacitat de respondre professionalment i intel·lectualment a les necessitats i exigències de la nostra societat. El treball formatiu s’orienta a oferir resultats que responguin tant a paràmetres de rigor acadèmic i capacitat d’anàlisi del context com a l’experimentació i la creació de nous llenguatges, tot fomentant el potencial innovador del disseny.Con esta publicación, EINA, Centro universitario de diseño y arte adscrito a la Universidad Autónoma de Barcelona, da a conocer la recopilación de los Trabajos de Fin de Grado presentados durante el curso 2014-2015. Querríamos que una recopilación como ésta diera una idea más precisa del trabajo que se realiza en EINA para formar nuevos diseñadores con capacidad de responder profesional e intelectualmente a las necesidades y exigencias de nuestra sociedad. El trabajo formativo se orienta a ofrecer resultados que respondan tanto a parámetros de rigor académico y capacidad de análisis, como a la experimentación y la creación de nuevos lenguajes, al tiempo que se fomenta el potencial innovador del diseño.With this publication, EINA, University School of Design and Art, affiliated to the Autonomous University of Barcelona, brings to the public eye the Final Degree Projects presented during the 2014-2015 academic year. Our hope is that this volume might offer a more precise idea of the task performed by EINA in training new designers, able to speak both professionally and intellectually to the needs and demands of our society. The educational task is oriented towards results that might respond to the parameters of academic rigour and the capacity for contextual analysis, as well as to considerations of experimentation and the creation of new languages, all the while reinforcing design’s innovative potential

Updating the approaches to define susceptibility and resistance to anti-tuberculosis agents: implications for diagnosis and treatment

11 páginas, 2 figuras, 1 tablaInappropriately high breakpoints have resulted in systematic false-susceptible AST results to anti-TB drugs. MIC, PK/PD and clinical outcome data should be combined when setting breakpoints to minimise the emergence and spread of antimicrobial resistance.I. Comas was supported by PID2019-104477RB-I00 from the Spanish Science Ministry and by ERC (CoG 101001038)Peer reviewe

Constructive loans as an alternative to the secondary adjustment

Related transactions represent 60% of worldwide transactions (OCDE 2015). The price agreed on this kind of transaction is called transfer pricing and they represent one of the most controversial issues in business internationalization. The arm's length principle is the fundamental criterion for related transactions. When tax administration identified transfer pricing does not fit with this principle, they could impose adjustments. In Spain, this adjustment is carried out by considering constructive transactions such as a constructive dividend or constructive equity. However, OECD (2010) considers a third alternative to implement this adjustment: constructive loans. The EU members show no inclination to constructive loans as a tool to amend related transactions. However, constructive loans offer tax advantages over the other constructive alternatives. These advantages refer to offering a harmonized mechanism for adjusting related transactions, reducing conflict over the secondary adjustment in the Spain environment, and promoting equity restitution, among others.Las transacciones relacionadas representan el 60% de las transacciones mundiales (OCDE 2015). El precio pactado en este tipo de transacciones se denominan precios de transferencia y representan uno de los temas más controvertidos en la internacionalización empresarial. El principio de plena competencia es el criterio fundamental para las transacciones relacionadas. Cuando la administración tributaria identifique que los precios de transferencia no se ajustan a este principio, podría imponer ajustes. En España, este ajuste se realiza considerando transacciones constructivas como un dividendo constructivo o un patrimonio constructivo. Sin embargo, la OCDE (2010) considera una tercera alternativa para implementar este ajuste: los préstamos constructivos. Los miembros de la UE no muestran inclinación por los préstamos constructivos como herramienta para modificar transacciones relacionadas. Sin embargo, los préstamos constructivos ofrecen ventajas fiscales sobre las otras alternativas constructivas. Estas ventajas se refieren a ofrecer un mecanismo armonizado para ajustar transacciones relacionadas, reducir la conflictividad por el ajuste secundario en el entorno de España y promover la restitución patrimonial, entre otras

Acquired Resistance of <i>Mycobacterium tuberculosis</i> to Bedaquiline

<div><p>Bedaquiline (BDQ), an ATP synthase inhibitor, is the first drug to be approved for treatment of multi-drug resistant tuberculosis in decades. <i>In vitro</i> resistance to BDQ was previously shown to be due to target-based mutations. Here we report that non-target based resistance to BDQ, and cross-resistance to clofazimine (CFZ), is due to mutations in Rv0678, a transcriptional repressor of the genes encoding the MmpS5-MmpL5 efflux pump. Efflux-based resistance was identified in paired isolates from patients treated with BDQ, as well as in mice, in which it was confirmed to decrease bactericidal efficacy. The efflux inhibitors verapamil and reserpine decreased the minimum inhibitory concentrations of BDQ and CFZ <i>in vitro</i>, but verapamil failed to increase the bactericidal effect of BDQ in mice and was unable to reverse efflux-based resistance <i>in vivo</i>. Cross-resistance between BDQ and CFZ may have important clinical implications.</p></div

Regulation of efflux pumps proteins in EH3.6 and EH3.2.

<p>Efflux pump proteins were selected from the complete dataset of the proteome analysis (<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0102135#pone.0102135.s003" target="_blank">Table S1</a>). The descriptions of the genes were retrieved from TubercuList (<a href="http://tuberculist.epfl.ch/" target="_blank">http://tuberculist.epfl.ch/</a>).</p

MICs of BDQ and CFZ of preclinical strains with EPIs.

<p>MICs of BDQ and CFZ of preclinical strains, in the absence and presence of verapamil (40 µg/ml) or reserpine (3 µg/ml). Each value is the average of 3 independent experiments. For MIC without EPIs, fold-changes between brackets represent the difference between resistant and wild-type MICs. For MICs in the presence of EPIs, fold-changes between brackets represent the differences between MIC with and without EPI. <b>BDQ</b>: bedaquiline; <b>CFZ</b>: clofazimine; <b>RES</b>: reserpine; <b>VER</b>: verapamil.</p

Mechanism of BDQ and CFZ resistance in <i>Rv0678</i> mutants.

<p><b>A.</b> Regulation of <i>mmpS5</i> and <i>mmpL5</i> transcription by wild type Rv0678 repressor. Rv0678 protein binds to the intergenic region located between <i>Rv0678</i> and <i>mmpS5</i>, which contains the-10 consensus boxes of promoters for both <i>Rv0678</i> and <i>mmpS5</i>. This prevents the RNA polymerase to start transcription, resulting in the decrease of expression of MmpS5, MmpL5 and Rv0678 proteins. In response to an unknown stimulus, the regulator detaches from DNA and transcription can be resumed. <b>B.</b> Lack of regulation in <i>Rv0678</i> mutants. The strains carrying frame shifting mutations in <i>Rv0678</i> will not produce a functional repressor, thus the transcription of <i>mmpS5, mmpL5</i> and <i>Rv0678</i> will be increased. If the mutation results in an amino acid polymorphism, the protein may still be functional, but with reduced DNA-binding ability depending on the location of the mutation. In either case, the final consequence will be an increase in the expression levels of the proteins MmpS5, MmpL5 and Rv0678.</p