The role of pericytes in the generation hematopoietic stem cells in the mouse embryo

Tese de mestrado, Bilogia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018Hematopoiesis is a complex process that gives rise to hematopoietic stem cells (HSCs) and progenitors responsible for the production of all blood cells in the organism. This process is defined by two major waves: primitive and definitive haematopoiesis. In the primitive haematopoiesis, the yolk sac gives rise to erythrocytes, macrophages and megakaryocytes during early embryonic development. This wave is transitory and contribute to the survival of the early embryo. In the definitive haematopoiesis that occurs in the mid-gestation of mouse embryos hematopoietic stem cells are generated from hemogenic endothelial cells found in the aortic wall. These are adult-type HSCs, that are multilineage, are able to reconstitute hematopoietic system of both primary and secondary host irradiated mice upon transplantation in vivo. It is unclear how these HSCs born in the aorta. The microenvironment surrounding the dorsal aorta was shown to influence their birth. However, what are the exact cell types involved in this process remains unclear. We here found that the dorsal aorta is surrounded by three layers of perivascular cells, including pericytes, that are phenotypically and genetically distinct. Recent work showed that pericytes support adult HSCs but whether they also support their birth is not known. The proximal layers express PDGFRβ, known to be involved in pericyte recruitment and to control smooth muscle cell proliferation. Our general hypothesis is that PDGFRβ is required to generate HSCs in the mouse embryo. To address this, we used the PDGFRβ knock-out mouse model. The deletion of this receptor in mice leads to a reduced number of pericytes and vascular smooth muscle cells in the developing embryo following by death before birth. In this study, we performed in vitro and in vivo hematopoietic assays, as well as flow cytometry and immunohistochemistry to characterise wild-type and PDGFRβ mutant embryos at the time of HSC generation. Our preliminary data indicate that both hematopoietic progenitor and stem cell activities are impaired in mutant embryos. Blood vessel integrity is not affected at this stage. However, we found that the percentage of hemogenic endothelial cells, which are HSC precursors significantly decrease in the mutant embryos. Altogether, my data demonstrate that PDGFRβ signalling is required to generate the first HSCs in the mouse embryo. This study is of high importance for the understanding of how hematopoietic cells are generated in vivo and for the identification of the key cells in its surrounding environment responsible for its production, so that this process can be transposed into in vitro assays for its production.Hematopoiese é o processo responsável pela formação e maturação de células sanguíneas no organismo desde o desenvolvimento embrionário e durante toda a sua vida. Células estaminais hematopoéticas (HSCs) são primeiro geradas no embrião. Estas células apresentam três propriedades principais: 1) são multipotentes e dão origem a todos os tipos de células do sangue, 2) reconstituem o sistema hematopoiético a longo-termo quando transplantadas in vivo em recipientes irradiados e 3) têm capacidade de autorrenovação. Assim, HSCs irão dar origem a células-filhas idênticas a si mesmas e a progenitores, que irão diferenciar-se em células sanguíneas adultas. Em vertebrados, a hematopoiese embrionária é caracterizada por duas fases principais: primitiva e definitiva. Hematopoiese primitiva ocorre no embrião no sétimo dia de desenvolvimento (E7) onde células sanguíneas, macrófagos e megacariócitos emergem do saco amniótico e entram em circulação. Estas células são imaturas e com um tempo de vida curto, não sendo capazes de sustentar a contínua produção de células hematopoiéticas. No dia E10.5 do desenvolvimento HSCs são geradas na região da aorta-gonadas-mesonefros (AGM), definindo o início da hematopoiese definitiva. Aqui, HSCs resultantes têm características de células adultas com as propriedades definidas anteriormente. Estas são produzidas a partir da diferenciação de células endoteliais com potencial hematopoiético (HECs) na parte ventral da aorta dorsal e formam aglomerados celulares (clusters) intra-aórticos. Contudo, os mecanismos que levam a esta formação estão por esclarecer. Estudos recentes mostram que a interação entre células endoteliais e o mesenquima adjacente controla o comportamento de HECs em embriões de galinha aquando do aparecimento de HSCs. Estudos do nosso laboratório e outros mostram que o microambiente tem um papel importante na formação de HSCs; contudo, ainda não se sabe que células desempenham este papel, nem que sinais estão envolvidos. Vários estudos mostram que na medula óssea adulta, células do estroma, e em particular pericitos, têm um papel crucial no suporte e manutenção de HSCs, mas nada se sabe sobre o papel de pericitos em tecidos hematopoiéticos em embriões de ratinhos. A fim de abordar esta questão, neste projeto foi utilizado um modelo de ratinho onde PDGFRβ é eliminado (PDGFRβ-KO). Para entender se o knock-out do sinal de PDGFRβ em embriões E11 afeta o aparecimento de progenitores hematopoiéticos e células estaminais, ensaios in vitro e in vivo, assim como análises de citometria de fluxo e técnicas de imunohistoquímica foram feitos ao longo do estudo realizado. Primeiro, através de imunohistoquímica, foram identificadas quais as células que compõem o microambiente envolvente da aorta. Três camadas celulares principais foram identificadas devido aos seus distintos fenótipos. A primeira camada é composta por pericitos, que se encontram adjacentes ao endotélio da aorta e embebidos na membrana basal (Coll IV+), estes foram definidos como CD31-C-kit-CD45-NG2+PDGFRβ+. À volta destas células estão células PDGFRβ+ (nomeadas de sub-pericitos), CD31-C-kit-CD45-NG2-PDGFRβ+, que são por sua vez rodeadas por outras células mesenquimais do estroma (CD31-C-kit-CD45-NG2-PDGFRβ‾). Estas células foram isoladas por FACS (Fluorescence-activated Cell Sorting), e o RNA foi sequenciado, para descrever os seus perfis genéticos. A ausência da expressão de PDGFRβ é confirmada por citometria de fluxo e por imunohistoquímica nos embriões mutantes, validando assim o modelo utilizado. Ensaios hematopoiéticos in vivo e in vitro foram feitos para testar a ausência deste fator de crescimento na atividade hematopoiética. Com estes ensaios foi possível verificar que progenitores hematopoiéticos são afetados na região da AGM. Em contraste, o número de células progenitoras noutros órgãos hematopoiéticos como a placenta, o saco amniótico, cabeça e fígado fetal não são afetados, sugerindo que o papel de PDGFRβ na produção de progenitores hematopoiéticos é dependente do tecido. De seguida quisemos saber se células estaminais hematopoiéticas também eram afetadas na ausência de PDGFRβ. Para tal, foram feitos ensaios in vivo, onde a região da AGM de E11 embriões, tanto selvagens (wild-type, WT) como de mutantes, foram injetadas em ratinhos recetores que foram irradiados sub-letalmente. Os resultados preliminares obtidos mostram que a formação de HSCs é dependente de PDGFRβ, já que não há reconstituição do sistema hematopoiético de ratinhos hospedeiros aquando do transplante de AGM mutantes, em comparação com os controlos WT positivos. A questão que surge após a análise destes resultados é se o decréscimo do número de progenitores e a ausência de HSCs se deve a alterações da aorta dorsal, visto que os pericitos desempenham um papel importante na integridade dos vasos sanguíneos. Com o objetivo de esclarecer esta questão, foi feito um three-dimensional whole mount immunostaining, técnica de imunohistoquímica onde todo o embrião é corado e é possível visualizar toda a região da aorta nos embriões. Em mutantes de PDGFRβ verifica-se que não há alterações na morfologia da aorta, e os clusters intra-aórticos hematopoiéticos não são afetados em comparação com embriões WT. Por citometria de fluxo, estes resultados são confirmados: as percentagens de células endoteliais (CD31+) e de clusters hematopoiéticos (C-kit+CD31+) não alteram em embriões mutantes, confirmando que a integridade da dorsal aorta não é afetada com a eliminação de PDGFRβ neste estádio de desenvolvimento, entre E10.5-11. Um estudo feito por Richard et al. em 2013, demonstra que a comunicação entre células endoteliais e mesenquimais adjacentes em embriões de galinha, controlam a expressão de Runx1, um fator de transcrição necessário para gerar HSCs no embrião, expresso por HECs. Para testar se a expressão de Runx1 é afetada pela ausência de PDGFRβ, ratinhos PDGFRβ-KO foram cruzados com ratinhos que expressam Runx1-GFP, a fim de detetar GFP nos embriões aquando da expressão de Runx1. Por citometria de fluxo, os resultados obtidos mostram que em embriões onde PDGFRβ foi eliminado as percentagens de HECs decrescem significativamente em comparação com embriões WT e heterozigóticos, sugerindo que a sinalização através de PDGFRβ tem um papel no controlo do aparecimento de células estaminais hematopoiéticas num estádio de desenvolvimento anterior a estas serem produzidas. Ainda fica por esclarecer se células PDGFRβ+ são células do nicho ou precursores hematopoiéticos. Dados preliminares obtidos no laboratório mostram que células perivasculares PDGFRβ+ isoladas da aorta embriónica têm potencial hematopoiético in vitro. Trabalhos em curso visam testar se células provenientes de células PDGFRβ+ dão origem a células hematopoiéticas, a fim de concluir qual o papel destas como células no nicho. Será também importante confirmar quais das células que exprimem PDGFRβ, pericitos, sub-pericitos e/ou estroma, são responsáveis pelo efeito observado na atividade hematopoiética. Co-culturas com cada uma destas três populações perivasculares, em conjunto com células endoteliais, vão determinar quais as células capazes de potenciar a formação de células hematopoiéticas

Estudo de Sistemas de Produção Fotovoltaica para Autoconsumo de uma Biorrefinaria

A minha tese de mestrado insere-se na área da eficiência energética na indústria, mais em concreto uma biorrefinaria real, a Bioportdiesel S.A, localizada em Baltar. Após discussão do projeto a realizar, foi decidido em reunião com a mestranda, a orientadora e o administrador da empresa, o Eng. Mário Coelho que a melhor opção seria o estudo de sistema fotovoltaico para autoconsumo. Assim sendo, primeiramente foram analisadas as faturas elétricas durante o ano de 2015; foi realizada uma estimação dos diagramas de carga para cada mês do ano, um para os dias da semana, outro para o sábado e mais um para os domingos e feriados; obtive o preço praticado em cada mês do ano referido, tendo em conta a proposta tarifária atualmente em vigor.De momento, estou a analisar os resultados obtidos no software Homer, de modo a obter a potência ótima a instalar, e a potência que é possível instalar tendo em conta a área útil disponíve

Expectativas de bem-estar emocional face à reforma e momento de transição

Para a população portuguesa, o trabalho ocupa grande parte da sua vida assumindo um papel nuclear, central e vital. Desta forma e dadas as consequências que a ocorrência da reforma traz ao dia-a-dia de cada um, esta investigação visa estudar de que forma fatores como o arrependimento, flow no trabalho, legimitimidade e frequência da discriminação pela idade influenciam o bem-estar emocional nesta fase de transição, bem como na adaptação à reforma. Assim, a amostra foi constituida por 134 trabalhadores mais velhos entre os 40 e os 69 anos. Os resultados obtidos mostram que quanto mais flow, prazer e motivação intrínseca, os inquiridos sentem no seu local de trabalho, menos positivas são as suas emoções face à fase de transição para a reforma. Para além disso, quando introduzida a moderadora: proximidade à reforma, apenas a relação entre a frequência da discriminação com o mal-estar face à fase de transição, mostrou um efeito de interação significativo e positivo. Deste modo, quanto mais discriminação é percecionada pelos individuos devido à sua idade, mais mal-estar emocional os sujeitos perspetivam para a fase de transição. Esta relação intensifica-se quanto mais próximo da reforma se está. Também quanto ao momento da reforma propriamente dita, se verificou esta relação positiva e significativa. Por fim, os participantes revelam ter emoções menos positivas face à reforma quando sentem arrependimento ao longo da sua vida. Estes resultados são discutidos à luz dos modelos de preparação para a reforma e idadismo e implicações para as políticas sociais nestes domínios.Amongst Portuguese population, work takes up a large part of their lives, assuming a central, nuclear and vital relevance role. Moreover, given the consequences retirement brings to each one’s daily life, this investigation aims to study how factors such as regret, labour flow, age discrimination legitimacy and frequence influence the emotional well being at this transition stage, as well as in retirement adaptation. Thus, the sample consists of 134 older workers with ages between 40 and 69. Results show that the higher the flow, pleasure and self motivation are, less positive are emotions regarding the transition stage towards retirement. Furthermore, when introduciong the moderator variable: retirement proximity, only the relation between age discrimination frequency with negative feelings towards the transition stage reveled a significant and positive interaction effect. Thus, when individuals feel more discrimination regarding their age, more emotional negativity they perceive in their transition stage towards retirement. In fact, the closer the individuals are to retirement higher is this relation. Finally, participants revealed having less positive emotions towards retirement when they feel regret throughtout their lives or life experiences. These results are discussed in light of retirement preparation and ageism models, as well as social policies implications in these domains

A ESCRITA FEMININA EM FAZES-ME FALTA: CORPO MORTO, CORPUS DESCONTRUÍDO

The present study aims to present how in the work Fazes-me falta, written by Inês Pedrosa, one of the most significative voices of the Contemporary Portuguese Literature, the author, making use of the feminine writing, undertakes a critique of the condition of women in our present context while bringing this condition closer to the process of deconstruction of the novel. In other words, it aims to observe the fusion that is established between the body of the female character and the narrative corpus in its process of (de)construction. Exploratory and bibliographical, and making use of the feminine writing, the research reveals a questioning narrative of the official paradigm and the configuration of a woman-narrative, marked by incompleteness and fragmentation.O presente estudo objetiva apresentar como na obra Fazes-me Falta, de Inês Pedrosa, uma das mais significativas vozes da Literatura Contemporânea Portuguesa, a autora, valendo-se da Escrita Feminina, empreende uma crítica à condição da mulher em nosso atual contexto ao mesmo tempo em que aproxima essa condição ao processo de desconstrução da tessitura do romance. Ou seja, almeja-se observar a fusão que se estabelece entre o corpo da personagem feminina e o corpus narrativo em seu processo de (des)construção. De cunho exploratório e biográfico, e recorrendo aos conceitos de Escrita Feminina, a pesquisa evidencia-nos uma narrativa questionadora do paradigma oficial e a configuração de uma mulher-narrativa, marcada pela incompletude e fragmentação

The role of biomass elemental composition and ion-exchange in metal sorption by algae

The use of macroalgae, microalgae and cyanobacteria for metal sorption has been widely reported. Still, there are no studies allowing a direct comparison of the performance of these biomasses, especially while evaluating metal competition. The simultaneous sorption of Co2+, Cu2+, Ni2+ and Zn2+ present in a multi-elemental solution by six macroalgae, two microalgae and three cyanobacteria was evaluated. Brown macroalgae were shown to be the most promising biosorbent, with Undaria pinnatifida having a total metal sorption capacity of 0.6 mmol g-1. Overall, macroalgae performed better than microalgae, followed by cyanobacteria. Carboxyl groups were identified as being the main functional groups involved in metal sorption, and all biomass samples were found to be selective to Cu2+. This was linked not only to its higher complexation constant value with relevant functional groups when compared to the remaining metals, but also the Irving-Williams series. The release of K+ and Ca2+ to the aqueous solution during the metal sorption was followed. The obtained results suggest they are readily exchanged with metals in the solution, indicating the occurrence of an ion-exchange mechanism in metal sorption by most biomass. Red macroalgae are an exception to the reported trends, suggesting that their metal sorption mechanism may differ from the other biomass types.publishe

Synthesis of purine-based ionic liquids and their applications

Bio-based ionic liquids (ILs) are being increasingly sought after, as they are more sustainable and eco-friendly. Purines are the most widely distributed, naturally occurring N-heterocycles, but their low water-solubility limits their application. In this work, four purines (theobromine, theophylline, xanthine, and uric acid) were combined with the cation tetrabutylammonium to synthesize bio-based ILs. The physico-chemical properties of the purine-based ILs were characterized, including their melting and decomposition temperatures and water-solubility. The ecotoxicity against the microalgae Raphidocelis subcapitata was also determined. The ILs show good thermal stability (>457 K) and an aqueous solubility enhancement ranging from 53- to 870-fold, in comparison to their respective purine percursors, unlocking new prospects for their application where aqueous solutions are demanded. The ecotoxicity of these ILs seems to be dominated by the cation, and it is similar to chloride-based IL, emphasizing that the use of natural anions does not necessarily translate to more benign ILs. The application of the novel ILs in the formation of aqueous biphasic systems (ABS), and as solubility enhancers, was also evaluated. The ILs were able to form ABS with sodium sulfate and tripotassium citrate salts. The development of thermoresponsive ABS, using sodium sulfate as a salting-out agent, was accomplished, with the ILs having different thermosensitivities. In addition, the purine-based ILs acted as solubility enhancers of ferulic acid in aqueous solution.publishe