Role of adenosine A2A receptors in the neuroprotective effect of corticotrophin releasing hormone (CRH)

Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010O factor de libertação da corticotrofina (corticotrophin releasing factor, CRF) é um componente essencial na regulação do stresse. No eixo hipotálamo-hipofisário (hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA) é libertado do hipotálamo, activando os receptores de subtipo CRF1R e CRF2R, que regulam a libertação de corticotrofina pela hipófise. Esta, por sua vez, induz a libertação de glucocorticóides das glândulas supra-renais. Findo o período de stresse, os glucocorticóides regulam negativamente a libertação de CRF e diminuem a activação do eixo HPA, restabelecendo a homeostasia inicial do sistema. Recentemente, para além da sua acção no eixo HPA, a presença dos receptores de CRF foi observada em neurónios provenientes de outras áreas cerebrais como o córtex ou o hipocampo. O CRF tem funções neuroprotectoras perante vários tipos de insulto, como a excitotoxicidade induzida por glutamato, a agregação da proteína β-amilóide ou a indução de stress oxidativo. Curiosamente, a adenosina, um neuromodulador, exerce o mesmo tipo de função neuroprotectora em áreas cerebrais semelhantes, por activação dos seus receptores. Enquanto a activação dos receptores de adenosina de subtipo A1 (A1R) induz um decréscimo da excitabilidade neuronal, a activação dos receptores de subtipo A2A (A2AR), na generalidade, aumenta-a. Estes receptores possuem grande afinidade para a adenosina e estão presentes na maioria das áreas cerebrais, embora com diferentes níveis de expressão. Assim, para modular a excitabilidade neuronal existem estratégias farmacológicas que consistem quer na activação dos A1R quer no bloqueio dos A2AR. No entanto, a última abordagem tem sido recentemente mais investigada e é largamente usada na prevenção de morte celular tanto em modelos in vitro como in vivo. Em situações de isquémia, observa-se tanto um aumento dos níveis de CRF como de adenosina no cérebro de rato. Este aumento sugere uma acção relevante destes mediadores quer na manutenção da viabilidade neuronal quer na regulação da expressão de diversos genes importantes para o desenvolvimento e diferenciação neuronal. Por outro lado, sugere uma possível interacção entre os receptores do CRF e da adenosina. Esta hipótese tornou-se ainda mais provável após a observação, no nosso laboratório, que a administração oral de antagonistas dos receptores A2A reverte os efeitos do stresse no hipocampo, induzidos por separação maternal em ratos. Esta reversão pode ser consequência de regulação dos constituintes do eixo HPA, como os glucocorticóides ou o CRF. Adicionalmente, as vias de sinalização intracelular activadas pela acção do CRF (através dos receptores CRF1R e CRF2R) e da adenosina (através dos A2AR) são semelhantes. Envolvem activação de proteínas Gs com consequente aumento de actividade de cinases de proteínas, como a cinase A (PKA), a cinase C (PKC) e a mitogen-activated protein kinase (MAPK). O objectivo deste trabalho foi estudar a acção do CRF na viabilidade celular em condições de excitoxicidade induzida por glutamato e avaliar a possível interacção com os receptores de adenosina do subtipo A2A. Foram usadas culturas primárias de neurónios de córtex de embriões de rato com 18 dias de gestação. Ao oitavo dia, as culturas foram tratadas durante 24 horas com glutamato, nas concentrações de 20 a 1000 μM, em condições de bloqueio ou activação dos receptores A2A e do CRF, através da aplicação de agonistas e antagonistas dos respectivos receptores. O glutamato é um aminoácido excitatório e um dos responsáveis pela excitotoxicidade induzida por eventos isquémicos no sistema nervoso central. Ao actuar nos receptores ionotropicos de glutamato induz a entrada de cálcio e sódio extracelulares assim como a libertação de cálcio do reticulo endoplasmático. O aumento de cálcio e sódio intracelulares, pode levar à morte celular quer por apoptose quer por necrose. A técnica de marcação simultânea com as sondas nucleares iodeto de propidio (PI) e Syto-13 foi usada com o objectivo de caracterizar a viabilidade celular nas diferentes condições. Inicialmente, foi investigada a concentração de glutamato (de 20 a 1000 μM) a ser aplicada às células em cultura com o objectivo de reproduzir as consequências de um insulto neuronal in vivo. Simultaneamente aos ensaios de viabilidade celular, foram determinados os níveis de um mediador de morte por apoptose, a caspase-3, pela técnica de Western blotting. Este insulto provocou um decréscimo na viabilidade celular que é dependente da concentração de glutamato usada, sendo superior para concentrações mais altas. Por seu lado, a activação da via apoptótica ocorre preferencialmente para baixas concentrações de glutamato (até 50 μM). Para o desenvolvimento do restante trabalho a concentração seleccionada foi a de 100 μM, que causou uma diminuição para 76,4±1,63% (n=4) da viabilidade celular, visto originar tanto morte por apoptose como por necrose neste modelo. A função neuroprotectora do CRF na gama de concentrações de glutamato anteriormente descrita foi observada através da aplicação de urocortina (10 pM), um composto da família do CRF com semelhante afinidade para os dois receptores de CRF. Embora a urocortina aparente ter funções protectoras em todas as concentrações de glutamato usadas, o aumento mais significativo na viabilidade neuronal foi observado na presen- ça de glutamato 100 μM (de 76,4±1,63% para 90,5±2,23%, P<0,001, n=3). Esta variação na sobrevivência neuronal, perante um insulto neurotóxico, não apresenta o mesmo padrão nos níveis de caspase-3. Para baixas concentrações de glutamato a urocortina aumenta os níveis de caspase-3, enquanto para concentrações de glutamato elevadas, os níveis deste marcador apoptótico parecem diminuir. Esta proteína, característica da indução de morte celular por apoptose exclui o dano causado por necrose. Durante esta primeira etapa do trabalho conclui-se que a urocortina exerce funções protectoras sobretudo na prevenção do processo necrótico induzido pelo glutamato. Numa etapa seguinte foram diferenciados os efeitos dos dois tipos de receptores do CRF na neuroprotecção. Assim, usando dois antagonistas selectivos, antalarmina (10nM) para CRF1R e anti-Sauvagina-30 (10nM) para CRF2R, foi observado que o bloqueio de cada um dos receptores de forma independente leva à perda da função da urocortina (73,9±3,53% bloqueando os CRF1R, P<0,01 n=4, e 76,0±2,80% ao bloquear os CRF2R, P<0,01, n=4). Conclui-se que a activação simultânea dos dois receptores pela urocortina é necessária para que ela exerça o seu efeito neuroprotector perante um insulto de glutamato (100 μM). Durante este processo de bloqueio dos receptores de CRF, observou-se uma interacção directa entre os dois fármacos usados, antalarmina e anti-Sauvagina-30, que os impede de bloquear eficientemente os receptores de CRF, quando usados em simultâneo. Esta interacção foi avaliada através de técnicas de fluorescência que permitem observar a diminuição do sinal produzido pelo aminoácido fenilalanina, presente na anti-Sauvagina-30, com a adição de concentrações crescentes de antalarmina. Assim, quando introduzidos simultaneamente no meio celular, são ineficazes a bloquear o efeito da urocortina. Após a observação da função da urocortina na protecção da morte celular induzida por glutamato, estudou-se a modulação exercida pelos A2AR nesse efeito. Confirmou-se que o bloqueio dos A2AR, através do antagonista SCH 58261 (50 nM) é neuroprotector. Por outro lado, a activação deste subtipo de receptores está descrita como nociva para este tipo de células. Contudo, a activação directa destes receptores pelo agonista selectivo, CGS 21680 (30nM), não alterou a viabilidade celular, provavelmente devido à elevada concentração de adenosina no meio extracelular. A modulação simultânea dos receptores A2A e de CRF revelou a existência de uma interacção entre os mesmos. A neuroprotecção conferida pelo bloqueio dos A2AR é dependente da activação dos receptores de CRF do tipo 2 mas independente dos do tipo 1, facto que foi observado pelo bloqueio selectivo dos receptores de CRF em condições de antagonismo dos A2AR. A protecção concedida pelo antagonista SCH 58261 é suprimida quando os CRF2R se encontram bloqueados (de 88,3±1,53% para 74,8±4,91%, P<0,01, n=5) revelando-se independente do bloqueio dos CRF1R (87,7±3,48%, n=4). Simultaneamente, em células PC12 diferenciadas com Nerve Growth Factor (NGF), observou-se a modulação dos níveis dos A2AR pelos seus ligandos. A activação dos A2AR diminui os seus níveis (48,9±5,5%, P<0,001, n=4), enquanto o bloqueio os aumenta (144±15,2%, P<0,01, n=5). Os ligandos dos receptores de CRF não alteram os níveis dos A2AR em condições basais. Porém, quando aplicados em simultâneo com os ligandos dos A2AR o mesmo não se observa. Concretamente, ocorre uma redução nos níveis dos A2AR na presença do seu antagonista quando os receptores CRF1R se encontram bloqueados e os CRF2R activados (39,4±14,4% do controlo, P<0,01, n=4). Em suma, este trabalho permitiu observar a função neuroprotectora dos receptores do CRF em neurónios em cultura perante um insulto de glutamato, quer pela acção directa nos seus receptores quer pela modulação dos receptores de adenosina do subtipo A2A. O modelo usado permite diferenciar as alterações na viabilidade das células em cultura por duas vias de promoção da morte celular, apoptose e necrose, respectivamente para baixas e elevadas concentrações de glutamato. A neuroprotecção conferida pelo CRF ocorre sobretudo na prevenção da morte celular por necrose e é dependente da activação simultânea dos dois tipos de receptores, CRF1R e CRF2R. Para além dos efeitos directos através dos seus receptores, o CRF exerce uma modulação dos A2AR. Estes receptores apresentam expressão diminuída em condições de activação dos CRF2R e bloqueio dos A2AR. Este fenómeno de regulação dos A2AR por parte dos CRF2R constitui uma alternativa à protecção por CRF atrás descrita. Novas abordagens terapêuticas, que incluam a modulação destes dois tipos de receptores podem ser futuramente testadas com o objectivo de diminuir a morte neuronal provocada por insultos excitotóxicos em eventos isquémicos.In hypoxia, glutamate excitotoxicity induces neuronal death. Simultaneously, adenosine is released and is accompanied by an increase of the stress mediator, corticotrophinreleasing factor (CRF). In vivo modulation of adenosine A2A receptors (A2AR) reverses hippocampal stress-induced effects. This raises the question whether A2AR regulate CRF actions. We now evaluated the interaction between the blockade of A2AR and the activation of CRF receptors (CRFR), upon glutamate insult. Primary rat cortical neuronal cultures (9 days in vitro) were challenged with glutamate (20-1000μM, 24 hours). The effects of the CRFR and A2AR ligands on cell viability were measured using propidium iodide and Syto-13 fluorescence staining. Pro-caspase-3 fragmentation was used as an apoptotic marker. A2AR levels were quantified in NGFdifferentiated PC12 cells by Western blotting. Glutamate decreased cell viability in a concentration-dependent manner. At 100 μM we observed a reduction of viability to 76.4±1.63% of control (P<0.001, n=6). Urocortin (10pM), a CRFR agonist, increased cell survival to 90.5±2.23% (P<0.001 compared to glutamate, n=3). This effect was abolished by blocking either CRF1R or CRF2R with antalarmin (10nM) or anti-Sauvagine-30 (10nM), respectively. Activation of A2AR did not affect cell death induced by glutamate. However, A2AR blockade with a selective antagonist SCH 58261 (50nM) improved cell viability against the glutamate insult. This effect was dependent on CRF2R but not on CRF1R activation. The A2AR levels measured in PC12 cells were modulated by CRF2R. The A2AR upregulation induced by SCH 58261 (144±15.2%, P<0.01 n=5; 50 nM) was abolished by CRF2R (P<0.01, n=4) but not by CRF1R activation. Overall these data show a protective role of CRF in cortical neurons, against glutamateinduced death, either directly by CRFR activation or by modulating A2AR actions. The neuroprotection achieved by A2AR blockade requires CRF2R activation, which might result from CRF2R modulation of A2AR levels. The interaction between these receptors may point toward novel pharmacological approaches based on common molecular pathways

Tecnologias nas bibliotecas escolares

Trabalho de projeto, Educação (Área de especialização em Educação e Tecnologias Digitais), Universidade de Lisboa, Instituto de Educação, 2015O acesso à informação é hoje muito facilitado pelas Tecnologias da Informação e Comunicação e pelas ferramentas Web 2.0. Atualmente, o papel da escola é, de forma igualitária, facilitar o acesso às tecnologias e à informação e de, através dela, possibilitar a construção de conhecimento pelos alunos. A biblioteca escolar apresenta-se como o local, por excelência, onde os alunos podem obter informação e adquirir competências fundamentais para a conseguirem manipular e aprender com ela. Para que isso aconteça terá de existir a intervenção do Professor Bibliotecário, como promotor desse processo. O estudo aqui apresentado pretende dar a conhecer contextos e tipos de utilização das TIC e das ferramentas Web 2.0 na dinamização das bibliotecas escolares, pelos professores bibliotecários que nelas trabalham. Na fundamentação teórica traçamos um enquadramento sobre a Sociedade da Informação e a alteração do paradigma da Educação. Abordamos a integração das tecnologias na Escola, o papel das bibliotecas escolares e dos professores bibliotecários na exploração das TIC e das ferramentas Web 2.0 e como o seu uso potencia situações de aprendizagem significativa. Esta investigação de cariz qualitativo, que se enquadra num estudo de caso, envolveu sete participantes que pertencem a um grupo concelhio de professores bibliotecários integrados no Programa da Rede de Bibliotecas Escolares, com experiência na utilização das TIC na sua prática diária. Para a obtenção de dados recorreu-se à análise documental e a um guião de entrevista, recolhendo assim informação na perspetiva e experiência dos envolvidos. Este estudo permitiu-nos concluir que as TIC e as ferramentas Web 2.0 são, fundamentalmente, utilizadas para tarefas de gestão e de divulgação das atividades realizadas na biblioteca escolar e que essa utilização está muito centrada no professor bibliotecário, dependendo da sua iniciativa e motivação. Concluímos ainda que estamos distantes de uma biblioteca escolar com verdadeiros serviços interativos.Access to information, through ICT and Web 2.0 tools, is very easy today. Nowadays, the role of schools is to facilitate access to technologies and information equally, and through it, enable students to build its own knowledge. The school library is the venue where students can obtain information and fundamental skills to work and learn with it. For this to happen, a librarian teacher as promoter of success is necessary. The research presented here aims at divulging contexts and ways of using ICT and Web 2.0 tools in invigorating school libraries, with intervention from the librarian teachers that work there. In the theoretical framework, we outline the education paradigm change in view of the knowledge-based society. We discuss technology integration in school, and the role of school libraries and its librarian teachers in exploring ICT and Web 2.0 tools, and how its use enhances significant learning situations. This research is a qualitative study which falls in a case study involving seven participants, part of a librarian teachers’ municipality group, integrated into the School Libraries Network Program, with experience in the use of ICT. To collect data, we made a document analysis, along with an interview guide, to obtain information based in the participant point of view and experience. This study allowed us to conclude that ICT and Web 2.0 tools are mainly used for management tasks and to promote school library activities and that this use is focused in the librarian teacher, depending on their action and motivation. We also concluded that we are far away from a school library with true interactive services

HDAC6 is a bruchpilot deacetylase that facilitates neurotransmitter release

Presynaptic densities are specialized structures involved in synaptic vesicle tethering and neurotransmission; however, the mechanisms regulating their function remain understudied. In Drosophila, Bruchpilot is a major constituent of the presynaptic density that tethers vesicles. Here, we show that HDAC6 is necessary and sufficient for deacetylation of Bruchpilot. HDAC6 expression is also controlled by TDP-43, an RNA-binding protein deregulated in amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Animals expressing TDP-43 harboring pathogenic mutations show increased HDAC6 expression, decreased Bruchpilot acetylation, larger vesicle-tethering sites, and increased neurotransmission, defects similar to those seen upon expression of HDAC6 and opposite to hdac6 null mutants. Consequently, reduced levels of HDAC6 or increased levels of ELP3, a Bruchpilot acetyltransferase, rescue the presynaptic density defects in TDP-43-expressing flies as well as the decreased adult locomotion. Our work identifies HDAC6 as a Bruchpilot deacetylase and indicates that regulating acetylation of a presynaptic release-site protein is critical for maintaining normal neurotransmission

Characterisation of the mural paintings from the Misericordia Church of Odemira (Portugal)

Several mortars from mural paintings were collected from the Misericórdia Church of Odemira and analysed by using different techniques namely X-ray diffraction, thermogravimetric analysis with differential thermal analysis, SEM-EDX, optical microscopy, CHNS elemental analysis and chemical analysis. Microfragments of paint layers were collected and analysed by microchemical analysis. The results showed that the mortars are aerial lime mortars with siliceous aggregates and that the pigments used were from local sources

A Rare Presentation of Breast Cancer

Breast cancer is the most common tumour in women. Only 5–15% of breast cancer patients have distant metastases at diagnosis. Here we describe the case of a previously healthy 43-year-old woman with nausea, postprandial epigastric pain, and constipation as the first clinical presentation of breast cancer. Total colonoscopy revealed colon metastases and the immunohistochemical profile favoured primitive invasive lobular carcinoma of the breast. Gastrointestinal tract metastases are more frequent in lobular histology of breast cancer. Stomach and small intestine are the most common metastatic sites, while colon metastases are a rare occurrence

Double Trouble: Spontaneous Duodenal Hematoma of Pancreatic Origin

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Innate immune activation and aberrant function in the R6/2 mouse model and Huntington’s disease iPSC-derived microglia

Huntington’s disease (HD) is an inherited autosomal dominant neurodegenerative disease caused by CAG repeats in exon 1 of the HTT gene. A hallmark of HD along with other psychiatric and neurodegenerative diseases is alteration in the neuronal circuitry and synaptic loss. Microglia and peripheral innate immune activation have been reported in pre-symptomatic HD patients; however, what “activation” signifies for microglial and immune function in HD and how it impacts synaptic health remains unclear. In this study we sought to fill these gaps by capturing immune phenotypes and functional activation states of microglia and peripheral immunity in the R6/2 model of HD at pre-symptomatic, symptomatic and end stages of disease. These included characterizations of microglial phenotypes at single cell resolution, morphology, aberrant functions such as surveillance and phagocytosis and their impact on synaptic loss in vitro and ex vivo in R6/2 mouse brain tissue slices. To further understand how relevant the observed aberrant microglial behaviors are to human disease, transcriptomic analysis was performed using HD patient nuclear sequencing data and functional assessments were conducted using induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived microglia. Our results show temporal changes in brain infiltration of peripheral lymphoid and myeloid cells, increases in microglial activation markers and phagocytic functions at the pre-symptomatic stages of disease. Increases in microglial surveillance and synaptic uptake parallel significant reduction of spine density in R6/2 mice. These findings were mirrored by an upregulation of gene signatures in the endocytic and migratory pathways in disease-associated microglial subsets in human HD brains, as well as increased phagocytic and migratory functions of iPSC-derived HD microglia. These results collectively suggest that targeting key and specific microglial functions related to synaptic surveillance and pruning may be therapeutically beneficial in attenuating cognitive decline and psychiatric aspects of HD

An improved method for large scale generation and high-throughput functional characterization of human iPSC-derived microglia

Neuroscience drug discovery has faced significant challenges due to restricted access to relevant human cell models and limited translatability of existing preclinical findings to human pathophysiology. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have emerged as a promising solution, offering the potential to generate patient-specific cell types, including in the recent years, iPSC-derived microglia (iMGL). Current methods rely on complex and time-consuming differentiation procedures, leading to considerable batch-to-batch variability consequently hindering the establishment of standardized and reproducible high-throughput functional screening approaches. Addressing these challenges is critical in ensuring the generation of homogenous iMGL populations with consistent functional properties. In this study we describe an improved high-yield protocol for generating iMGL, which allows for increased reproducibility and flexibility in the execution of high-throughput functional screens. We introduce a two-step process in embryoid bodie (EB) maintenance and a stop point allowing for cryopreservation at the hematopoietic progenitor cell (iHPC) stages. Furthermore, we demonstrate inter-operator robustness of this modified protocol in a range of high-throughput functional assays including phagocytosis, lysosomal acidification, chemotaxis, and cytokine release. Our study underscores the importance of quality control checks at various stages of iPSC-differentiation and functional assay set up, highlighting novel workarounds to the existing challenges such as limited yield, flexibility, and reproducibility, all critical in drug discovery

Innovation for Sustainability and Networking

Throughout human history, innovation has been the main factor in adapting humanity to its settings. On the basis of earlier practice, human creativity allows the finding of new, permanent ways to do things. their applications encourage new spaces, new necessities and new lifestyles. Innovation has been an element of human capacities from its earlier stages, but it has been recognized only recently as a clear device of social and economic change

Overexpression of Adenosine A2A receptors in rats: effects on depression, locomotion, and anxiety

Copyright: © 2014 Coelho, Alves, Canas, Valadas, Shmidt, Batalha, Ferreira, Ribeiro, Bader, Cunha, do Couto and Lopes. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (CC BY). The use, distribution or reproduction in other forums is permitted, provided the original author(s) or licensor are credited and that the original publication in this journal is cited, in accordance with accepted academic practice. No use, distribution or reproduction is permitted which does not comply with these terms.Adenosine A2A receptors (A2AR) are a sub-type of receptors enriched in basal ganglia, activated by the neuromodulator adenosine, which interact with dopamine D2 receptors. Although this reciprocal antagonistic interaction is well-established in motor function, the outcome in dopamine-related behaviors remains uncertain, in particular in depression and anxiety. We have demonstrated an upsurge of A2AR associated to aging and chronic stress. Furthermore, Alzheimer's disease patients present A2AR accumulation in cortical areas together with depressive signs. We now tested the impact of overexpressing A2AR in forebrain neurons on dopamine-related behavior, namely depression. Adult male rats overexpressing human A2AR under the control of CaMKII promoter [Tg(CaMKII-hA2AR)] and aged-matched wild-types (WT) of the same strain (Sprague-Dawley) were studied. The forced swimming test (FST), sucrose preference test (SPT), and the open-field test (OFT) were performed to evaluate behavioral despair, anhedonia, locomotion, and anxiety. Tg(CaMKII-hA2AR) animals spent more time floating and less time swimming in the FST and presented a decreased sucrose preference at 48 h in the SPT. They also covered higher distances in the OFT and spent more time in the central zone than the WT. The results indicate that Tg(CaMKII-hA2AR) rats exhibit depressive-like behavior, hyperlocomotion, and altered exploratory behavior. This A2AR overexpression may explain the depressive signs found in aging, chronic stress, and Alzheimer's disease.Joana E. Coelho, Vânia L. Batalha and Diana G. Ferreira were supported by a grant from Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT); Paula M. Canas and Rodrigo A. Cunha were supported by FCT (PTDC/SAU-NSC/122254/2010) and Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA, grant 09-68-ESR- FP-010). Luísa V. Lopes is an Investigator FCT, funded by Fundação para a Ciência e Tecnologia (PTDC-099853/2009) and Bial.info:eu-repo/semantics/publishedVersio