4 research outputs found
Stabilisation of epithelial barrier function in the gut via HNF-4α dependent down-regulation of claudin-2 by sodium butyrate
Es ist bekannt, dass die kurzkettige FettsÀure Butyrat protektive Effekte auf
den Darm ausĂŒbt, indem es z.B. bei Patienten mit chronisch entzĂŒndlichen
Darmerkrankungen (CED) eine Stabilisierung der epithelialen Barrierefunktion
oder Induktion antiinflammatorischer Effekte bewirkt. Zudem besitzt Butyrat
wichtige Funktionen bei der Zelldifferenzierung und der Induktion von
Apoptosen. Zahlreiche Gene der Zelle werden durch Butyrat reguliert, indem es
als Histon-Deacetylase-Inhibitor (HDACi) fungiert. Ziel dieser Arbeit war es,
die Mechanismen des Effekts von Butyrat auf die epitheliale Barriere des Darms
aufzuklÀren. In einem geeigneten Modell-Epithel, der humanen Kolonkarzinom-
Zelllinie HT-29/B6-GR/MR, konnte gezeigt werden, dass Butyrat zeitabhÀngig den
transepithelialen Widerstand (Rt, TER) erhöht, was auf eine Erhöhung des
parazellulĂ€ren Widerstandes (Rpara) zurĂŒckgefĂŒhrt werden konnte. In
Expressionsanalysen konnte sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene gezeigt
werden, dass dieser Effekt durch die Reduktion der Expression des Tight
Junction-MolekĂŒls Claudin-2 verursacht wurde. Diese Reduktion korrelierte mit
einer verminderten Na+-PermeabilitÀt unter Butyrat, was wiederum auf die
Kationenkanal-Eigenschaften von Claudin-2 zurĂŒckzufĂŒhren ist. Andere
barriererelevante Claudine blieben unter dem Einfluss von Butyrat unverÀndert.
Mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass
Claudin-2 unter dem Einfluss von Butyrat zunÀchst aus dem Zytoplasma und
anschlieĂend aus der Tight Junction verschwand. Da die mRNA- und Protein-
StabilitÀt von Claudin-2 unter dem Einfluss von Butyrat unverÀndert blieb und
der Histon-Deacetylase-Inhibitor Trichostatin A ebenfalls eine Verminderung
der Claudin-2-Expression induzierte, deutete dies auf eine Claudin-2-Reduktion
als Folge von transkriptionellen Effekten hin. Zwar konnten keine
VerÀnderungen der Bindung von acetyliertem Histon-3 an den Claudin-2-Promotor
gezeigt werden, aber es konnte generell eine verminderte Bindung von Proteinen
an verschiedenen Transkriptions-Bindestellen des Claudin-2-Promotors
nachgewiesen werden. Eine wichtige Rolle konnte dabei dem fĂŒr Colitis ulcerosa
relevanten Transkriptionsfaktor HNF-4α zugeordnet werden, dessen Bindung an
die HNF-Bindestelle im Claudin-2-Promotor durch Butyrat fast vollstÀndig
eliminiert wurde, was dafĂŒr spricht, dass HNF-4α einen wichtigen Faktor bei
der Herabregulierung von Claudin-2 darstellt. AbschlieĂend konnte in dieser
Arbeit anhand eines Fallbeispiels einer Patientin mit Diversionscolitis die
Relevanz dieses Mechanismus auch am nativen Darm bzw. in einer spezifischen
Krankheitssituation nachgewiesen werden, indem auch hier ein Butyrat-
induzierter Widerstandsanstieg in entzĂŒndeten Biopsien in direktem
Zusammenhang mit einer verminderten Claudin-2-Expression stand. Die
Hauptaussage dieser Arbeit ist, dass Butyrat die bei chronisch entzĂŒndlichen
Darmerkrankungen erhöhte Expression des parazellulÀren Kationenkanal-Bildners
Claudin-2 reduziert und es auf diese Weise zu einer Verbesserung der gestörten
epithelialen Barrierefunktion des Darms kommen kann. Dieses Ergebnis
unterstreicht die Wichtigkeit kurzkettiger FettsĂ€uren fĂŒr die angeborene
ImmunitÀt in Interaktion mit der Bakterienflora des Darms.Butyrate is known to have beneficial effects on colonocytes including
preservation of epithelial barrier function or anti-inflammatory influences
and has also an important role in cell differentiation, apoptosis induction
and gene regulation by acting as a histone deacetylase (HDAC) inhibitor. Aim
of this study was to characterize the mechnisms induced by butyrate to improve
the epithelial barrier function of the intestine. By means of the human colon
cancer cell line HT-29/B6-GR/MR as a model, which resemble the native
intestine because of its physiological properties, this study has demonstrated
that butyrate treatment causes a time-dependent increase in transepthelial
resistance (Rt) leading to an increase in paracellular resistance (Rpara).
This was caused by the remarkable decrease of the expression of the tight
junction (TJ) molecule claudin-2 which could be demonstrated on mRNA as well
as on protein level by expression analysis. In addition, this finding
correlated with a decrease in Na+ permeability, because claudin-2 acts as a
channel for cations. Other barrier relevant claudins remained unchanged by
butyrate. Confocal laser scanning fluorescence microscopy also showed that
claudin-2 at first disappears from the cytoplasm of the cell and afterwards
also from the tight junction in a time dependent manner in response to
butyrate. The absence of butyrate effects on claudin-2 mRNA or protein
stability and that the HDACi trichostatin A (TSA) also induced a decrease in
claudin-2 expression indicated a decrease in claudin-2 expression which is
based on transcriptional effects. While changes in binding of actylated
histone 3 on claudin-2 promoter binding sites could not be found, a decrease
in binding affinity of proteins to the claudin-2 promoter binding sites could
be demonstrated. In this context, a main role of the ulcerative colitis
relevant transcriptionfactor HNF-4α could be assigned. Thus, this study has
demonstrated for the first time that HNF-4α bound the HNF binding site of the
claudin-2 promoter, a process which could be completely inhibited by butyrate.
This indicates that HNF-4α plays an important role in the regulation of
claudin-2 in response to butyrate. The fact that biopsies from a patient with
active diversion colitis showed a correlation of an increasing Rt and a
decreasing claudin-2 expression after butyrate exposure in vitro underlined
the relevance of these findings in our cell culture model. That butyrate can
decrease the transcription of claudin-2 resulting in an improved epithelial
barrier function of the intestine points to an important role of short chain
fatty acids in innate immunity in interaction with the bacterial flora of the
gut
The LacI/GalR family transcriptional regulator UriR negatively controls uridine utilization of Corynebacterium glutamicum by binding to catabolite-responsive element (cre)-like sequences
Brinkrolf K, Ploeger S, Solle S, et al. The LacI/GalR family transcriptional regulator UriR negatively controls uridine utilization of Corynebacterium glutamicum by binding to catabolite-responsive element (cre)-like sequences. MICROBIOLOGY. 2008;154(4):1068-1081.The Cg1547 protein of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 is a member of the LacI/GalR family of DNA-binding transcriptional regulators. A defined deletion in the cg1547 gene, now designated uriR (uridine utilization regulator), resulted in the mutant strain C. glutamicum KB1547. Comparison of gene expression levels in C. glutamicum KB1547 and the wild-type strain revealed enhanced expression of the uriR operon genes cg1546 (ribokinase), cg1545 (uridine transporter) and cg1543 (uridine-pref erring nucleoside hydrolase). Gene expression of the uriR operon was stimulated by the presence of either uridine or ribose. Growth assays with C. glutamicum mutants showed that functional Cg 1543 and Cg 1545 proteins are essential for the utilization of uridine as the sole carbon source. Transcriptional regulation of the uriR operon is mediated by a 29 bp palindromic sequence composed of two catabolite-responsive element (cre)-like sequences and located in between the mapped -10 promoter region and the start codon of uriR. A similar cre sequence was detected in the upstream region of rbsK2 (cg2554), coding for a second ribokinase in C. glutamicum ATCC 13032. DNA band-shift assays with a streptavidin-tagged UriR protein and labelled oligonucleotides including the cre-like sequences of uriR and rbsK2 demonstrated the specific binding of the purified regulator in vitro. Whole-genome DNA microarray hybridizations comparing the gene expression in C. glutamicum KB1547 with that of the wild-type strain revealed that UriR is a pathway-specific repressor of genes involved in uridine utilization in C. glutamicum