Vírus da dengue : novas abordagens para o estudo da neuropatogênese

Orientadora : Drª Claudia N. Duarte dos SantosTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 10/01/2013Inclui referênciasÁrea de concentração : Biologia molecularResumo: A dengue constitui um grande problema de saúde pública nas regiões tropicais e subtropicais do globo. Apesar dos grandes avanços na biologia do vírus da dengue (DENV), muitos aspectos da patogênese permanecem desconhecidos. A ausência de um modelo animal adequado, que mimetize o espectro da infecção pelo DENV, institui uma das principais dificuldades no estudo da dengue. Múltiplas linhas de evidências indicam que a gravidade da doença é, provavelmente, determinada pela interação entre fatores virais e do hospedeiro. Alguns determinantes genéticos de virulência intrínseca do DENV no hospedeiro foram identificados, no entanto, nenhuma correlação conclusiva entre genótipo viral, transmissibilidade do vírus e patogenicidade foi estabelecida. Neste estudo, foi utilizado um painel de DENV tipo 1 (DENV-1) recombinante para investigar o papel de determinantes genéticos de virulência previamente identificados em duas cepas altamente neurovirulentos (FGA/NA D1D e FGA/NA P6). A replicação e capacidade de produção de partículas virais infecciosas foram avaliadas in vivo (modelo de camundongos imunocompetentes), in vitro (linhagens celulares humanas e de insetos) e ex vivo (células dendríticas derivadas de monócitos humanos, mdDCs). Os resultados demonstraram que a associação das mutações na proteína de envelope (E) e no domínio helicase da proteína NS3 (NS3hel) apresentam um efeito sinérgico na modulação do fitness viral in vitro e in vivo, aumentando a síntese de RNA, a carga viral, a robustez da resposta imune e mortalidade dos animais. No entanto, os vírus contendo apenas as mutações na proteína NS3 (NS3435 e NS3480) foram capazes de se replicar eficientemente no SNC de camundongos, de causar encefalite e altas taxas de mortalidade, o que sugere que essas mutações desempenham um papel importante na modulação da replicação viral in vivo. As mutações NS3435 e NS3480 aumentam também o fitness viral em mdDCs, aumentando a síntese de RNA e a carga viral. Além disso, foi demonstrado que as mutações no domínio helicase não afetam significativamente a atividades de protease e NTPase da NS3 in vitro. Apesar do elevado nível de replicação do RNA viral, a infecção pelo DENV foi capaz de reduzir a produção de IFN tipo I em mdDCs após estímulo dos receptores do tipo Toll (TLR). Os resultados apresentados neste trabalho mostram que a presença de uma única mutação no genoma do DENV aumenta o fitness viral in vivo, in vitro e ex vivo e é suficiente para modular a resposta imunológica do hospedeiro e promover uma infecção produtiva. Dadas as limitações atuais para a compreensão das bases moleculares da patogênese da dengue, estes resultados podem contribuir para fornecer subsídios sobre as interações vírus/hospedeiro e novas informações sobre os mecanismos da biologia básica da dengue.Abstract: Dengue constitutes a significant public health problem in tropical and subtropical regions of the world. Despite major advances in dengue virus (DENV) biology, many aspects of dengue pathogenesis remain largely unknown. The absence of a suitable animal model, mimicking the full spectrum of DENV infections, is one of the main difficulties in studying dengue disease. Multiple lines of evidence indicate that disease severity is probably determined by the interplay of viral and host factors. Some viral genetic determinants of the intrinsic virulence of DENV in the host have been identified; nevertheless, no conclusive evidence of a correlation between viral genotype and virus transmissibility and pathogenicity has been obtained. In this study, we used a panel of recombinant DENV type 1 (DENV-1) to investigate the role of genetic determinants of virulence previously identified in two highly neurovirulent strains (FGA/NA d1d e FGA/NA P6). The replication and viral production capacity of the recombinant viruses were assessed in vivo (immunocompetent mice model), in vitro (human and insect cells lines) and ex vivo (dendritic cells derived from human monocytes, mdDCs). Our results demonstrated that paired mutations in the envelope protein (E) and in the helicase domain of the NS3 (NS3hel) protein have a synergistic effect enhancing viral fitness both in vitro and in vivo by increasing RNA synthesis and viral load, the strength of the immune response and animal mortality. However, the virus carrying mutations only at the NS3 protein (NS3435 and NS3480) was able to replicate efficiently in the CNS of mice and to cause encephalitis and high mortality rates, suggesting that these mutations play an important role on the viral fitness modulation in vivo. These mutations also enhanced viral fitness in mdDCs by increasing RNA synthesis and viral load. Additionally, it has been demonstrated that the mutations NS3435 and NS3480 in the helicase domain do not significantly affect the protease and NTPase activities of NS3 in vitro. Despite the high level of RNA replication, DENV reduces the ability of mdDCs to produce type I IFN triggered by Toll-like receptor (TLR) signaling. The results presented herein show that a single mutation in DENV genome enhances viral fitness in vivo, in vitro and ex vivo and is enough to subvert the host immune response and establish a productive infection. Given current limitations to our understanding of the molecular basis of dengue pathogenesis, these results could contribute to provide insights into virus/host interactions and new information about the mechanisms of basic dengue biology

Neuroadaptaçao de virus dengue em modelo murino : identificaçao de marcadores moleculares

Orientadora : DrS Claudia N. Duarte dos SantosDissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 2008Inclui bibliografiaO vírus da dengue (DENV), um membro do gênero Flavivirus (família Flaviviridae), é um arbovírus que causa severa doença em humanos. O espectro da doença varia desde uma febre indiferenciada (FD) até a febre hemorrágica da dengue (FHD), que pode evoluir para a síndrome do choque da dengue (SCD) e morte. Mais recentemente, o perfil clínico da infecção pelo DENV está mudando e um aumento significativo de casos clínicos com manifestações neurológicas vem sendo documentado. O(s) mecanismo(s) pelo qual o DENV pode causar doença grave e a contribuição de fatores virais e do hospedeiro para o desenvolvimento dos quadros clínicos severos, não está completamente compreendido. A falta de um modelo animal, que reflita as formas graves da doença é um obstáculo para se estudar alguns aspectos da patogênese da dengue. O sistema nervoso central (SNC) de camundongos neonatos tem sido utilizado como modelo para compreender a fisiopatologia da doença. Para confirmar e definir o envolvimento de substituições de aminoácidos no genoma viral que pudessem estar relacionadas com a aquisição de um fenótipo de neurovirulência do DENV em camundongos, a cepas do sorotipo 1 do vírus (DENV-1) FGA/89 foi adapta ao SNC de camundongos neonatos suíços. A capacidade da nova variante neuroadaptada replicar-se no SNC e provocar encefalite foi analisada. Durante o processo de neuroadaptação do vírus FGA/89, uma substituição de aminoácido na proteína de envelope (E) e duas na proteína não-estrutural 3 (NS3) foram observadas. Estas mutações foram identificadas primeiramente nos vírus resultantes da terceira passagem (FGA/NA P3) e observadas até a sexta passagem. As substituições E Phe402/Leu e NS3 Leu480/Ser identificadas na variante FGA/NA P3-P6, embora não idênticas àquelas observadas em FGA/NA d1d (outra variante neuroadaptada a partir da mesma cepa parental, FGA/89), mapeiam nos mesmos domínios, sugerindo um papel potencial dessas proteínas na aquisição do fenótipo de neurovirulência do DENV-1 em camundongos. Com o intuito de confirmar o envolvimento dessas mutações, um isolado clínico recente (BR/01-MR) foi submetido ao mesmo processo de neuroadaptação. Embora a variante MR/NA P7 tenha se mostrado mais neurovirulenta do que a variante FGA/NA P6, ocasionando danos severos no SNC de camundongos, caracterizados por leptomeningite e necrose de substância branca, não foi possível identificar a presença de partículas infecciosas nem do RNA viral em cada uma das passagens do vírus. No entanto, através de ensaios microscopia eletrônica e imunocitoquímica de secções do SNC de camundongos foi possível observar tanto a presença de partículas virais como das proteínas E e NS1, sugerindo que os danos no SNC dos camundongos infectados foi uma conseqüência direta da infecção pelo vírus. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram demonstrar a implicação das proteínas E e NS3 no processo de neurovirulência do vírus FGA/NA 89 e que as variantes neuroadaptadas apresentam a capacidade de infectar as células do SNC de camundongos neonatos e ocasionar danos extensivos nos tecidos como leptomeningite e encefalite. Um maior conhecimento sobre os mecanismos envolvidos na patogênese da dengue poderá contribuir para o delineamento de estratégias antivirais direcionadas e eventualmente o controle da infecção.Dengue virus (DENV), a member of the Flavivirus genus (family Flaviviridae), is an arthropod-borne virus that cause severe disease in humans. The spectrum of illness ranges from a self-limiting fever (DF) to dengue hemorrhagic fever (DHF), which can progress to dengue shock syndrome and death. More recently, the clinical presentation of DENV infection is changing and a significant increase of cases with neurological manifestations has been documented. The precise mechanim(s) by which DEN viruses cause severe disease is still not understood. It has been inferred that both immunological and viral factors determine the severity of disease. The lack of an animal model that reflects the severe forms of the disease is an obstacle to study some aspects of dengue pathogenesis. The central nervous system (CNS) of newborn mice has been used as a model system to study the pathophysiology of dengue disease. To confirm and to define the involvement of the amino acid substitutions in the viral genome that could be related to the acquisition of DENV neurovirulent phenotype for mice, we adapted a strains of dengue virus type 1, FGA/89, in CNS of newborn Swiss mice. The capacity of the neuroadapted variants to replicate in CNS and to cause encephalitis was analyzed. One amino acid mutation in the envelope E protein and two amino acid mutations in the nonstructural NS3 protein were observed during the neuroadaptation process of FGA/89. These mutations were first identified in FGA/NA P3 and fixed until the sixth passage. The substitutions E Phe402/Leu and NS3 Leu480/Ser identified in FGA/NA P3-P6, although not identical to those observed in FGA/NA d1d (another neuroadapted variant from the same parental strain, FGA/89), mapped to the same domain, suggesting a potential role of these proteins in the acquisition of DENV mice neurovirulent phenotype. Aiming to confirm the involvement of these mutations in dengue neurovirulence, a recent clinical isolate (BR/01-MR) was submitted to the same protocol of neuroadaptation. The neurovirulent variant MR/NA P7 was more neurovirulent for newborn Swiss mice, compared to FGA/NA P6 variant, causing severe damage in CNS of mice, characterized by leptomeningitis and necrosis of white matter. Despite of all these findings, it was not possible to identify neither the presence of viral infectious particle nor the presence of the viral RNA in all the passages of the virus in mice brains. However, by electron microscopy and immune electron microscopy assays it was possible to observe the presence of viral particles and viral proteins E and NS1 in the sections of the CNS of mice, suggesting that the damage observed in the CNS was a direct result of virus infection. Results obtained in this work demonstrate the implication of the proteins E and NS3 in the process of neuroadaption of the virus FGA/89 and that the neurovirulent variants have the ability to infect CNS of newborn mice causing extensive tissue damage as leptomeningitis and encephalitis. A better knowledge about molecular markers and mechanisms that could be involved in the dengue pathogenesis would be useful for developing new targets to antiviral strategies and eventually control of infection

RPA-Approach to the Excitations of the Nucleon, Part II: Phenomenology

The tensor-RPA approach developed previously in part I is applied to the Nambu-Jona-Lasinio (NJL) model. As a first step we investigate the structure of Dirac-Hartree-Fock solutions for a rotationally and isospin invariant ground-state density. Whereas vacuum properties can be reproduced, no solitonic configuration for a system with unit baryon number is found. We then solve the tensor-RPA equation employing simple models of the nucleon ground state. In general the ph interaction effects a decrease of the excited states to lower energies. Due to an enhanced level density at low energies the obtained spectra cannot be matched with the experimental data when a standard MIT-bag configuration is used. However, when the size of the nucleon quark core is reduced to approximately 0.3 fm a fair description of the baryon spectrum in the positive-parity channel is achieved. For this purpose the residual interaction turns out to be crucial and leads to a significant improvement compared with the mean-field spectra.Comment: 33 pages, Latex, 9 Postscpript figures, section on the excited states has been completely rewritten after error was detected, results are now much more encouragin

Genome-wide analyses reveal a highly conserved Dengue virus envelope peptide which is critical for virus viability and antigenic in humans.

Targeting regions of proteins that show a high degree of structural conservation has been proposed as a method of developing immunotherapies and vaccines that may bypass the wide genetic variability of RNA viruses. Despite several attempts, a vaccine that protects evenly against the four circulating Dengue virus (DV) serotypes remains elusive. To find critical conserved amino acids in dengue viruses, 120 complete genomes of each serotype were selected at random and used to calculate conservation scores for nucleotide and amino acid sequences. The identified peptide sequences were analysed for their structural conservation and localisation using crystallographic data. The longest, surface exposed, highly conserved peptide of Envelope protein was found to correspond to amino acid residues 250 to 270. Mutation of this peptide in DV1 was lethal, since no replication of the mutant virus was detected in human cells. Antibodies against this peptide were detected in DV naturally infected patients indicating its potential antigenicity. Hence, this study has identified a highly conserved, critical peptide in DV that is a target of antibodies in infected humans

Synergistic Interactions between the NS3hel and E Proteins Contribute to the Virulence of Dengue Virus Type 1

Dengue virus constitutes a significant public health problem in tropical regions of the world. Despite the high morbidity and mortality of this infection, no effective antiviral drugs or vaccines are available for the treatment or prevention of dengue infections. The profile of clinical signs associated with dengue infection has changed in recent years with an increase in the number of episodes displaying unusual signs. We use reverse genetics technology to engineer DENV-1 viruses with subsets of mutations previously identified in highly neurovirulent strains to provide insights into the molecular mechanisms underlying dengue neuropathogenesis. We found that single mutations affecting the E and NS3hel proteins, introduced in a different genetic context, had a synergistic effect increasing DENV replication capacity in human and mosquito derived cells in vitro. We also demonstrated correlations between the presence of these mutations and viral replication efficiency, viral loads, the induction of innate immune response genes and pathogenesis in a mouse model. These results should improve our understanding of the DENV-host cell interaction and contribute to the development of effective antiviral strategies

A utilização do ensino híbrido no ensino médio presencial de matemática

Tendo-se em vista a ampla grade curricular do Ensino Médio, fez-se uma pesquisa numa turma de 2º ano do Ensino Médio da ETE Monteiro Lobato, objetivando-se compreender se a utilização do ensino híbrido, utilizando o AVA Google sala de aula, melhora o desempenho dos estudantes na disciplina de Matemática do Ensino Médio presencial. Acredita-se que o ensino híbrido proporciona autonomia aos discentes, possibilitando maior aprofundamento dos conteúdos, além de oportunizar que mais recursos possam ser utilizados. Para isso, buscou-se aplicar a metodologia do ensino híbrido, por intermédio do Google sala de aula, analisar como os estudantes reagem à inserção destes recursos digitais, identificar quais as contribuições da utilização do AVA juntamente com o ensino híbrido, compreender como avaliar os alunos no ensino híbrido, verificar e analisar se melhorou o desempenho dos estudantes e identificar se essa melhora é devido ao AVA ou ao ensino híbrido. A abordagem não correu como imaginado, deixando muitas dúvidas. Os discentes se mostraram relutantes com a nova metodologia e a docente não soube como proceder. Mesmo com muitas falhas no decorrer da aplicação, a pesquisadora acredita que com ajustes e um pouco mais de estudo e dedicação é possível incluir o ensino híbrido no Ensino Médio presencial.Having in mind that High School has a broad curriculum, a research was made in one High School sophomore class in ETE Monteiro Lobato, aiming to understand if the use of blended learning, using VLAE Google Classroom, improves the performance of students in High School mathematics class. It is believed that blended learning provides autonomy to the students, making it possible for them to deepen their knowledge in subjects of their interest, besides giving an opportunity to use more resources. In order to do that it was sought how to apply the blended learning method, through Google Classroom, how to analyse the students’ reaction to the insertion of those digital resources, how to identify the contributions of using VLAE alongside blended learning, how to comprehend the means of evaluation of the students in blended learning, how to verify and analyse if the students’ performance was improved and identify if this improvement was due to the VLAE or the blended learning. The approach did not occur as imagined, leaving a lot of doubts. The students seemed reluctant with the new method and the teacher did not know how to proceed. Even with the many failures during the application, the researcher believes that with adjustments and more studying and dedication it is possible to include blended learning in presential High School

Neuroadaptaçao de virus dengue em modelo murino : identificaçao de marcadores moleculares

Orientadora : DrS Claudia N. Duarte dos SantosDissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 2008Inclui bibliografiaO vírus da dengue (DENV), um membro do gênero Flavivirus (família Flaviviridae), é um arbovírus que causa severa doença em humanos. O espectro da doença varia desde uma febre indiferenciada (FD) até a febre hemorrágica da dengue (FHD), que pode evoluir para a síndrome do choque da dengue (SCD) e morte. Mais recentemente, o perfil clínico da infecção pelo DENV está mudando e um aumento significativo de casos clínicos com manifestações neurológicas vem sendo documentado. O(s) mecanismo(s) pelo qual o DENV pode causar doença grave e a contribuição de fatores virais e do hospedeiro para o desenvolvimento dos quadros clínicos severos, não está completamente compreendido. A falta de um modelo animal, que reflita as formas graves da doença é um obstáculo para se estudar alguns aspectos da patogênese da dengue. O sistema nervoso central (SNC) de camundongos neonatos tem sido utilizado como modelo para compreender a fisiopatologia da doença. Para confirmar e definir o envolvimento de substituições de aminoácidos no genoma viral que pudessem estar relacionadas com a aquisição de um fenótipo de neurovirulência do DENV em camundongos, a cepas do sorotipo 1 do vírus (DENV-1) FGA/89 foi adapta ao SNC de camundongos neonatos suíços. A capacidade da nova variante neuroadaptada replicar-se no SNC e provocar encefalite foi analisada. Durante o processo de neuroadaptação do vírus FGA/89, uma substituição de aminoácido na proteína de envelope (E) e duas na proteína não-estrutural 3 (NS3) foram observadas. Estas mutações foram identificadas primeiramente nos vírus resultantes da terceira passagem (FGA/NA P3) e observadas até a sexta passagem. As substituições E Phe402/Leu e NS3 Leu480/Ser identificadas na variante FGA/NA P3-P6, embora não idênticas àquelas observadas em FGA/NA d1d (outra variante neuroadaptada a partir da mesma cepa parental, FGA/89), mapeiam nos mesmos domínios, sugerindo um papel potencial dessas proteínas na aquisição do fenótipo de neurovirulência do DENV-1 em camundongos. Com o intuito de confirmar o envolvimento dessas mutações, um isolado clínico recente (BR/01-MR) foi submetido ao mesmo processo de neuroadaptação. Embora a variante MR/NA P7 tenha se mostrado mais neurovirulenta do que a variante FGA/NA P6, ocasionando danos severos no SNC de camundongos, caracterizados por leptomeningite e necrose de substância branca, não foi possível identificar a presença de partículas infecciosas nem do RNA viral em cada uma das passagens do vírus. No entanto, através de ensaios microscopia eletrônica e imunocitoquímica de secções do SNC de camundongos foi possível observar tanto a presença de partículas virais como das proteínas E e NS1, sugerindo que os danos no SNC dos camundongos infectados foi uma conseqüência direta da infecção pelo vírus. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram demonstrar a implicação das proteínas E e NS3 no processo de neurovirulência do vírus FGA/NA 89 e que as variantes neuroadaptadas apresentam a capacidade de infectar as células do SNC de camundongos neonatos e ocasionar danos extensivos nos tecidos como leptomeningite e encefalite. Um maior conhecimento sobre os mecanismos envolvidos na patogênese da dengue poderá contribuir para o delineamento de estratégias antivirais direcionadas e eventualmente o controle da infecção.Dengue virus (DENV), a member of the Flavivirus genus (family Flaviviridae), is an arthropod-borne virus that cause severe disease in humans. The spectrum of illness ranges from a self-limiting fever (DF) to dengue hemorrhagic fever (DHF), which can progress to dengue shock syndrome and death. More recently, the clinical presentation of DENV infection is changing and a significant increase of cases with neurological manifestations has been documented. The precise mechanim(s) by which DEN viruses cause severe disease is still not understood. It has been inferred that both immunological and viral factors determine the severity of disease. The lack of an animal model that reflects the severe forms of the disease is an obstacle to study some aspects of dengue pathogenesis. The central nervous system (CNS) of newborn mice has been used as a model system to study the pathophysiology of dengue disease. To confirm and to define the involvement of the amino acid substitutions in the viral genome that could be related to the acquisition of DENV neurovirulent phenotype for mice, we adapted a strains of dengue virus type 1, FGA/89, in CNS of newborn Swiss mice. The capacity of the neuroadapted variants to replicate in CNS and to cause encephalitis was analyzed. One amino acid mutation in the envelope E protein and two amino acid mutations in the nonstructural NS3 protein were observed during the neuroadaptation process of FGA/89. These mutations were first identified in FGA/NA P3 and fixed until the sixth passage. The substitutions E Phe402/Leu and NS3 Leu480/Ser identified in FGA/NA P3-P6, although not identical to those observed in FGA/NA d1d (another neuroadapted variant from the same parental strain, FGA/89), mapped to the same domain, suggesting a potential role of these proteins in the acquisition of DENV mice neurovirulent phenotype. Aiming to confirm the involvement of these mutations in dengue neurovirulence, a recent clinical isolate (BR/01-MR) was submitted to the same protocol of neuroadaptation. The neurovirulent variant MR/NA P7 was more neurovirulent for newborn Swiss mice, compared to FGA/NA P6 variant, causing severe damage in CNS of mice, characterized by leptomeningitis and necrosis of white matter. Despite of all these findings, it was not possible to identify neither the presence of viral infectious particle nor the presence of the viral RNA in all the passages of the virus in mice brains. However, by electron microscopy and immune electron microscopy assays it was possible to observe the presence of viral particles and viral proteins E and NS1 in the sections of the CNS of mice, suggesting that the damage observed in the CNS was a direct result of virus infection. Results obtained in this work demonstrate the implication of the proteins E and NS3 in the process of neuroadaption of the virus FGA/89 and that the neurovirulent variants have the ability to infect CNS of newborn mice causing extensive tissue damage as leptomeningitis and encephalitis. A better knowledge about molecular markers and mechanisms that could be involved in the dengue pathogenesis would be useful for developing new targets to antiviral strategies and eventually control of infection

A utilização do ensino híbrido no ensino médio presencial de matemática

Tendo-se em vista a ampla grade curricular do Ensino Médio, fez-se uma pesquisa numa turma de 2º ano do Ensino Médio da ETE Monteiro Lobato, objetivando-se compreender se a utilização do ensino híbrido, utilizando o AVA Google sala de aula, melhora o desempenho dos estudantes na disciplina de Matemática do Ensino Médio presencial. Acredita-se que o ensino híbrido proporciona autonomia aos discentes, possibilitando maior aprofundamento dos conteúdos, além de oportunizar que mais recursos possam ser utilizados. Para isso, buscou-se aplicar a metodologia do ensino híbrido, por intermédio do Google sala de aula, analisar como os estudantes reagem à inserção destes recursos digitais, identificar quais as contribuições da utilização do AVA juntamente com o ensino híbrido, compreender como avaliar os alunos no ensino híbrido, verificar e analisar se melhorou o desempenho dos estudantes e identificar se essa melhora é devido ao AVA ou ao ensino híbrido. A abordagem não correu como imaginado, deixando muitas dúvidas. Os discentes se mostraram relutantes com a nova metodologia e a docente não soube como proceder. Mesmo com muitas falhas no decorrer da aplicação, a pesquisadora acredita que com ajustes e um pouco mais de estudo e dedicação é possível incluir o ensino híbrido no Ensino Médio presencial.Having in mind that High School has a broad curriculum, a research was made in one High School sophomore class in ETE Monteiro Lobato, aiming to understand if the use of blended learning, using VLAE Google Classroom, improves the performance of students in High School mathematics class. It is believed that blended learning provides autonomy to the students, making it possible for them to deepen their knowledge in subjects of their interest, besides giving an opportunity to use more resources. In order to do that it was sought how to apply the blended learning method, through Google Classroom, how to analyse the students’ reaction to the insertion of those digital resources, how to identify the contributions of using VLAE alongside blended learning, how to comprehend the means of evaluation of the students in blended learning, how to verify and analyse if the students’ performance was improved and identify if this improvement was due to the VLAE or the blended learning. The approach did not occur as imagined, leaving a lot of doubts. The students seemed reluctant with the new method and the teacher did not know how to proceed. Even with the many failures during the application, the researcher believes that with adjustments and more studying and dedication it is possible to include blended learning in presential High School