Methods to increase the efficiency of precise CRISPR genome editing

Pluripotente Stammzellen haben das Potential, in unterschiedliche Zelltypen zu differenzieren und können genutzt werden, um organähnliche Mikrostrukturen zu generieren. Somit können molekulare Unterschiede verschiedenster künstlich differenzierter Gewebe, etwa zwischen Mensch und Schimpanse, anhand von pluripotenten Ausgangszellen untersucht werden. Da die Genome unserer nächsten ausgestorbenen Verwandten Neandertaler und Denisovaner aus konservierter DNA in alten Knochen sequenziert wurden, könnten ebenso Unterschiede zwischen Mensch und diesen Spezies oder dem letzten gemeinsamen Vorfahren untersucht werden. Dies erfordert jedoch die Generierung neandertalisierter Stammzellen durch künstliche Integration von Neandertalerallelen in humane Stammzellen, etwa durch die CRISPR Genomeditierungstechnik. Durch CRISPR kann ein DNA-Doppelstrangbruch an einer gewünschten Stelle im Genom eingefügt werden. Die zelluläre Reparatur des Doppelstrangbruchs ermöglicht dann die Editierung des Genoms. Basierend auf einer DNA-Matrize, die die gewünschte Modifikation trägt, kann das Genom an dieser Stelle präzise editiert werden. Die Effizienz präziser Editierung ist jedoch sehr niedrig im Vergleich zu unpräziser Reparatur. Um möglichst effizient neandertalisierte Stammzellen generieren zu können, wurden im Zuge dieser Doktorarbeit Methoden entwickelt, welche die präzise Genomeditierungseffizienz drastisch steigern. Zum einen wurde aus mehreren niedermolekularen Substanzen, welche mit Proteinen der DNA-Reparaturen interagieren, ein optimierter Mix entwickelt. Weiterhin konnte durch eine Mutation in einem zentralen Reparaturprotein die Effizienz für die Editierung eines einzelnen Gens auf 87% erhöht werden. Diese hohe Effizienz ermöglicht erstmals die präzise homozygote Editierung von vier Genen auf einmal in ein und derselben Zell

Point-of-care bulk testing for SARS-CoV-2 by combining hybridization capture with improved colorimetric LAMP

Efforts to contain the spread of SARS-CoV-2 have spurred the need for reliable, rapid, and cost-effective diagnostic methods which can be applied to large numbers of people. However, current standard protocols for the detection of viral nucleic acids while sensitive, require a high level of automation and sophisticated laboratory equipment to achieve throughputs that allow whole communities to be tested on a regular basis. Here we present Cap-iLAMP (capture and improved loop-mediated isothermal amplification) which combines a hybridization capture-based RNA extraction of gargle lavage samples with an improved colorimetric RT-LAMP assay and smartphone-based color scoring. Cap-iLAMP is compatible with point-of-care testing and enables the detection of SARS-CoV-2 positive samples in less than one hour. In contrast to direct addition of the sample to improved LAMP (iLAMP), Cap-iLAMP prevents false positives and allows single positive samples to be detected in pools of 25 negative samples, reducing the reagent cost per test to ~1 Euro per individual

Efficient high-precision homology-directed repair-dependent genome editing by HDRobust

Homology-directed repair (HDR), a method for repair of DNA double-stranded breaks can be leveraged for the precise introduction of mutations supplied by synthetic DNA donors, but remains limited by low efficiency and off-target effects. In this study, we report HDRobust, a high-precision method that, via the combined transient inhibition of nonhomologous end joining and microhomology-mediated end joining, resulted in the induction of point mutations by HDR in up to 93% (median 60%, s.e.m. 3) of chromosomes in populations of cells. We found that, using this method, insertions, deletions and rearrangements at the target site, as well as unintended changes at other genomic sites, were largely abolished. We validated this approach for 58 different target sites and showed that it allows efficient correction of pathogenic mutations in cells derived from patients suffering from anemia, sickle cell disease and thrombophilia.journal articl

A direct RT-qPCR approach to test large numbers of individuals for SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 causes substantial morbidity and mortality in elderly and immunocompromised individuals, particularly in retirement homes, where transmission from asymptomatic staff and visitors may introduce the infection. Here we present a cheap and fast approach to detect SARSCoV-2 in single or pooled gargle lavages (“mouthwashes”). With this approach, we test all staff at a nursing home daily over a period of three weeks in order to reduce the risk that the infection penetrates the facility. This or similar approaches could be implemented to protect hospitals, nursing homes and other institutions in this and future viral epidemics

Systemevaluierung "KMU-innovativ"

Der vorliegende Bericht stellt die Ergebnisse einer Systemevaluierung der Förderinitiative KMU-innovativ des BMBF dar. Die Evaluierung startete Ende 2008 und damit ein Jahr nach dem Beginn der Förderinitiative im Herbst 2007. Sie hatte zum Ziel, die Implementation, Zielerreichung und Wirkung der Förderinitiative sowie ihre Position in der Förderlandschaft zu bewerten. Die hier vorgelegten Ergebnisse bilden die Erfahrungen der ersten dreieinhalb Jahre der Umsetzung von KMU-innovativ ab

Reduced purine biosynthesis in humans after their divergence from Neandertals

We analyze the metabolomes of humans, chimpanzees, and macaques in muscle, kidney and three different regions of the brain. Although several compounds in amino acid metabolism occur at either higher or lower concentrations in humans than in the other primates, metabolites downstream of adenylosuccinate lyase, which catalyzes two reactions in purine synthesis, occur at lower concentrations in humans. This enzyme carries an amino acid substitution that is present in all humans today but absent in Neandertals. By introducing the modern human substitution into the genomes of mice, as well as the ancestral, Neandertal-like substitution into the genomes of human cells, we show that this amino acid substitution contributes to much or all of the reduction of de novo synthesis of purines in humans

Longer metaphase and fewer chromosome segregation errors in modern human than Neanderthal brain development

Since the ancestors of modern humans separated from those of Neanderthals, around 100 amino acid substitutions spread to essentially all modern humans. The biological significance of these changes is largely unknown. Here, we examine all six such amino acid substitutions in three proteins known to have key roles in kinetochore function and chromosome segregation and to be highly expressed in the stem cells of the developing neocortex. When we introduce these modern human-specific substitutions in mice, three substitutions in two of these proteins, KIF18a and KNL1, cause metaphase prolongation and fewer chromosome segregation errors in apical progenitors of the developing neocortex. Conversely, the ancestral substitutions cause shorter metaphase length and more chromosome segregation errors in human brain organoids, similar to what we find in chimpanzee organoids. These results imply that the fidelity of chromosome segregation during neocortex development improved in modern humans after their divergence from Neanderthals

Educational interventions to improve handover in health care: an updated systematic review

Effective handovers (handoffs) are vital to patient safety. Educational interventions to improve handovers were previously investigated through a systematic review in 2010.1 The number of publications on handover education has increased substantially in recent years, so an update review was undertaken. Studies involving educational interventions to improve handover amongst undergraduate or postgraduate health professionals in acute care settings were considered. A standardized search of online databases was carried out independently by two authors and consensus reached. Data extraction and quality assessment were also completed independently, after which a content analysis of interventions was conducted and key themes extracted. Eighteen studies met the inclusion criteria, with all but two based in the US. Interventions most commonly used single-patient exercises based on simulation and role-play. Many discussed multi-professional working, but were largely taught in single professional contexts. Analysis of interventions revealed themes in three major areas: facilitating information management, reducing the potential for errors and improving confidence in participating in handovers. The majority of studies assessed Kirkpatrick’s outcomes of knowledge and skill improvement. The strength of conclusions was generally weak. Despite increased interest and publications on handover, the quality of published research remains poor. Inadequate reporting of interventions, especially as it relates to educational theory, pedagogy, curricula, and resource requirements, continues to impede replication. Weaknesses in quality of study, length of follow up and scope of impact evaluation persist. Future work is vital to address these issues, and to consider the role of multi-professional and multi-patient handovers

Methods to increase the efficiency of precise CRISPR genome editing

Pluripotente Stammzellen haben das Potential, in unterschiedliche Zelltypen zu differenzieren und können genutzt werden, um organähnliche Mikrostrukturen zu generieren. Somit können molekulare Unterschiede verschiedenster künstlich differenzierter Gewebe, etwa zwischen Mensch und Schimpanse, anhand von pluripotenten Ausgangszellen untersucht werden. Da die Genome unserer nächsten ausgestorbenen Verwandten Neandertaler und Denisovaner aus konservierter DNA in alten Knochen sequenziert wurden, könnten ebenso Unterschiede zwischen Mensch und diesen Spezies oder dem letzten gemeinsamen Vorfahren untersucht werden. Dies erfordert jedoch die Generierung neandertalisierter Stammzellen durch künstliche Integration von Neandertalerallelen in humane Stammzellen, etwa durch die CRISPR Genomeditierungstechnik. Durch CRISPR kann ein DNA-Doppelstrangbruch an einer gewünschten Stelle im Genom eingefügt werden. Die zelluläre Reparatur des Doppelstrangbruchs ermöglicht dann die Editierung des Genoms. Basierend auf einer DNA-Matrize, die die gewünschte Modifikation trägt, kann das Genom an dieser Stelle präzise editiert werden. Die Effizienz präziser Editierung ist jedoch sehr niedrig im Vergleich zu unpräziser Reparatur. Um möglichst effizient neandertalisierte Stammzellen generieren zu können, wurden im Zuge dieser Doktorarbeit Methoden entwickelt, welche die präzise Genomeditierungseffizienz drastisch steigern. Zum einen wurde aus mehreren niedermolekularen Substanzen, welche mit Proteinen der DNA-Reparaturen interagieren, ein optimierter Mix entwickelt. Weiterhin konnte durch eine Mutation in einem zentralen Reparaturprotein die Effizienz für die Editierung eines einzelnen Gens auf 87% erhöht werden. Diese hohe Effizienz ermöglicht erstmals die präzise homozygote Editierung von vier Genen auf einmal in ein und derselben Zell