Envolvimento das cininas no processo de cicatrização da pele

Orientadora : Profª. Drª. Daniela de Almeida CabriniCoorientadora : Prof. Dr. Michel Fleith OtukiDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Defesa: Curitiba, 12/03/2015Inclui referências : f. 62-69Resumo: Com o objetivo de verificar o envolvimento do sistema das cininas no processo de cicatrização cutânea, animais nocaute para os receptores cininérgicos (KOB1, KOB2 e KOB1B2) e wildtype (WT/controle) foram submetidos ao modelo de cicatrização por excisão cutânea. Observou-se que no décimo dia após a excisão, os animais WT apresentaram oclusão da ferida igual a 96,13 ± 0,55%, enquanto os grupos nocaute KOB1, KOB2 e KOB1B2 apresentaram contração da lesão de 91,39 ± 0,93%, 86,80 ± 1,93% e 82,0 ± 1,73%, respectivamente. Uma vez que foram observadas diferenças com relação ao tempo de resolução do processo de reparo tecidual, foi realizada a avaliação do período de oclusão total das feridas nestes grupos. Os animais WT apresentaram fechamento completo de suas lesões no 12° dia após a realização da excisão, já os animais nocautes tiveram suas lesões elucidadas no 17° (KOB1), 21° (KOB2) e 23° dia (KOB1B2). Análises realizadas com amostras coletadas durante as diferentes fases do processo de cicatrização (fase inflamatória - 2°, 3° dias, fase proliferativa - 7 °, e fase de remodelamento tecidual - 10 ° dia), reforçaram a ocorrência de diferenças no processo de reparação tecidual nos grupos nocaute. Os resultados mostraram que houve redução significativa do número de células infiltradas no tecido lesionado durante a fase inflamatória nos grupos nocaute, sendo esta redução de 30,65 ± 3,66% (KOB1), 48,20 ± 2,52% (KOB2) e 47,72 ± 2,29% (KOB1B2), no 2° dia após a excisão. Esta redução permaneceu no 3° dia, sendo iguais a 44,26 ± 7,79% (KOB1), 67,19 ± 2,88% (KOB2) e 60,03 ± 4,28% (KOB1B2), quando comparados ao grupo WT. Na fase proliferativa (7° dia), observaram-se reduções significativas na taxa de reepitelização nos grupos nocautes para o receptor B2, em comparação ao grupo WT (76,16 ± 8,03%), sendo estas reduções iguais a 24,94 ± 8,45% (KOB2) e 23,63 ± 5,41% (KOB1B2). Análises de amostras referentes à fase de remodelamento tecidual (10° dia) mostraram diferenças nos níveis de colágeno tecidual nos animais nocautes para os receptores das cininas, sendo estas reduções iguais a 18,13 ± 2,7% (KOB1), 12,11 ± 1,52% (KOB2) e 16,96 ± 0,51% (KOB1B2), em comparação com o grupo controle (88,9 ± 2,62 ?g/tecido). Através de análises imunohistoquímicas, foram constatadas reduções significativas na taxa de proliferação de fibroblastos nos grupos nocautes B2, com reduções de 39,01 ± 5,96% (KOB2) e 38,03 ± 4,32% (KOB1B2). Assim como, foram observadas reduções no número de miofibroblastos nestes grupos, sendo estas reduções iguais a 34,87 ± 3,31% (KOB2) e 44,10 ± 3,54% (KOB1B2), em comparado ao grupo controle (32,5 ± 4,92 células/campo). No entanto, os dados dos animais KOB1 foram semelhantes aos dos WT. Os resultados obtidos sugerem a participação do sistema das cininas em processos que compõem a reparação tecidual, auxiliando na compreensão desse processo fisiopatológico e tornando as cininas uma nova opção terapêutica. Observou-se a participação direta do receptor B2 em processos de proliferação e diferenciação de células que compõem a pele. Palavras-chave: Cininas, Cicatrização, Pele, receptores cininérgicos, Receptor B1, Receptor B2.Abstract: To verify the involvement of kinins in the skin healing process, knockout animals for kinin receptors (KOB1, KOB2 and KOB1B2), and wildtype (WT / control) were subjected to excision wound healing model. It was observed that on the tenth day after excision, WT animals had occlusion of the wound equal to 96.13 ± 0.55%, while knockout groups KOB1, KOB2 and KOB1B2 presented wound closure of 91.39 ± 0.93 % 86.80 ± 1.93% and 82.0 ± 1.73%, respectively. Since differences with time resolution of tissue repair process were observed, the evaluation of the period of total occlusion of wounds in these groups was performed. Thus, the WT animals showed a complete closure of injuries on the 12th day after excision, and the knockout animals had their injuries elucidated on the 17th (KOB1), 21th (KOB2) and 23th day (KOB1B2). Analyzes performed on samples collected during the different phases of wound healing (inflammatory phase - days 2 and 3, proliferative phase - day 7, and tissue remodeling phase - day 10), reinforced the occurrence of differences in the repair process tissue in the knockout groups. Results in the knockout groups also show reduction of infiltrated cells in the tissue during the inflammatory phase, with a decline of 30.65 ± 3.66% (KOB1), 48.20% ± 2.52 (KOB2) and 47.72 ± 2.29% (KOB1B2), on the day 2 after excision. This reduction remained on day 3 being equal to 44.26 ± 7.79% (KOB1), 67.19 ± 2.88% (KOB2) and 60.03 ± 4.28% (KOB1B2), both compared to WT group. In the proliferative phase (day 7), there was a significant reduction in re-epithelialization rate in knockouts groups for the B2 receptor in comparison to WT (76.16 ± 8.03%), presenting rate reductions of 24.94 ± 8.45% (KOB2) and 23.63 ± 5.41% (KOB1B2). Analysis of samples relating to the phase of tissue remodeling (day 10) showed differences in the levels of collagen tissue, with reduced levels in knockout animals of 18.13 ± 2.7% (KOB1), 12.11 ± 1.52% (KOB2) and 16.96 ± 0.51% (KOB1B2), compared with the control group (88.9 ± 2.62 g /tissue). In knockouts B2 groups, immunohistochemical analyzes show significant reductions in fibroblast proliferation rate of 39.01 ± 5.96% (KOB2) and 38.03 ± 4.32% (KOB1B2). Again, decreases were observed in the number of myofibroblasts in these groups, equal to 34.87 ± 3.31% (KOB2) and 44.10 ± 3.54 % (KOB1B2), in comparison with the control group (32.5 ± 4.92 cells/field). Data from KOB1 animals did not show differences concerning fibroblast proliferation and myofibroblasts. The results suggest the involvement of the kinin system in processes that make up the tissue repair, assisting in the understanding of pathophysiological process, and making kinins a new therapeutic option. Highlighting the B2 receptor direct participation in proliferation and differentiation of fibroblasts in the skin. Keywords: Kinins, Wound Healing, Skin, kinin B1 receptors, kinin B2 receptors

Combretum leprosum Mart. (Combretaceae): Potential as an antiproliferative and anti-inflammatory agent

AbstractEthnopharmacological relevanceCombretum leprosum is a species that is popularly used in Brazil as a healing agent to treat skin problems and lesions. In this study we investigated the possible potential of this extract to treat inflammatory and hyperproliferative skin conditions.Materials and methodsClassical models of skin inflammation such as TPA- and croton oil-induced mouse ear oedema were applied in order to verify the potential topical anti-inflammatory activity of the ethanolic extract from flowers of Combretum leprosum.ResultsTopical application of ethanolic extract promoted a dose-dependent inhibition of phorbol ester-induced ear oedema, reduced myeloperoxidase activity and IL-6 tissue levels with inhibition comparable to dexamethasone (positive control). Histological and immunohistochemical analysis revealed that ethanolic extract also suppressed cell infiltration. Ethanolic extract altered inflammatory parameters on a chronic skin inflammation model induced by repeated applications of croton oil, decreasing ear oedema, epidermal hyperproliferation and cell infiltration. In addition, immunohistochemical analysis showed that the extract decreased PCNA expression on the epidermis.ConclusionTaken together, these results suggest that the extract from flowers of Combretum leprosum could be considered as a new potential tool for the treatment of several skin inflammatory diseases since it reversed the skin inflammatory and hyperproliferative process in a very significant manner. Further investigations are needed in order to verify the cellular mechanism and safety of Combretum leprosum extract

Envolvimento das cininas na psoríase induzida por Imiquimod

Orientadora: Profa. Dra. Daniela de Almeida CabriniCoorientador: Prof. Dr. Michel Fleith OtukiTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Defesa : Curitiba, 05/07/2019Inclui referências: p. 137-150Resumo: As cininas são peptídeos vasoativos associados a uma ampla gama de efeitos fisiológicos e fisiopatológicos, sendo seus efeitos atribuídos à ativação de receptores específicos denominados B1 e B2. Estudos mostraram que os constituintes do sistema de cininas são constitutivamente expressos na pele, assim como, receptores e níveis de cininas são regulados positivamente durante distúrbios cutâneos. Contudo, apesar das evidências, o papel das cininas nas doenças inflamatórias da pele é pouco compreendido. Nosso grupo já demonstrou que os receptores cininérgicos estão envolvidos no controle do processo hiperproliferativo de queratinócitos. No entanto, não está claro como as cininas modulam os parâmetros inflamatórios observados na psoríase. Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar a relevância das cininas no desenvolvimento e progressão da psoríase. Para alcançar os objetivos propostos, camundongos C57BL/6 wild type (WT) e nocautes para os receptores das cininas (KOB1, KOB2 e KOB1B2) foram submetidos ao modelo de inflamação crônica tipo psoriática induzida por Imiquimod (IMQ). Adicionalmente, animais C57BL/6 WT foram tratados com antagonistas seletivos não-peptídicos para os receptores de cininas (SSR240612C ou FR173657) ou Captopril (inibidor da cininase II, ECA). Os resultados obtidos mostraram que ambos os receptores cininérgicos (B1 e B2) estão presentes constitutivamente na pele de camundongos, assim como, é observado o aumento significativo destes receptores após 6 dias de tratamento com IMQ. Além disso, foi observado que o silenciamento dos receptores B1 e B2, pelo nocaute do gene, promoveu melhora das características morfológicas e histológicas da psoríase induzida por IMQ, quando comparados ao grupo WT. Esse efeito protetor foi associado à reduções significativas no número de queratinócitos indiferenciados e em proliferação, menor celularidade dérmica (menor infiltrado de neutrófilos, macrófagos e linfócitos T CD4+), além de menor acúmulo de IL-17 nas lesões psoriáticas. Além disso, o silenciamento do receptor B2, mas não do receptor B1, reduziu o infiltrado de células T CD8+ na pele psoriática. Adicionalmente, a ausência dos receptores cininérgicos promoveu efeito protetor ao prevenir o aumento do peso de órgãos linfóides (baço, linfonodos inguinais e axilares), efeito sistêmico induzido pela aplicação tópica de IMQ. Corroborando estes achados, animais tratados com o antagonista do receptor B1 (SSR240612C) ou com o antagonista do receptor B2 (FR173657) das cininas apresentaram resultados semelhantes aos observados com animais nocautes no modelo de psoríase experimental induzido por IMQ. Em contraste, animais que receberam Captopril, ao longo do protocolo experimental, apresentaram exacerbação do processo psoriático induzido por IMQ. Sendo observado aumento da hiperplasia epidermal (com mais queratinócitos hiperproliferativos e indiferenciados), aumento do influxo de células inflamatórias (maior infiltrado de neutrófilos e macrófagos), além de acentuado acúmulo de IL- 17, quando comparado ao grupo veículo (salina + IMQ). Alterações similares foram observadas na avaliação de efeitos sistêmicos induzidos por IMQ, onde Captopril (100 mg/Kg) intensificou o aumento do peso do linfonodo axilar. Por fim, foi verificado que a melhora do processo inflamatório tipo psoriático, decorrente do nocaute e bloqueio dos receptores de cininas, refletiu-se no comportamento de bem-estar dos camundongos. Em contrapartida, Captopril promoveu a piora do quadro psoriático e, consequente, redução do bem-estar animal. Assim, os dados obtidos reforçam o envolvimento do sistema de cininas na psoríase, sugerindo participação de ambos os receptores cininérgicos na exacerbação do processo inflamatório crônico. Adicionalmente, os resultados sugerem que os receptores B1 e B2 podem constituir alvos terapêuticos potencialmente relevantes para o tratamento da psoríase. Palavras-chave: Cininas, Psoríase, Receptores Cininérgicos, Receptor B1, Receptor B2.Abstract: Kinins are vasoactive peptides associated with a wide range of physiological and pathophysiological effects, and their effects are attributed to the activation of specific receptors called B1 and B2. Studies have shown that all kinin system constituents are constitutively expressed in the skin, as well as, receptors and kinins levels are upregulated during cutaneous disorders. However, despite the evidence, the role of kinins in inflammatory skin diseases is poorly understood. Our group has already demonstrated that kinin receptors are involved in the control of the keratinocyte hyperproliferative. However, it is unclear how the kinins modulate the inflammatory parameters observed in psoriasis. Thus, the present study aimed to evaluate the relevance of kinins in the development and progression of psoriasis. To achieve the proposed objectives, C57BL/6 wild type (WT) and kinin receptors knockout (KOB1, KOB2 and KOB1B2) mice were subjected to the Imiquimod (IMQ)-induced mouse model of psoriasis. In addition, C57BL/6 WT animals were treated with selective non-peptidic antagonists for kinin receptors (SSR240612C or FR173657) or Captopril (kininase II inhibitor, ACE). The results showed that both kinin receptors (B1 and B2) are constitutively present in the mice skin, as well as a significant increase of these receptors is observed after 6 days of IMQ treatment. In addition, was observed that lack of B1 and B2 receptors, by gene knockout, promoted improvement in the morphological and histological hallmark symptoms of psoriasis induced by IMQ, when compared to the WT group. This protective effect was associated with significant reductions in the number of undifferentiated and proliferating keratinocytes, lower dermal cellularity (reduction of neutrophil, macrophages and CD4+ T lymphocytes infiltrate), and lower IL-17 accumulation in psoriatic lesions. In addition, the absence of B2 receptors, but not the B1 receptor, reduced the CD8+ T cell infiltrate in the psoriatic skin. Additionally, the absence of the kininergic receptors promoted a protective effect by preventing the lymphoid organs weight increase (spleen, inguinal and axillary lymph nodes), systemic effect induced by IMQ. Corroborating these findings, animals treated with the B1 receptor antagonist (SSR240612C) or the B2 receptor antagonist (FR173657) showed similar results to those observed with knockout animals in the experimental IMQ-induced psoriasis model. In contrast, animals treated with Captopril, throughout the experimental protocol, had exacerbation of the psoriatic process IMQ- induced. The results showed increase in epidermal hyperplasia (large hyperproliferative and undifferentiated keratinocytes), inflammatory cells influx (large neutrophil and macrophages infiltration) and high IL-17 accumulation, relative to the vehicle group (saline + IMQ). Similarly, Captopril (100 mg/Kg) intensified the axillary lymph node enlargement IMQ-induced. Finally, was verified that the improvement of the psoriatic process, due to the kinin receptor knockout and blockade, was reflected in the well-being mice behavior. On the other hand, Captopril promoted worsening of the psoriasis and negative animal welfare impacts. Thus, the data obtained reinforce the involvement of the kinin system in psoriasis, suggesting the participation of both kininergic receptors in the chronic inflammatory process exacerbation. In addition, the results suggest that B1 and B2 receptors may be potentially relevant therapeutic targets for the treatment of psoriasis. Keywords: Kinin, Psoriasis, Kininergic Receptors, Receptor B1, Receptor B2

TCTP from Loxosceles Intermedia (Brown Spider) Venom Contributes to the Allergic and Inflammatory Response of Cutaneous Loxoscelism

LiTCTP is a toxin from the Translationally Controlled Tumor Protein (TCTP) family identified in Loxosceles brown spider venoms. These proteins are known as histamine-releasing factors (HRF). TCTPs participate in allergic and anaphylactic reactions, which suggest their potential role as therapeutic targets. The histaminergic effect of TCTP is related to its pro-inflammatory functions. An initial characterization of LiTCTP in animal models showed that this toxin can increase the microvascular permeability of skin vessels and induce paw edema in a dose-dependent manner. We evaluated the role of LiTCTP in vitro and in vivo in the inflammatory and allergic aspects that undergo the biological responses observed in Loxoscelism, the clinical condition after an accident with Loxosceles spiders. Our results showed LiTCTP recombinant toxin (LiRecTCTP) as an essential synergistic factor for the dermonecrotic toxin actions (LiRecDT1, known as the main toxin in the pathophysiology of Loxoscelism), revealing its contribution to the exacerbated inflammatory response clinically observed in envenomated patients