16 research outputs found

    Propietats coordinants i estructurals de la proteïna CuMT-II del cranc Callinectes sapidus : una metal·lotioneïna amb triplets de cisteïna /

    Get PDF
    Consultable des del TDXTítol obtingut de la portada digitalitzadaLes metal·lotioneïnes (MTs), pèptids amb una excepcional capacitat coordinant, constitueixen una gran família de metal·loproteïnes presents en gairebé tots els éssers vius. L'estudi de les propietats coordinants i estructurals de les diverses isoformes de MT és important per a aportar noves dades a la resolució de les funcions que duen a terme, fins ara relacionades amb la destoxicació de metalls pesants i l'homeòstasi de zinc i coure. En aquesta tesi doctoral s'ha estudiat la metal·lotioneïna del cranc Callinectes sapidus CuMT-II (MTC en aquest treball), per la seva atípica estructura primària dins les MTs de crustaci i per contenir triplets de cisteïna, motiu molt poc habitual en aquestes proteïnes. Aquesta MT s'ha obtingut per enginyeria genètica en medis suplementats amb zinc, amb coure i amb ambdós metalls. Els complexos metàl·lics formats en aquestes síntesis s'han caracteritzat mitjançant ESI-MS, CD, UV i ICP-AES. Així mateix, fent ús d'aquestes tècniques, s'ha aprofundit en les propietats coordinants de MTC mitjançant la reconstitució de la forma demetal·lada apoMTC i la valoració de ZnMTC i apoMTC amb diversos ions metàl·lics. Finalment, s'ha estudiat per RMN la proteïna reconstituïda amb 113Cd. Amb aquests estudis s'ha establert que per a una millor estructuració amb coure, aquesta proteïna també ha de contenir ions zinc i que, a diferència del que estava àmpliament acceptat per a altres metal·lotioneïnes, l'estequiometria dels complexos que estableix MTC amb Cd(II) no s'ajusta exactament amb la que estableix amb Zn(II). Els treballs de RMN han permès establir que l'estructuració de MTC amb ions cadmi té lloc en dos dominis, cadascun dels quals coordina 3 - 4 ions Cd(II). Addicionalment, s'ha aportat noves dades sobre el mecanisme de funcionament de les MTs en el seu paper antiinflamatori en lesions cerebrals, mitjançant l'estudi funcional dels dominis de MT-1 de mamífer en ratolins criolesionats, knockout per MT-1/-2 (amb els gens de MT-1 i MT-2 inactivats), concloent que el domini β presenta unes millors condicions antiinflamatòries.Metallothioneins (MTs), peptides with an exceptional heavy metal coordination capacity, constitute a superfamily of ubiquitous metalloproteins. Study of MTs metal coordinating properties and their structure is necessary to contribute to the determination of their physiological functions. Nowadays, detoxification of heavy metals and homeostasis of zinc and copper are some of the principal functions proposed for MTs. The principal aim of our work is to study the binding properties of isoform CuMT-II form the crab Callinectes sapidus (MTC), a crustacean MT with an atypical peptide sequence containing two cysteine triplets, which is a very unusual motif in MTs. MTC was obtained by genetic engineering protocols in zinc, copper and zinc plus copper supplemented media. The metal complexes recovered were analyzed by ESI-MS, CD, UV and ICP-AES spectroscopies. Metal coordination properties of MTC were deeper studied by means of metal reconstitution from apoMTC and by titration of ZnMTC and apoMTC with Cd(II) and Cu(I). Structural NMR studies of MTC reconstituted with 113Cd have also been carried out. MTC requires the binding of some Zn(II) ion to acquire the most chiral structure in the presence of Cu(I). Interestingly, cadmium total metallated protein shows slightly higher metal to MT stoichiometries than in the case of zinc in contrast with the equal Zn and Cd stoichiometries shown for most MTs. Moreover, NMR studies have shown that CdMTC is structured in two domains, with 3 - 4 Cd(II) ions in each of them. Additionally, we have contribute to determine the mechanism of MTs anti-inflammatory activity in brain, by studying the rule of the α and β domains of mammalian MT-1 in cryolesioned MTKO mice, which indicate that the β domain shows better anti-inflammatory properties than the α domain

    The metal-binding properties of the blue crab copper specific CuMT-2: a crustacean metallothionein with two cysteine triplets

    Get PDF
    Most crustacean metallothioneins (MTs) contain 18 Cys residues and bind six divalent metal ions. The copper-specific CuMT-2 (MTC) of the blue crab Callinectes sapidus with 21Cys residues, of which six are organized in two uncommon Cys-Cys-Cys sequences, represents an exception. However, its metal-binding properties are unknown. By spectroscopic and spectrometric techniques we show that all 21 Cys residues of recombinant MTC participate in the binding of Cu(I), Zn(II), and Cd(II) ions, indicating that both Cys triplets act as ligands. The fully metallated M8 II-MTC (MisZn, Cd) form possesses high- and low-affinity metal binding sites, as evidenced by the formation of Zn6-MTC and Cd7-MTC species from M8 II-MTC after treatment with Chelex 100. The NMR characterization of Cd7-MTC suggests the presence of a two-domain structure, each domain containing one Cys triplet and encompassing either the three-metal or the four-metal thiolate cluster. Whereas the metal-Cys connectivities in the three-metal cluster located in the N-terminal domain (residues 1-31) reveal a Cd3Cys9 cyclohexane-like structure, the presence of dynamic processes in the C-terminal domain (residues 32-64) precluded the determination of the organization of the four-metal cluster. Absorption and circular dichroism features accompanying the stepwise binding of Cu(I) to MTC suggest that all 21Cys are involved in the binding of eight to nine Cu(I) ions (Cu8-9-MTC). The subsequent generation of Cu12-MTC involves structural changes consistent with a decrease in the Cu(I) coordination number. Overall, the metal-binding properties of MTC reported here contribute to a better understanding of the role of Cys triplets in MT

    Alzheimer´s Disease-associated Aβ42 Peptide: Expression and Purification for NMR Structural Studies

    Get PDF
    Background: The aggregation of the amyloid-beta peptide (Aβ) in the brain is strongly associated with Alzheimer´s disease (AD). However, the heterogeneous and transient nature of this process has prevented identification of the exact molecular form of Aβ responsible for the neurotoxicity observed in this disease. Therefore, characterizing Aβ aggregation is of utmost importance in the field of AD. Nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) is a technique that holds great potential to achieve this goal. However, it requires the use of specific labels introduced through recombinant expression of Aβ. Objective: In this paper, we report on a straightforward expression and purification protocol to obtain [U-15N] and [U-2H,13C,15N] Aβ42. Method: Aβ42 is expressed fused to Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO) protein, which prevents Aβ42 aggregation. Results: The solubilizing capacity of SUMO has allowed us to design a purification protocol involving immobilized metal affinity chromatography (IMAC), a desalting step, and two size exclusion chromatography (SEC) purifications. Conclusion: This approach, which does not require the use of costly and time-consuming reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC), offers a much straightforward strategy to those previously described to obtain [U-15N] Aβ42 and it is the first protocol through which to achieve [U-2H,13C,15N] Aβ42. The peptides obtained are of high purity and have the required isotope enrichment to support NMR-based structural studies

    Direct evidence of the presence of cross-linked Aβ dimers in the brains of Alzheimer's disease patients

    Get PDF
    Brain-derived amyloid-β (Aβ) dimers are associated with Alzheimer´s disease (AD). However, their covalent nature remains controversial. This feature is relevant, as a covalent cross-link would make brain-derived dimers (brain dimers) more synaptotoxic than Aβ monomers and would make them suitable candidates for biomarker development. To resolve this controversy, we here present a three-step approach. First, we validated a type of synthetic cross-linked Aβ (CL Aβ) dimers, obtained by means of the photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) reaction, as well-defined mimics of putative brain CL Aβ dimers. Second, we used these PICUP CL Aβ dimers as standards to improve the isolation of brain Aβ dimers and to develop state-of-the-art mass spectrometry (MS) strategies to allow their characterization. Third, we applied these MS methods to the analysis of brain Aβ dimer samples allowing the detection of the CL [Aβ(6-16)]2 peptide comprising a dityrosine cross-link. This result demonstrates the presence of CL Aβ dimers in the brains of patients with AD and opens up avenues for establishing new therapeutic targets and developing novel biomarkers for this disease

    Regió Metropolitana de Barcelona. Indicadors estadístics municipals

    No full text
    Disposar d'informacions actualitzades i amb el màxim grau de detall possible és una necessitat creixent en tots els àmbits del coneixement i de la gestió. En el camp de la reflexió i l'actuació sobre les realitats urbanes i metropolitanes aquesta necessitat és especialment intensa. En primer lloc, perquè existeix un important dèficit d'informacions en aquest sentit, fins i tot en aspectes molt bàsics, que només molt recentment i parcialment comença a satisfer-se. I, d'altra banda, perquè els fenòmens urbans i metropolitans són extraordinàriament dinàmics tant en el temps com en l'espai i, per això, la seva comprensió reclama un seguiment constant. El present treball pretén, doncs, contribuir al coneixement de la realitat metropolitana de Barcelona, aplegant i ordenant en una sola publicació de fàcil consulta algunes de les informacions bàsiques i paràmetres més rellevants en què es manifesta la configuració i l'evolució de l'espai metropolità. Com a àmbit de referència s'ha considerat el dels 163 municipis que conformen la Regió o Àmbit metropolità establert pel Pla Territorial General de Catalunya, al qual s'estenen avui les principals dinàmiques demogràfiques, econòmiques i urbanístiques de l'aglomeració de Barcelona. S'ha optat per un recull selectiu de dades de nivell municipal -el màxim detall disponible per a la majoria d'informacions estadístiques- i la seva elaboració en forma d'indicadors i de gràfics. Així, s'ha buscat no tant l'exhaustivitat de les xifres com la seva intencionalitat i utilitat, per tal de facilitar-ne les comparacions i les interpretacions. També s'ha tingut en compte que es tractés de les dades més recents en cada tema, i que fossin disponibles per a tots els municipis de l'àmbit considerat. La presentació de les fitxes municipals en suport convencional es complementa amb la taula que s'adjunta en suport informàtic, per tal de facilitar al màxim a tots els usuaris interessats l'accés a les dades que puguin necessitar per a les seves elaboracions pròpies. Aquesta aportació s'inscriu en una línia de servei afortunadament cada vegada més freqüent per part de diverses institucions i entitats, entre les quals destaca l'Institut d'Estadística de Catalunya amb el conjunt d'informacions que distribueix mitjançant la seva Web i altres canals, i de les quals el present treball -i tants d'altres a casa nostra- en són deutors en gran mesura

    Regió Metropolitana de Barcelona. Indicadors estadístics municipals

    No full text
    Disposar d'informacions actualitzades i amb el màxim grau de detall possible és una necessitat creixent en tots els àmbits del coneixement i de la gestió. En el camp de la reflexió i l'actuació sobre les realitats urbanes i metropolitanes aquesta necessitat és especialment intensa. En primer lloc, perquè existeix un important dèficit d'informacions en aquest sentit, fins i tot en aspectes molt bàsics, que només molt recentment i parcialment comença a satisfer-se. I, d'altra banda, perquè els fenòmens urbans i metropolitans són extraordinàriament dinàmics tant en el temps com en l'espai i, per això, la seva comprensió reclama un seguiment constant. El present treball pretén, doncs, contribuir al coneixement de la realitat metropolitana de Barcelona, aplegant i ordenant en una sola publicació de fàcil consulta algunes de les informacions bàsiques i paràmetres més rellevants en què es manifesta la configuració i l'evolució de l'espai metropolità. Com a àmbit de referència s'ha considerat el dels 163 municipis que conformen la Regió o Àmbit metropolità establert pel Pla Territorial General de Catalunya, al qual s'estenen avui les principals dinàmiques demogràfiques, econòmiques i urbanístiques de l'aglomeració de Barcelona. S'ha optat per un recull selectiu de dades de nivell municipal -el màxim detall disponible per a la majoria d'informacions estadístiques- i la seva elaboració en forma d'indicadors i de gràfics. Així, s'ha buscat no tant l'exhaustivitat de les xifres com la seva intencionalitat i utilitat, per tal de facilitar-ne les comparacions i les interpretacions. També s'ha tingut en compte que es tractés de les dades més recents en cada tema, i que fossin disponibles per a tots els municipis de l'àmbit considerat. La presentació de les fitxes municipals en suport convencional es complementa amb la taula que s'adjunta en suport informàtic, per tal de facilitar al màxim a tots els usuaris interessats l'accés a les dades que puguin necessitar per a les seves elaboracions pròpies. Aquesta aportació s'inscriu en una línia de servei afortunadament cada vegada més freqüent per part de diverses institucions i entitats, entre les quals destaca l'Institut d'Estadística de Catalunya amb el conjunt d'informacions que distribueix mitjançant la seva Web i altres canals, i de les quals el present treball -i tants d'altres a casa nostra- en són deutors en gran mesura

    Aβ42 assembles into specific β-barrel pore-forming oligomers in membrane-mimicking environments

    Get PDF
    The formation of amyloid-β peptide (Aβ) oligomers at the cellular membrane is considered to be a crucial process underlying neurotoxicity in Alzheimer's disease (AD). Therefore, it is critical to characterize the oligomers that form within a membrane environment. To contribute to this characterization, we have applied strategies widely used to examine the structure of membrane proteins to study the two major Aβ variants, Aβ40 and Aβ42. Accordingly, various types of detergent micelles were extensively screened to identify one that preserved the properties of Aβ in lipid environments-namely the formation of oligomers that function as pores. Remarkably, under the optimized detergent micelle conditions, Aβ40 and Aβ42 showed different behavior. Aβ40 aggregated into amyloid fibrils, whereas Aβ42 assembled into oligomers that inserted into lipid bilayers as well-defined pores and adopted a specific structure with characteristics of a β-barrel arrangement that we named β-barrel pore-forming Aβ42 oligomers (βPFOsAβ42). Because Aβ42, relative to Aβ40, has a more prominent role in AD, the higher propensity of Aβ42 to form βPFOs constitutes an indication of their relevance in AD. Moreover, because βPFOsAβ42 adopt a specific structure, this property offers an unprecedented opportunity for testing a hypothesis regarding the involvement of βPFOs and, more generally, membrane-associated Aβ oligomers in AD

    Alzheimer´s Disease-associated Aβ42 Peptide: Expression and Purification for NMR Structural Studies

    No full text
    Background: The aggregation of the amyloid-beta peptide (Aβ) in the brain is strongly associated with Alzheimer´s disease (AD). However, the heterogeneous and transient nature of this process has prevented identification of the exact molecular form of Aβ responsible for the neurotoxicity observed in this disease. Therefore, characterizing Aβ aggregation is of utmost importance in the field of AD. Nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) is a technique that holds great potential to achieve this goal. However, it requires the use of specific labels introduced through recombinant expression of Aβ. Objective: In this paper, we report on a straightforward expression and purification protocol to obtain [U-15N] and [U-2H,13C,15N] Aβ42. Method: Aβ42 is expressed fused to Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO) protein, which prevents Aβ42 aggregation. Results: The solubilizing capacity of SUMO has allowed us to design a purification protocol involving immobilized metal affinity chromatography (IMAC), a desalting step, and two size exclusion chromatography (SEC) purifications. Conclusion: This approach, which does not require the use of costly and time-consuming reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC), offers a much straightforward strategy to those previously described to obtain [U-15N] Aβ42 and it is the first protocol through which to achieve [U-2H,13C,15N] Aβ42. The peptides obtained are of high purity and have the required isotope enrichment to support NMR-based structural studies

    Image3_Stabilization of a Membrane-Associated Amyloid-β Oligomer for Its Validation in Alzheimer's Disease.TIF

    No full text
    <p>We have recently reported on the preparation of a membrane-associated β-barrel Pore-Forming Aβ42 Oligomer (βPFO<sub>Aβ42</sub>). It corresponds to a stable and homogeneous Aβ42 oligomer that inserts into lipid bilayers as a well-defined pore and adopts a specific structure with characteristics of a β-barrel arrangement. As a follow-up of this work, we aim to establish βPFO<sub>Aβ42</sub>'s relevance in Alzheimer's disease (AD). However, βPFO<sub>Aβ42</sub> is formed under dodecyl phosphocholine (DPC) micelle conditions—intended to mimic the hydrophobic environment of membranes—which are dynamic. Consequently, dilution of the βPFO<sub>Aβ42</sub>/DPC complex in a detergent-free buffer leads to dispersion of the DPC molecules from the oligomer surface, leaving the oligomer without the hydrophobic micelle belt that stabilizes it. Since dilution is required for any biological test, transfer of βPFO<sub>Aβ42</sub> from DPC micelles into another hydrophobic biomimetic membrane environment, that remains associated with βPFO<sub>Aβ42</sub> even under high dilution conditions, is a requisite for the validation of βPFO<sub>Aβ42</sub> in AD. Here we describe conditions for exchanging DPC micelles with amphipols (APols), which are amphipathic polymers designed to stabilize membrane proteins in aqueous solutions. APols bind in an irreversible but non-covalent manner to the hydrophobic surface of membrane proteins preserving their structure even under extreme dilution conditions. We tested three types of APols with distinct physical-chemical properties and found that the βPFO<sub>Aβ42</sub>/DPC complex can only be trapped in non-ionic APols (NAPols). The characterization of the resulting βPFO<sub>Aβ42</sub>/NAPol complex by biochemical tools and structural biology techniques allowed us to establish that the oligomer structure is maintained even under high dilution. Based on these findings, this work constitutes a first step towards the in vivo validation of βPFO<sub>Aβ42</sub> in AD.</p
    corecore