ATPase activity of DFCP1 controls selective autophagy

Cellular homeostasis is governed by removal of damaged organelles and protein aggregates by selective autophagy mediated by cargo adaptors such as p62/SQSTM1. Autophagosomes can assemble in specialized cup-shaped regions of the endoplasmic reticulum (ER) known as omegasomes, which are characterized by the presence of the ER protein DFCP1/ZFYVE1. The function of DFCP1 is unknown, as are the mechanisms of omegasome formation and constriction. Here, we demonstrate that DFCP1 is an ATPase that is activated by membrane binding and dimerizes in an ATP-dependent fashion. Whereas depletion of DFCP1 has a minor effect on bulk autophagic flux, DFCP1 is required to maintain the autophagic flux of p62 under both fed and starved conditions, and this is dependent on its ability to bind and hydrolyse ATP. While DFCP1 mutants defective in ATP binding or hydrolysis localize to forming omegasomes, these omegasomes fail to constrict properly in a size-dependent manner. Consequently, the release of nascent autophagosomes from large omegasomes is markedly delayed. While knockout of DFCP1 does not affect bulk autophagy, it inhibits selective autophagy, including aggrephagy, mitophagy and micronucleophagy. We conclude that DFCP1 mediates ATPase-driven constriction of large omegasomes to release autophagosomes for selective autophagy

Dual Targeting of BRAF and mTOR Signaling in Melanoma Cells with Pyridinyl Imidazole Compounds

BRAF inhibitors can delay the progression of metastatic melanoma, but resistance usually emerges, leading to relapse. Drugs simultaneously targeting two or more pathways essential for cancer growth could slow or prevent the development of resistant clones. Here, we identified pyridinyl imidazole compounds SB202190, SB203580, and SB590885 as dual inhibitors of critical proliferative pathways in human melanoma cells bearing the V600E activating mutation of BRAF kinase. We found that the drugs simultaneously disrupt the BRAF V600E-driven extracellular signal-regulated kinase (ERK) mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity and the mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1) signaling in melanoma cells. Pyridinyl imidazole compounds directly inhibit BRAF V600E kinase. Moreover, they interfere with the endolysosomal compartment, promoting the accumulation of large acidic vacuole-like vesicles and dynamic changes in mTOR signaling. A transient increase in mTORC1 activity is followed by the enrichment of the Ragulator complex protein p18/LAMTOR1 at contact sites of large vesicles and delocalization of mTOR from the lysosomes. The induced disruption of the endolysosomal pathway not only disrupts mTORC1 signaling, but also renders melanoma cells sensitive to endoplasmic reticulum (ER) stress. Our findings identify new activities of pharmacologically relevant small molecule compounds and provide a biological rationale for the development of anti-melanoma therapeutics based on the pyridinyl imidazole core

Septation of Infectious Hyphae Is Critical for Appressoria Formation and Virulence in the Smut Fungus Ustilago Maydis

Differentiation of hyphae into specialized infection structures, known as appressoria, is a common feature of plant pathogenic fungi that penetrate the plant cuticle. Appressorium formation in U. maydis is triggered by environmental signals but the molecular mechanism of this hyphal differentiation is largely unknown. Infectious hyphae grow on the leaf surface by inserting regularly spaced retraction septa at the distal end of the tip cell leaving empty sections of collapsed hyphae behind. Here we show that formation of retraction septa is critical for appressorium formation and virulence in U. maydis. We demonstrate that the diaphanous-related formin Drf1 is necessary for actomyosin ring formation during septation of infectious hyphae. Drf1 acts as an effector of a Cdc42 GTPase signaling module, which also consists of the Cdc42-specific guanine nucleotide exchange factor Don1 and the Ste20-like kinase Don3. Deletion of drf1, don1 or don3 abolished formation of retraction septa resulting in reduced virulence. Appressorium formation in these mutants was not completely blocked but infection structures were found only at the tip of short filaments indicating that retraction septa are necessary for appressorium formation in extended infectious hyphae. In addition, appressoria of drf1 mutants penetrated the plant tissue less frequently

Funktionelle Analyse von Rho-spezifischen Guaninnukleotidaustauschfaktoren in Ustilago maydis

Kleine GTPasen der Rho-Familie fungieren als molekulare Schalter in einer Vielzahl von zellulären Prozessen, unter anderem bei der Organisation des Aktinzytoskeletts, der Zellpolarität und dem Vesikeltransport. In der vorliegenden Arbeit wurden mehrere Aspekte der kleinen GTPasen Cdc42 und Rac1 in dem phytophathogenen Pilz Ustilago maydis untersucht. Zum einen wurde untersucht, wie in komplexen GTPase-Signalkaskaden eine spezifische Signalweiterleitung gewährleistet werden kann. So gibt es deutlich mehr Aktivatoren und Effektoren, als das es Rho-GTPasen gibt. So kann eine GTPase oftmals von mehr als einem Aktivator stimuliert werden und ihrerseits mehr als einen Effektor aktivieren. Gleichzeitig ist diese Interaktion nicht immer spezifisch; so können viele Effektoren mit mehr als einer GTPase interagieren. Es stellt sich also die Frage, wie sichergestellt wird, dass die richtige Signalantwort auf einen spezifischen Stimulus erfolgt. Die GTPasen Cdc42 und Rac1 zeigen ein hohes Maß an Sequenzidentität, aber eine Deletion dieser Proteine in U. maydis führt zu vollkommen unterschiedlichen Phänotypen. Daher agieren Cdc42 und Rac1 in unterschiedlichen Signalkaskaden. Aus anderen Organismen war bekannt, dass die Aminosäure an Position 56 eine wichtige Rolle für die spezifische Erkennung von Cdc42 und Rac1 durch Guaninnukleotidaustauschfaktoren spielt. Daher wurde untersucht, welche Rolle die Aktivierung von Rho-GTPasen durch Guaninnukleotidaustauschfaktoren bei der Spezifitätsdetermination spielt. Mit Hilfe eines in vitro-Systems konnte gezeigt werden, dass der GEF Don1 hoch spezifisch den Nukleotidaustausch an der Rho-GTPase Cdc42 katalysiert, während er gegenüber der nah verwandten GTPase Rac1 inert ist. Gleichzeitig reicht ein Aminosäureaustausch an Position 56 von Cdc42 und Rac1 aus, um eine Aktivierung von Rac1W56F durch Don1 zu erlauben. Die Aminosäure an Position 56 scheint gleichzeitig auch der kritische Faktor für die Erkennung von Cdc42 durch Don1 zu sein. Für den GEF Cdc24 konnte gezeigt werden, dass dieser präferentiell Rac1 aktiviert. Auch hierbei ist die Aminosäure an Position 56 ein wichtiger Faktor für die Erkennung der GTPase durch Cdc24. Cdc42 mit einem Aminosäureaustausch an dieser Position, Cdc42F56W, wird von Cdc24 deutlich effektiver aktiviert als Wildtyp-Cdc42. Der korrespondierende Austausch, Rac1W56F, dagegen führt zu einer deutlich schlechteren Aktivierung durch Cdc24. Da die untersuchten Austausche gleichzeitig einen Wechsel der in vivo-Funktion der GTPasen mit sich brachten, stellte sich die Frage, ob alleine die Aktivierung durch einen spezifischen GEF zu einer bestimmten Signalantwort führt oder ob die eingebrachten Austausche auch einen Wechsel der Effektorspezifität und darüber die Aktivierung einer anderen Signalkaskade auslösen. Während die Aktivierung einer beliebigen GTPase durch den GEF Cdc24 ausreichend für eine Cdc24-spezifische Signalantwort ist, ist dies bei der Don1-vermittelten Signalkaskade nicht der Fall. Hier führt ein Austausch der Aminosäure 56 nicht nur zu einem Wechsel der GEF- sondern auch der Effektorspezifität. Als weiterer Punkt dieser Arbeit wurde die Rolle des GEFs Don1 während der Zytokinese untersucht. Während der Zellteilung bildet U. maydis nacheinander zwei Septen aus, die durch eine Fragmentierungszone voneinander getrennt werden. Don1 reguliert zusammen mit Cdc42 die Bildung des sekundären Septums. Don1 gehört zur Familie der Fgd1-verwandten GEFs, die sich durch eine C-terminale lipidbindende FYVE-Domäne auszeichnen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die FYVE-Domäne von Don1 an das Lipid PtdIns(3)P bindet und kritisch für die Funktion dieses GEFs in vivo ist. Die FYVE-Domäne rekrutiert Don1 an endosomale Vesikel, die über das Kinesin-Motorprotein Kin3 in die Zellteilungszone transportiert werden, wo es zu einer asymmetrische Akkumulation der Endosomen auf der Tochterseite des primären Septums kommt. Endosomal lokalisiertes Don1 vermittelt hier die Reorganisation des Aktinzytoskeletts während der Bildung des sekundären Septums. Als finaler Aspekt wurde die Rolle des Exocyst-Komplex während der Zellteilung und dem polaren Wachstum von U. maydis untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das Exocyst-landmark-Protein Sec3 mit Cdc42 und Rac1 interagiert. Eine Deletion dieses Proteins führt zu Polaritäts- und Zytokinesedefekten. Da der Exocyst-Komplex die Fusion von sekretorischen Vesikeln mit der Plasmamembran katalysiert, wurde die Dynamik dieser Vesikel während des knospenden und filamentösen Wachstums untersucht. In U. maydis werden sekretorische Vesikel über lange Strecken entlang von Mikrotubuli transportiert. Dieser Transport erfolgt bidirektional und wird über Kinesin- und Dynein-Motorproteine vermittel

Funktionelle Analyse von Rho-spezifischen Guaninnukleotidaustauschfaktoren in Ustilago maydis

Kleine GTPasen der Rho-Familie fungieren als molekulare Schalter in einer Vielzahl von zellulären Prozessen, unter anderem bei der Organisation des Aktinzytoskeletts, der Zellpolarität und dem Vesikeltransport. In der vorliegenden Arbeit wurden mehrere Aspekte der kleinen GTPasen Cdc42 und Rac1 in dem phytophathogenen Pilz Ustilago maydis untersucht. Zum einen wurde untersucht, wie in komplexen GTPase-Signalkaskaden eine spezifische Signalweiterleitung gewährleistet werden kann. So gibt es deutlich mehr Aktivatoren und Effektoren, als das es Rho-GTPasen gibt. So kann eine GTPase oftmals von mehr als einem Aktivator stimuliert werden und ihrerseits mehr als einen Effektor aktivieren. Gleichzeitig ist diese Interaktion nicht immer spezifisch; so können viele Effektoren mit mehr als einer GTPase interagieren. Es stellt sich also die Frage, wie sichergestellt wird, dass die richtige Signalantwort auf einen spezifischen Stimulus erfolgt. Die GTPasen Cdc42 und Rac1 zeigen ein hohes Maß an Sequenzidentität, aber eine Deletion dieser Proteine in U. maydis führt zu vollkommen unterschiedlichen Phänotypen. Daher agieren Cdc42 und Rac1 in unterschiedlichen Signalkaskaden. Aus anderen Organismen war bekannt, dass die Aminosäure an Position 56 eine wichtige Rolle für die spezifische Erkennung von Cdc42 und Rac1 durch Guaninnukleotidaustauschfaktoren spielt. Daher wurde untersucht, welche Rolle die Aktivierung von Rho-GTPasen durch Guaninnukleotidaustauschfaktoren bei der Spezifitätsdetermination spielt. Mit Hilfe eines in vitro-Systems konnte gezeigt werden, dass der GEF Don1 hoch spezifisch den Nukleotidaustausch an der Rho-GTPase Cdc42 katalysiert, während er gegenüber der nah verwandten GTPase Rac1 inert ist. Gleichzeitig reicht ein Aminosäureaustausch an Position 56 von Cdc42 und Rac1 aus, um eine Aktivierung von Rac1W56F durch Don1 zu erlauben. Die Aminosäure an Position 56 scheint gleichzeitig auch der kritische Faktor für die Erkennung von Cdc42 durch Don1 zu sein. Für den GEF Cdc24 konnte gezeigt werden, dass dieser präferentiell Rac1 aktiviert. Auch hierbei ist die Aminosäure an Position 56 ein wichtiger Faktor für die Erkennung der GTPase durch Cdc24. Cdc42 mit einem Aminosäureaustausch an dieser Position, Cdc42F56W, wird von Cdc24 deutlich effektiver aktiviert als Wildtyp-Cdc42. Der korrespondierende Austausch, Rac1W56F, dagegen führt zu einer deutlich schlechteren Aktivierung durch Cdc24. Da die untersuchten Austausche gleichzeitig einen Wechsel der in vivo-Funktion der GTPasen mit sich brachten, stellte sich die Frage, ob alleine die Aktivierung durch einen spezifischen GEF zu einer bestimmten Signalantwort führt oder ob die eingebrachten Austausche auch einen Wechsel der Effektorspezifität und darüber die Aktivierung einer anderen Signalkaskade auslösen. Während die Aktivierung einer beliebigen GTPase durch den GEF Cdc24 ausreichend für eine Cdc24-spezifische Signalantwort ist, ist dies bei der Don1-vermittelten Signalkaskade nicht der Fall. Hier führt ein Austausch der Aminosäure 56 nicht nur zu einem Wechsel der GEF- sondern auch der Effektorspezifität. Als weiterer Punkt dieser Arbeit wurde die Rolle des GEFs Don1 während der Zytokinese untersucht. Während der Zellteilung bildet U. maydis nacheinander zwei Septen aus, die durch eine Fragmentierungszone voneinander getrennt werden. Don1 reguliert zusammen mit Cdc42 die Bildung des sekundären Septums. Don1 gehört zur Familie der Fgd1-verwandten GEFs, die sich durch eine C-terminale lipidbindende FYVE-Domäne auszeichnen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die FYVE-Domäne von Don1 an das Lipid PtdIns(3)P bindet und kritisch für die Funktion dieses GEFs in vivo ist. Die FYVE-Domäne rekrutiert Don1 an endosomale Vesikel, die über das Kinesin-Motorprotein Kin3 in die Zellteilungszone transportiert werden, wo es zu einer asymmetrische Akkumulation der Endosomen auf der Tochterseite des primären Septums kommt. Endosomal lokalisiertes Don1 vermittelt hier die Reorganisation des Aktinzytoskeletts während der Bildung des sekundären Septums. Als finaler Aspekt wurde die Rolle des Exocyst-Komplex während der Zellteilung und dem polaren Wachstum von U. maydis untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das Exocyst-landmark-Protein Sec3 mit Cdc42 und Rac1 interagiert. Eine Deletion dieses Proteins führt zu Polaritäts- und Zytokinesedefekten. Da der Exocyst-Komplex die Fusion von sekretorischen Vesikeln mit der Plasmamembran katalysiert, wurde die Dynamik dieser Vesikel während des knospenden und filamentösen Wachstums untersucht. In U. maydis werden sekretorische Vesikel über lange Strecken entlang von Mikrotubuli transportiert. Dieser Transport erfolgt bidirektional und wird über Kinesin- und Dynein-Motorproteine vermittel

Tumor suppression by control of matrix metalloproteinase recycling

Secretion of matrix metalloproteinases (MMPs) enables cancer cells to degrade extracellular matrix, thus promoting tumor invasion and metastasis. We have recently found that the endosomal protein WDFY2 serves as a gatekeeper for MMP recycling from endosomes and that deletion of WDFY2, which is frequently lost in metastatic cancers, causes increased matrix degradation and cell invasion

Cosegregation of asymmetric features during cell division

Cellular asymmetry plays a major role in the ageing and evolution of multicellular organisms. However, it remains unknown how the cell distinguishes ‘old’ from ‘new’ and whether asymmetry is an attribute of highly specialized cells or a feature inherent in all cells. Here, we investigate the segregation of three asymmetric features: old and new DNA, the spindle pole body (SPB, the centrosome analogue) and the old and new cell ends, using a simple unicellular eukaryote, Schizosaccharomyces pombe. To our knowledge, this is the first study exploring three asymmetric features in the same cells. We show that of the three chromosomes of S. pombe, chromosome I containing the new parental strand, preferentially segregated to the cells inheriting the old cell end. Furthermore, the new SPB also preferentially segregated to the cells inheriting the old end. Our results suggest that the ability to distinguish ‘old’ from ‘new’ and to segregate DNA asymmetrically are inherent features even in simple unicellular eukaryotes

Activation of the Ustilagic Acid Biosynthesis Gene Cluster in Ustilago maydis by the C2H2 Zinc Finger Transcription Factor Rua1▿

The phytopathogenic basidiomycetous fungus Ustilago maydis secretes, under conditions of nitrogen starvation, large amounts of the biosurfactant ustilagic acid (UA). This secreted cellobiose glycolipid is toxic for many microorganisms and confers biocontrol activity to U. maydis. Recently, a large gene cluster that is responsible for UA biosynthesis was identified. Here, we show that expression of all cluster genes depends on Rua1, a nuclear protein of the C2H2 zinc finger family, whose gene is located within the gene cluster. While deletion of rua1 results in complete loss of UA production, overexpression of rua1 promotes increased UA synthesis even in the presence of a good nitrogen source. Bioinformatic analysis allowed us to identify a conserved sequence element that is present in the promoters of all structural genes involved in UA biosynthesis. Deletion analysis of several promoters within the cluster revealed that this DNA element serves as an upstream activating sequence (UAS) and mediates Rua1-dependent expression. We used the yeast one-hybrid system to demonstrate specific recognition of this DNA element by Rua1. Introduction of nucleotide exchanges into the consensus sequence interfered with Rua1-dependent activation, suggesting that this sequence element acts as a direct binding site for Rua1

Divide and ProsPer: The emerging role of PtdIns3P in cytokinesis

Cytokinesis is the final step of cell division whereby the dividing cells separate physically. Failure of this process has been proposed to cause tumourigenesis. Several specific lipids are essential for cytokinesis, and recent evidence has revealed that phosphatidylinositol 3-phosphate (PtdIns3P) — a well-known regulator of endosomal trafficking, receptor signaling, nutrient sensing and autophagy — plays an evolutionarily conserved role during cytokinesis. The emerging picture is that PtdIns3P and its regulators and effectors constitute a novel regulatory mechanism for cytokinesis. Elucidating the role of PtdIns3P in cytokinesis might contribute to insight into mechanisms of tumour development and suppression

JIP4 is recruited by the phosphoinositide-binding protein Phafin2 to promote recycling tubules on macropinosomes

ABSTRACT Macropinocytosis allows cells to take up extracellular material in a non-selective manner into large vesicles called macropinosomes. After internalization, macropinosomes acquire phosphatidylinositol 3-phosphate (PtdIns3P) on their limiting membrane as they mature into endosomal-like vesicles. The molecular mechanisms that underlie recycling of membranes and transmembrane proteins from these macropinosomes still need to be defined. Here, we report that JIP4 (officially known as SPAG9), a protein previously described to bind to microtubule motors, is recruited to tubulating subdomains on macropinosomes by the PtdIns3P-binding protein Phafin2 (officially known as PLEKHF2). These JIP4-positive tubulating subdomains on macropinosomes contain F-actin, the retromer recycling complex and the retromer cargo VAMP3. Disruption of the JIP4–Phafin2 interaction, deletion of Phafin2 or inhibition of PtdIns3P production by VPS34 impairs JIP4 recruitment to macropinosomes. Whereas knockout of JIP4 suppresses tubulation, its overexpression enhances tubulation from macropinosomes. JIP4-knockout cells display increased retention of macropinocytic cargo in both early and late macropinosomes. Collectively, these data identify JIP4 and Phafin2 as components of a tubular recycling pathway that operates from macropinosomes. This article has an associated First Person interview with the first author of the paper