Die Funktion von Munc-18 in der Exozytose sekretorischer Granulen

Die Calcium-abhängige Freisetzung von Neurotransmitter aus sekretorischen Organellen wird durch eine Reihe konservierter Proteinfamilien präzise reguliert. Hierzu zählen u.a. SNARE-Proteine (soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein attachment protein (SNAP) receptor ), Rab-GTPasen und SM-Proteine. SNARE-Proteine sind membranständige Proteine, deren gemeinsames Merkmal das 60-70 Aminosäuren umfassende SNARE-Motiv ist. SNARE-Proteine können sich spontan und irreversibel zu einem Vier-Helix-Bündel („core complex“) zusammenlagern. Die Komplexbildung zwischen SNAREs auf Vesikelmembran und Plasmamembran führt zu einer Verkürzung der Proteine. Hierdurch werden die Membranen einander angenähert, was die Voraussetzung für die Membranfusion darstellt. Die funktionelle Bedeutung von SNARE-Proteinen für die Membranfusion wird durch die Vergiftung von Zellen mit den clostridialen Neurotoxinen Tetanustoxin und Botulinustoxin deutlich, die einzelne SNAREs proteolytisch spalten und die Neurotransmission hemmen. Das synaptische SM-Protein Munc-18-1 bindet hochaffin an das SNARE-Protein Syntaxin1. Hierbei konkurriert die Bindung von Munc-18-1 an Syntaxin1 mit dessen Einbindung in den „core complex“. Dies führte zu einem Modell, demzufolge Munc-18-1 durch seine Bindung an Syntaxin1 eine inhibitorische Rolle in der Exozytose übernimmt. Eine rein inhibitorische Funktion von Munc-18-1 läßt sich jedoch nicht mit seinem essentiellen Charakter für die Membranfusion in allen Spezies vereinbaren. Diese zentrale Rolle des Proteins im Membranfusionsvorgang ist jedoch weitgehend unverstanden. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung der Interaktion zwischen Munc-18-1 und Syntaxin1 für die Exozytose von sekretorischen Granulen neuroendokriner Zellen in einem kombinierten Ansatz aus biochemischen und elektrophysiologischen Methoden untersucht. Die Interaktion zwischen Syntaxin1 und Munc-18-1 wurde gestört, indem zum einen Munc-18-1 überexprimiert wurde und zum andern in die Syntaxin1-Bindungsregion des Munc-18-1-Moleküls Punktmutationen eingeführt wurden (D34N und R39C). Nach der biochemischen Dokumentation der Störung der Syntaxin1-Bindung wurden die Mutanten sowie das Wildtyp- (WT-) Protein in der neuroendokrinen Zellinie PC12 überexprimiert und die Folgen der Überexpression mit Hilfe der Kohlefaser-Amperometrie elektrophysiologisch charakterisiert. Die Überexpression des Munc-18-WT-Proteins hatte keinen Effekt, was eine inhibitorische Funktion des Proteins unwahrscheinlich macht. Die R39C-Mutante wies eine gewisse Restbindung an Syntaxin1 auf, wohingegen die Bindung der D34N-Mutante an Syntaxin1 vernachlässigbar war. Trotz dieser gleichsinnig veränderten Syntaxin1-Bindung hatten die Mutanten gegensätzliche Effekte auf die Häufigkeit exozytotischer Ereignisse: die Zahl exozytotischer Ereignisse war durch R39C vermindert und durch D34N erhöht. Dies wies auf die Beteiligung eines weiteren Munc-18-1-Bindungspartners an den beobachteten Effekten hin, woraufhin die Interaktion von Mint1 mit Munc- 18-WT,-D34N und-R39C charakterisiert wurde. Mint1 ist ein synaptisches Multidomänen-Protein mit Phosphotyrosin-Bindungsdomänen sowie PDZ-Domänen, die die Interaktion mit weiteren präsynaptischen Proteinen vermitteln und Mint1 somit in die vielfältigen Protein-Interaktionen der Präsynapse einbetten. Die Beobachtung, daß bei gleichzeitiger Anwesenheit von Syntaxin1 und Mint1 die D34N-Mutante und die R39C-Mutante unterschiedliche Proteininteraktionen bevorzugten (Mint1/Munc-18-Komplex, bzw. Munc-18/Syntaxin1-Komplex), führte zu der Hypothese, daß der stimulatorische Effekt der D34N-Mutante durch die beobachtete gehäuft auftretende Interaktion mit Mint1 verursacht wird. Eine elektrophysiologische Charakterisierung des Mint1-Proteins in PC12-Zellen zeigte, daß Mint1 eine Inhibition der Exozytose verursacht. Die stimulierende Wirkung der D34N-Mutante könnte somit auf eine vermehrte Interaktion mit Mint1 zurückzuführen sein und eine Disinhibition darstellen. Die R39C-Mutante entfaltete ihre inhibitorische Wirkung vermutlich über die abgeschwächte Syntaxin1-Bindung. Zusammengefaßt hat Munc-18-1 eine positive Funktion in der LDCV-Exozytose. Zudem beschränkt sich die Rolle von Munc-18-1 nicht auf seine Interaktion mit Syntaxin1. Munc-18-1 ist über die Interaktion mit Mint1 vermutlich in vielfältige präsynaptische Komplexe involviert und könnte während der Membranfusion ein entscheidendes Bindeglied zwischen der Membranfusionsmaschinerie und strukturgebenden Komponenten der Präsynapse darstellen

Dual role for CXCL12 signaling in semilunar valve development

Summary: Cxcl12-null embryos have dysplastic, misaligned, and hyperplastic semilunar valves (SLVs). In this study, we show that CXCL12 signaling via its receptor CXCR4 fulfills distinct roles at different stages of SLV development, acting initially as a guidance cue to pattern cellular distribution within the valve primordia during the endocardial-to-mesenchymal transition (endoMT) phase and later regulating mesenchymal cell proliferation during SLV remodeling. Transient, anteriorly localized puncta of internalized CXCR4 are observed in cells undergoing endoMT. In vitro, CXCR4+ cell orientation in response to CXCL12 requires phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling and is inhibited by suppression of endocytosis. This dynamic intracellular localization of CXCR4 during SLV development is related to CXCL12 availability, potentially enabling activation of divergent downstream signaling pathways at key developmental stages. Importantly, Cxcr7-/- mutants display evidence of excessive CXCL12 signaling, indicating a likely role for atypical chemokine receptor CXCR7 in regulating ligand bioavailability and thus CXCR4 signaling output during SLV morphogenesis

CXCR7 prevents excessive CXCL12-mediated downregulation of CXCR4 in migrating cortical interneurons

The CXCL12/CXCR4 signaling pathway is involved in the development of numerous neuronal and non-neuronal structures. Recent work established that the atypical second CXCL12 receptor, CXCR7, is essential for the proper migration of interneuron precursors in the developing cerebral cortex. Two CXCR7-mediated functions were proposed in this process: direct modulation of β-arrestin-mediated signaling cascades and CXCL12 scavenging to regulate local chemokine availability and ensure responsiveness of the CXCL12/CXCR4 pathway in interneurons. Neither of these functions has been proven in the embryonic brain. Here, we demonstrate that migrating interneurons efficiently sequester CXCL12 through CXCR7. CXCR7 ablation causes excessive phosphorylation and downregulation of CXCR4 throughout the cortex in mice expressing CXCL12, but not in CXCL12-deficient animals. Cxcl12−/− mice lack activated CXCR4 in embryonic brain lysates and display a similar interneuron positioning defect as Cxcr4−/−, Cxcr7−/− and Cxcl12−/−;Cxcr7−/− animals. Thus, CXCL12 is the only CXCR4-activating ligand in the embryonic brain and deletion of one of the CXCL12 receptors is sufficient to generate a migration phenotype that corresponds to the CXCL12-deficient pathway. Our findings imply that interfering with the CXCL12-scavenging activity of CXCR7 causes loss of CXCR4 function as a consequence of excessive CXCL12-mediated CXCR4 activation and degradation

Definition of Estrogen Receptor Pathway Critical for Estrogen Positive Feedback to Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons and Fertility

SummaryThe mechanisms through which estrogen regulates gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons to control mammalian ovulation are unknown. We found that estrogen positive feedback to generate the preovulatory gonadotropin surge was normal in estrogen receptor β knockout (ERβ) mutant mice, but absent in ERα mutant mice. An ERα-selective compound was sufficient to generate positive feedback in wild-type mice. As GnRH neurons do not express ERα, estrogen positive feedback upon GnRH neurons must be indirect in nature. To establish the cell type responsible, we generated a neuron-specific ERα mutant mouse line. These mice failed to exhibit estrogen positive feedback, demonstrating that neurons expressing ERα are critical. We then used a GnRH neuron-specific Pseudorabies virus (PRV) tracing approach to show that the ERα-expressing neurons innervating GnRH neurons are located within rostral periventricular regions of the hypothalamus. These studies demonstrate that ovulation is driven by estrogen actions upon ERα-expressing neuronal afferents to GnRH neurons

eIF4G stimulates the activity of the DEAD box protein eIF4A by a conformational guidance mechanism

The activity of eIF4A, a key player in translation initiation, is regulated by other translation factors through currently unknown mechanisms. Here, we provide the necessary framework to understand the mechanism of eIF4A’s regulation by eIF4G. In solution, eIF4A adopts a defined conformation that is different from the crystal structure. Binding of eIF4G induces a ‘half-open’ conformation by interactions with both domains, such that the helicase motifs are pre-aligned for activation. A primary interface acts as an anchor for complex formation. We show here that formation of the secondary interface is essential for imposing the ‘half-open’ conformation on eIF4A, and it is critical for the functional interaction of eIF4G with eIF4A. Via this bipartite interaction, eIF4G guides the transition of eIF4A between the ‘half-open’ and closed conformations, and stimulates its activity by accelerating the rate-limiting step of phosphate release. Subtle changes induced by eIF4G may be amplified by input signals from other translation factors, leading to an efficient regulation of translation initiation

Die Funktion von Munc-18 in der Exozytose sekretorischer Granulen

Die Calcium-abhängige Freisetzung von Neurotransmitter aus sekretorischen Organellen wird durch eine Reihe konservierter Proteinfamilien präzise reguliert. Hierzu zählen u.a. SNARE-Proteine (soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein attachment protein (SNAP) receptor ), Rab-GTPasen und SM-Proteine. SNARE-Proteine sind membranständige Proteine, deren gemeinsames Merkmal das 60-70 Aminosäuren umfassende SNARE-Motiv ist. SNARE-Proteine können sich spontan und irreversibel zu einem Vier-Helix-Bündel („core complex“) zusammenlagern. Die Komplexbildung zwischen SNAREs auf Vesikelmembran und Plasmamembran führt zu einer Verkürzung der Proteine. Hierdurch werden die Membranen einander angenähert, was die Voraussetzung für die Membranfusion darstellt. Die funktionelle Bedeutung von SNARE-Proteinen für die Membranfusion wird durch die Vergiftung von Zellen mit den clostridialen Neurotoxinen Tetanustoxin und Botulinustoxin deutlich, die einzelne SNAREs proteolytisch spalten und die Neurotransmission hemmen. Das synaptische SM-Protein Munc-18-1 bindet hochaffin an das SNARE-Protein Syntaxin1. Hierbei konkurriert die Bindung von Munc-18-1 an Syntaxin1 mit dessen Einbindung in den „core complex“. Dies führte zu einem Modell, demzufolge Munc-18-1 durch seine Bindung an Syntaxin1 eine inhibitorische Rolle in der Exozytose übernimmt. Eine rein inhibitorische Funktion von Munc-18-1 läßt sich jedoch nicht mit seinem essentiellen Charakter für die Membranfusion in allen Spezies vereinbaren. Diese zentrale Rolle des Proteins im Membranfusionsvorgang ist jedoch weitgehend unverstanden. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung der Interaktion zwischen Munc-18-1 und Syntaxin1 für die Exozytose von sekretorischen Granulen neuroendokriner Zellen in einem kombinierten Ansatz aus biochemischen und elektrophysiologischen Methoden untersucht. Die Interaktion zwischen Syntaxin1 und Munc-18-1 wurde gestört, indem zum einen Munc-18-1 überexprimiert wurde und zum andern in die Syntaxin1-Bindungsregion des Munc-18-1-Moleküls Punktmutationen eingeführt wurden (D34N und R39C). Nach der biochemischen Dokumentation der Störung der Syntaxin1-Bindung wurden die Mutanten sowie das Wildtyp- (WT-) Protein in der neuroendokrinen Zellinie PC12 überexprimiert und die Folgen der Überexpression mit Hilfe der Kohlefaser-Amperometrie elektrophysiologisch charakterisiert. Die Überexpression des Munc-18-WT-Proteins hatte keinen Effekt, was eine inhibitorische Funktion des Proteins unwahrscheinlich macht. Die R39C-Mutante wies eine gewisse Restbindung an Syntaxin1 auf, wohingegen die Bindung der D34N-Mutante an Syntaxin1 vernachlässigbar war. Trotz dieser gleichsinnig veränderten Syntaxin1-Bindung hatten die Mutanten gegensätzliche Effekte auf die Häufigkeit exozytotischer Ereignisse: die Zahl exozytotischer Ereignisse war durch R39C vermindert und durch D34N erhöht. Dies wies auf die Beteiligung eines weiteren Munc-18-1-Bindungspartners an den beobachteten Effekten hin, woraufhin die Interaktion von Mint1 mit Munc- 18-WT,-D34N und-R39C charakterisiert wurde. Mint1 ist ein synaptisches Multidomänen-Protein mit Phosphotyrosin-Bindungsdomänen sowie PDZ-Domänen, die die Interaktion mit weiteren präsynaptischen Proteinen vermitteln und Mint1 somit in die vielfältigen Protein-Interaktionen der Präsynapse einbetten. Die Beobachtung, daß bei gleichzeitiger Anwesenheit von Syntaxin1 und Mint1 die D34N-Mutante und die R39C-Mutante unterschiedliche Proteininteraktionen bevorzugten (Mint1/Munc-18-Komplex, bzw. Munc-18/Syntaxin1-Komplex), führte zu der Hypothese, daß der stimulatorische Effekt der D34N-Mutante durch die beobachtete gehäuft auftretende Interaktion mit Mint1 verursacht wird. Eine elektrophysiologische Charakterisierung des Mint1-Proteins in PC12-Zellen zeigte, daß Mint1 eine Inhibition der Exozytose verursacht. Die stimulierende Wirkung der D34N-Mutante könnte somit auf eine vermehrte Interaktion mit Mint1 zurückzuführen sein und eine Disinhibition darstellen. Die R39C-Mutante entfaltete ihre inhibitorische Wirkung vermutlich über die abgeschwächte Syntaxin1-Bindung. Zusammengefaßt hat Munc-18-1 eine positive Funktion in der LDCV-Exozytose. Zudem beschränkt sich die Rolle von Munc-18-1 nicht auf seine Interaktion mit Syntaxin1. Munc-18-1 ist über die Interaktion mit Mint1 vermutlich in vielfältige präsynaptische Komplexe involviert und könnte während der Membranfusion ein entscheidendes Bindeglied zwischen der Membranfusionsmaschinerie und strukturgebenden Komponenten der Präsynapse darstellen

Relações entre amamentação, inteligência e aproveitamento escolar : uma problematização a partir dos estudos de gênero

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Eltern

Killus D, Paseka A, Schütz P, Walther U, Wischer B, eds. Eltern. Friedrich-Jahresheft. Vol 35. Seelze: Friedrich; 2017

Tunable Phase Transitions in Conductive Cu(2,5-Dimethyl-Dicyanoquinonediimine)2\mathsf{_2} Radical Ion Salts

The conduction process of the copper salts of DCNQI and the origin of the phase transition inducable in different ways, is explained in this review by an admixture of the copper d states to the DCNQI p$\pi$ band. This admixture depends on structural processes which shift the charge transfer $\delta$ from the copper moiety to the DCNQI stack to larger values with reduced lattice dimensions. Reaching exactly $\delta = 4/3$ (band filling degree $\rho = 2/3$), the trimerization in the copper stack leads to the disproportion of the mixed valence state of Cu by the localization of the d states as Cu$^{2+}$. A charge density wave is formed, opening a gap at the Fermi level $E_{\rm F}$. These statements are acquired by selective deuteration, selective alloying, applying pressure and by simultaneous electron spin resonance (ESR) and conductivity experiments in the ESR equipment under pressure as a function of temperature. For all systems, when reaching critical values of the unit cell volume, phase transitions take place. We could establish a general phase diagram which is based on an effective pressure scale including internal (chemical) and external applied pressure