Epitranscriptomics of Ischemic Heart Disease—The IHD-EPITRAN Study Design and Objectives

Epitranscriptomic modifications in RNA can dramatically alter the way our genetic code is deciphered. Cells utilize these modifications not only to maintain physiological processes, but also to respond to extracellular cues and various stressors. Most often, adenosine residues in RNA are targeted, and result in modifications including methylation and deamination. Such modified residues as N-6-methyl-adenosine (m6A) and inosine, respectively, have been associated with cardiovascular diseases, and contribute to disease pathologies. The Ischemic Heart Disease Epitranscriptomics and Biomarkers (IHD-EPITRAN) study aims to provide a more comprehensive understanding to their nature and role in cardiovascular pathology. The study hypothesis is that pathological features of IHD are mirrored in the blood epitranscriptome. The IHD-EPITRAN study focuses on m6A and A-to-I modifications of RNA. Patients are recruited from four cohorts: (I) patients with IHD and myocardial infarction undergoing urgent revascularization; (II) patients with stable IHD undergoing coronary artery bypass grafting; (III) controls without coronary obstructions undergoing valve replacement due to aortic stenosis and (IV) controls with healthy coronaries verified by computed tomography. The abundance and distribution of m6A and A-to-I modifications in blood RNA are charted by quantitative and qualitative methods. Selected other modified nucleosides as well as IHD candidate protein and metabolic biomarkers are measured for reference. The results of the IHD-EPITRAN study can be expected to enable identification of epitranscriptomic IHD biomarker candidates and potential drug targets

Epitranscriptomics of Ischemic Heart Disease - The IHD-EPITRAN Study Design and Objectives

Epitranscriptomic modifications in RNA can dramatically alter the way our genetic code is deciphered. Cells utilize these modifications not only to maintain physiological processes, but also to respond to extracellular cues and various stressors. Most often, adenosine residues in RNA are targeted, and result in modifications including methylation and deamination. Such modified residues as N-6-methyl-adenosine (m(6)A) and inosine, respectively, have been associated with cardiovascular diseases, and contribute to disease pathologies. The Ischemic Heart Disease Epitranscriptomics and Biomarkers (IHD-EPITRAN) study aims to provide a more comprehensive understanding to their nature and role in cardiovascular pathology. The study hypothesis is that pathological features of IHD are mirrored in the blood epitranscriptome. The IHD-EPITRAN study focuses on m(6)A and A-to-I modifications of RNA. Patients are recruited from four cohorts: (I) patients with IHD and myocardial infarction undergoing urgent revascularization; (II) patients with stable IHD undergoing coronary artery bypass grafting; (III) controls without coronary obstructions undergoing valve replacement due to aortic stenosis and (IV) controls with healthy coronaries verified by computed tomography. The abundance and distribution of m(6)A and A-to-I modifications in blood RNA are charted by quantitative and qualitative methods. Selected other modified nucleosides as well as IHD candidate protein and metabolic biomarkers are measured for reference. The results of the IHD-EPITRAN study can be expected to enable identification of epitranscriptomic IHD biomarker candidates and potential drug targets.</p

Amplification and Overexpression of ERBB2, uPA, TRPS1, EIF3S3 and MYC Genes in Prostate Cancer

Eturauhassyöpä on miesten yleisin syöpämuoto Suomessa. Vuonna 2003 todettiin 4225 uutta eturauhassyöpätapausta. Eturauhassyöpä, kuten muutkin syövät, saavat alkunsa solun perimäaineksen, DNA:n muutoksista. Syövän synnyn kannalta merkittävimpiä ovat muutokset alueilla, joissa sijaitsee solun kasvua sääteleviä geenejä. Muutokset voivat joko heikentää ns. kasvurajoitegeenien toimintaa tai lisätä kasvua edistävien syöpägeenien toimintaa. DNA muutosten (esim. mutaatio tai monistuma) seurauksena solu voi saada kasvuedun, joka pahimmillaan johtaa syöpään. Geenin kopioluvun lisääntyminen (monistuminen) on yksi tavoista, jolla geenituotteen määrä voi kasvaa. Monistuneen geenin ollessa syöpägeeni, voi muutosten havaitsemisella olla merkitystä potilaan hoitoa suunniteltaessa. Tässä työssä tutkittiin viiden mahdollisen syöpägeenin (ERBB2, uPA, MYC, TRPS1 ja EIF3S3) monistumien ja ilmentymisen vaikutusta eturauhassyövän kehitykseen ja etenemiseen. ERBB2-proteiinia vastaan kehitetyllä vasta-aineella on saatu hyviä tuloksia hoidettaessa rintasyöpäpotilaita, joilla ERBB2 geeni on monistunut. Osatyössä I tutkimme ERBB2-monistuman yleisyyttä eturauhassyöpäpotilailta ja sen yhteyttä ERBB2-proteiinin määrään. Tutkituista näytteistä ainoastaan yhdessä ERBB2 geeni oli monistunut, mutta yhdessäkään näytteessä geenituotteen määrä ei ollut koholla. Onkin epätodennäköistä, että rintasyövässä käytetty hoito olisi tehokas eturauhassyövän hoidossa. Solujen kyvyllä tunkeutua ympäröiviin kudoksiin on suuri merkitys syövän leviämisen kannalta. Estämällä tunkeutuminen on mahdollista hidastaa tai jopa pysäyttää syövän leviäminen. Osatyössä II tutkittiin uPA-geenin kopiolukumuutoksia eturauhassyövässä, sekä uPA-proteiinin estämisen vaikutusta eturauhassyöpäsolujen tunkeutumiskykyyn. Tulokset osoittivat, uPA-geenin olevan koholla noin 20-30%:ssa tutkituista potilasnäytteistä. Soluviljelmillä tehdyissä kokeissa huomattiin, että tietyillä uPA-proteiiniin vaikuttavilla aineilla (uPA-inhibiittorit) voidaan vaikuttaa eturauhassyöpäsoluihin, joissa uPA-geenin kopiolukumäärä on koholla. Osatyössä III tutkittiin MYC, TRPS1 ja EIF3S3 -geenien kopiolukuja ja ilmentymistä solulinjoissa ja potilasnäytteissä. Ainoastaan EIF3S3-geenin ilmentyminen oli koholla syöpänäytteissä. Myös rintasyöpäsolulinjassa, jossa oli korkein kopioluku kaikista kolmesta geenistä, vain EIF3S3:n ilmentyminen oli koholla. Tulokset osoittavat EIF3S3 geenin monistuman olevan yksi, muttei ainoa, geenin kohonneen ilmentymisen taustalla olevista mekanismeista. Osatyössä IV tutkittiin kohonneen EIF3S3:n ilmentymisen vaikutusta solujen kasvuun. Kohonnut EIF3S3:n ilmentyminen vaikutti positiivisesti solujen kasvuun, kun taas EIF3S3:n ilmentymisen esto hidasti solujen kasvua. Tulokset osoittavat EIF3S3:n osallistuvan solujen kasvun säätelyyn, mutta sen kohonnut ilmentyminen ei yksinään pysty muuttamaan soluja pahanlaatuisiksi. Yhteenvetona voidaan sanoa, että uPA ­ geenin kopiolukumuutoksien määrittämisellä saattaa olla kliinistä arvoa, jos löydetään potilaskäyttöön soveltuvan uPA-inhibiittori. Lisäksi tulokset osoittavat EIF3S3 ­ geenin osallisuuden eturauhassyövän synnyssä ja etenemisessä. Jatkotutkimuksissa keskitymme selvittämään erityisesti EIF3S3:n toimintaa eturauhassyövässä.Genetic alterations, including activation of proto-oncogenes and inactivation of tumor suppressor genes, are involved in transforming benign cells into malignant ones. In this study we wanted to investigate the role of five possible oncogenes, ERBB2, uPA, TRPS1, EIF3S3 and MYC in the development and progression of prostate cancer. ERBB2 gene copy number and expression was analyzed in both androgen- dependent primary and metastatic tumors, as well as recurrent hormone-refractory tumors. Using chromogenic in situ hybridization only one borderline amplification of ERBB2 (6-8 copies) was found in the prostate tumors studied. Immunohistochemical staining of ERBB2 protein was negative in all prostate samples, including the sample with the borderline amplification of ERBB2 gene. The expression level of ERBB2 mRNA in prostate tumors as well as in prostate cell lines was analyzed using real-time quantitative RT-PCR (Q-RT-PCR). No differences in the expression levels between tumor types were found, and the expression levels in prostate cancer corresponded to levels in breast carcinomas without ERBB2 amplification. The data suggest that the expression of ERBB2 is low in prostate cancer, regardless of the stage. Thus, it is unlikely that therapies based on overexpression of the ERBB2 gene will be effective in the treatment of prostate cancer. Hormone-refractory metastases and locally recurrent hormone-refractory tumors from patients who died of prostate cancer were analyzed for uPA gene copy number by using fluorescence in situ hybridization. Increased copy number but no high-level amplifications, of uPA was found in 21% of the locally recurrent hormone-refractory tumors. 31% of metastases showed increased copy number of uPA, and one case with a high-level amplification was also observed. The effect of uPA inhibitors on the invasion potential of prostate cancer cell lines was studied using Matrigel invasion assay. The data indicated that invasion of prostate cancer cells containing uPA amplification was inhibited with specific uPA inhibitors (p-aminobentzamidine and B428), whereas this was not the case in cells without amplification. To identify the target gene for the amplification on 8q, 3 candidate genes, TRPS1, EIF3S3, and MYC, were studied. All 3 genes were found co-amplified in about 30% of hormone-refractory prostate carcinoma tumors, analyzed by FISH. Copy number and mRNA expression (by Q-RT-PCR) of TRPS1, EIF3S3 and MYC genes were also analyzed in breast and prostate cancer cell lines. Only EIF3S3 mRNA was overexpressed in SK-Br-3 breast cancer cell line, which contained the highest copy number of all three genes. Next, the expression levels of TRPS1, EIF3S3 and MYC mRNAs were analyzed in benign prostate hyperplasia (BPH), untreated and hormone-refractory prostate tumors. EIF3S3 mRNA expression was higher in prostate carcinomas compared to BPH, but TRPS1 and MYC mRNA levels were similar in all prostate tumor types. The data suggest that expression of EIF3S3 mRNA is increased in prostate cancer, and gene amplification seems to be one mechanism for the overexpression. Finally, the effect of EIF3S3 overexpression on cell growth was studied in NIH 3T3 murine fibroblasts using pTet-Off expression system. Overexpression had a positive effect on growth rate and survival in soft agar. The effect of EIF3S3 inhibition was studied in prostate and breast cancer cell lines using the siRNA method. After four days, the reduction in cell growth was significant in all four cell lines. The results imply that EIF3S3 has a significant role in regulating cell growth, and its overexpression may give rise to improved cancer cell survival

Tutkimus työturvallisuudesta KerabitPro Oy:ssä

Opinnäytetyössä tutkittiin työturvallisuuden tasoa erityisesti yrityksen pää-urakoimilla työmailla. Tutkimus tehtiin eri puolella Suomea 5:llä eri alueella. Turvallisuustason mittaukseen käytettiin talonrakennus eli TR-mittausta, koska se on yrityksessä muutoinkin käytössä. Tämä mahdollisti tulosten vertailun yrityksen sisäisiin mittauksiin. Tutkimus tehtiin loka-marraskuun 2012 aikana ja siinä käytiin läpi yhteensä 25 työmaata. Kokonaisuutena työturvallisuuden taso oli hyvä, mutta poikkeuksiakin joukossa oli. Varsinkin aliurakoitsijoiden työntekijöiden henkilösuojainten käyttö oli puutteellista ja joillakin työmailla tilaaja ei ollut toteuttanut putoamissuojausta määräysten mukaan. Pääkaupunkiseudun työmailla oli paljon vanhentuneilla päiväyksillä varustettuja sammuttimia. Yhtään viallista konetta tai tulitöissä käytettävää työkalua ei havaittu. Saadut tulokset olivat hieman huonommat kuin yrityksen itsensä tekemissä mittauksissa. Tutkimuksen pieni otanta ja käynti vain osassa yrityksen toimipisteistä saattaa selittää saadun tuloksen (85 %). Korjattavaa kuitenkin on ja vastaavia mittauksia kannattaisi tehdä tulevaisuudessakin. Lisäksi henkilöstö voisi käydä tutustumassa toisen alueen toimintaan ja sitä kautta havainnoida parannustarpeita. Ainakin tiedon pitää kulkea paremmin tulevaisuudessa, jotta mahdolliset epäkohdat voitaisiin korjata. Työntekijöiden ja toimihenkilöiden pitää uskaltaa kieltäytyä työskentelemästä, kunnes työ voidaan tehdä turvallisesti.The thesis researched the level of work safety on sites in which the company KerabitPro Ltd was the main contractor. The study was conducted in five different areas around Finland. In the safety assessment a house building indicator TR was used as it is in everyday use in the company. This also enabled the comparison of the results to their previous findings. The research was carried out during October and November as 25 worksites were visited. In general, the working conditions were safe but some exceptions were, however, detected. Especially subcontractor workers’ personal protective equipment was inadequate and on some worksites the regulations regarding falling protection were not met. Moreover, in the capital region several expired fire extinguishers were found. Conversely, no faulty machinery or tools used in hot work were detected. The results were slightly lower than those made by the company itself. Limited samplings and visits to only few offices may explain the result (85%). The concerning points are suggested to be fixed and naturally it would be advisable to carry out similar measurements in the future. Furthermore, personnel could explore the functions of other company offices to find safety aspects to be improved on their own sites. In order to eliminate flaws at least information flow must be more efficient in the future. Workers and clerical workers must have the courage to decline from work until safety is guaranteed

Amplification and Overexpression of ERBB2, uPA, TRPS1, EIF3S3 and MYC Genes in Prostate Cancer

Eturauhassyöpä on miesten yleisin syöpämuoto Suomessa. Vuonna 2003 todettiin 4225 uutta eturauhassyöpätapausta. Eturauhassyöpä, kuten muutkin syövät, saavat alkunsa solun perimäaineksen, DNA:n muutoksista. Syövän synnyn kannalta merkittävimpiä ovat muutokset alueilla, joissa sijaitsee solun kasvua sääteleviä geenejä. Muutokset voivat joko heikentää ns. kasvurajoitegeenien toimintaa tai lisätä kasvua edistävien syöpägeenien toimintaa. DNA muutosten (esim. mutaatio tai monistuma) seurauksena solu voi saada kasvuedun, joka pahimmillaan johtaa syöpään. Geenin kopioluvun lisääntyminen (monistuminen) on yksi tavoista, jolla geenituotteen määrä voi kasvaa. Monistuneen geenin ollessa syöpägeeni, voi muutosten havaitsemisella olla merkitystä potilaan hoitoa suunniteltaessa. Tässä työssä tutkittiin viiden mahdollisen syöpägeenin (ERBB2, uPA, MYC, TRPS1 ja EIF3S3) monistumien ja ilmentymisen vaikutusta eturauhassyövän kehitykseen ja etenemiseen. ERBB2-proteiinia vastaan kehitetyllä vasta-aineella on saatu hyviä tuloksia hoidettaessa rintasyöpäpotilaita, joilla ERBB2 geeni on monistunut. Osatyössä I tutkimme ERBB2-monistuman yleisyyttä eturauhassyöpäpotilailta ja sen yhteyttä ERBB2-proteiinin määrään. Tutkituista näytteistä ainoastaan yhdessä ERBB2 geeni oli monistunut, mutta yhdessäkään näytteessä geenituotteen määrä ei ollut koholla. Onkin epätodennäköistä, että rintasyövässä käytetty hoito olisi tehokas eturauhassyövän hoidossa. Solujen kyvyllä tunkeutua ympäröiviin kudoksiin on suuri merkitys syövän leviämisen kannalta. Estämällä tunkeutuminen on mahdollista hidastaa tai jopa pysäyttää syövän leviäminen. Osatyössä II tutkittiin uPA-geenin kopiolukumuutoksia eturauhassyövässä, sekä uPA-proteiinin estämisen vaikutusta eturauhassyöpäsolujen tunkeutumiskykyyn. Tulokset osoittivat, uPA-geenin olevan koholla noin 20-30%:ssa tutkituista potilasnäytteistä. Soluviljelmillä tehdyissä kokeissa huomattiin, että tietyillä uPA-proteiiniin vaikuttavilla aineilla (uPA-inhibiittorit) voidaan vaikuttaa eturauhassyöpäsoluihin, joissa uPA-geenin kopiolukumäärä on koholla. Osatyössä III tutkittiin MYC, TRPS1 ja EIF3S3 -geenien kopiolukuja ja ilmentymistä solulinjoissa ja potilasnäytteissä. Ainoastaan EIF3S3-geenin ilmentyminen oli koholla syöpänäytteissä. Myös rintasyöpäsolulinjassa, jossa oli korkein kopioluku kaikista kolmesta geenistä, vain EIF3S3:n ilmentyminen oli koholla. Tulokset osoittavat EIF3S3 geenin monistuman olevan yksi, muttei ainoa, geenin kohonneen ilmentymisen taustalla olevista mekanismeista. Osatyössä IV tutkittiin kohonneen EIF3S3:n ilmentymisen vaikutusta solujen kasvuun. Kohonnut EIF3S3:n ilmentyminen vaikutti positiivisesti solujen kasvuun, kun taas EIF3S3:n ilmentymisen esto hidasti solujen kasvua. Tulokset osoittavat EIF3S3:n osallistuvan solujen kasvun säätelyyn, mutta sen kohonnut ilmentyminen ei yksinään pysty muuttamaan soluja pahanlaatuisiksi. Yhteenvetona voidaan sanoa, että uPA ­ geenin kopiolukumuutoksien määrittämisellä saattaa olla kliinistä arvoa, jos löydetään potilaskäyttöön soveltuvan uPA-inhibiittori. Lisäksi tulokset osoittavat EIF3S3 ­ geenin osallisuuden eturauhassyövän synnyssä ja etenemisessä. Jatkotutkimuksissa keskitymme selvittämään erityisesti EIF3S3:n toimintaa eturauhassyövässä.Genetic alterations, including activation of proto-oncogenes and inactivation of tumor suppressor genes, are involved in transforming benign cells into malignant ones. In this study we wanted to investigate the role of five possible oncogenes, ERBB2, uPA, TRPS1, EIF3S3 and MYC in the development and progression of prostate cancer. ERBB2 gene copy number and expression was analyzed in both androgen- dependent primary and metastatic tumors, as well as recurrent hormone-refractory tumors. Using chromogenic in situ hybridization only one borderline amplification of ERBB2 (6-8 copies) was found in the prostate tumors studied. Immunohistochemical staining of ERBB2 protein was negative in all prostate samples, including the sample with the borderline amplification of ERBB2 gene. The expression level of ERBB2 mRNA in prostate tumors as well as in prostate cell lines was analyzed using real-time quantitative RT-PCR (Q-RT-PCR). No differences in the expression levels between tumor types were found, and the expression levels in prostate cancer corresponded to levels in breast carcinomas without ERBB2 amplification. The data suggest that the expression of ERBB2 is low in prostate cancer, regardless of the stage. Thus, it is unlikely that therapies based on overexpression of the ERBB2 gene will be effective in the treatment of prostate cancer. Hormone-refractory metastases and locally recurrent hormone-refractory tumors from patients who died of prostate cancer were analyzed for uPA gene copy number by using fluorescence in situ hybridization. Increased copy number but no high-level amplifications, of uPA was found in 21% of the locally recurrent hormone-refractory tumors. 31% of metastases showed increased copy number of uPA, and one case with a high-level amplification was also observed. The effect of uPA inhibitors on the invasion potential of prostate cancer cell lines was studied using Matrigel invasion assay. The data indicated that invasion of prostate cancer cells containing uPA amplification was inhibited with specific uPA inhibitors (p-aminobentzamidine and B428), whereas this was not the case in cells without amplification. To identify the target gene for the amplification on 8q, 3 candidate genes, TRPS1, EIF3S3, and MYC, were studied. All 3 genes were found co-amplified in about 30% of hormone-refractory prostate carcinoma tumors, analyzed by FISH. Copy number and mRNA expression (by Q-RT-PCR) of TRPS1, EIF3S3 and MYC genes were also analyzed in breast and prostate cancer cell lines. Only EIF3S3 mRNA was overexpressed in SK-Br-3 breast cancer cell line, which contained the highest copy number of all three genes. Next, the expression levels of TRPS1, EIF3S3 and MYC mRNAs were analyzed in benign prostate hyperplasia (BPH), untreated and hormone-refractory prostate tumors. EIF3S3 mRNA expression was higher in prostate carcinomas compared to BPH, but TRPS1 and MYC mRNA levels were similar in all prostate tumor types. The data suggest that expression of EIF3S3 mRNA is increased in prostate cancer, and gene amplification seems to be one mechanism for the overexpression. Finally, the effect of EIF3S3 overexpression on cell growth was studied in NIH 3T3 murine fibroblasts using pTet-Off expression system. Overexpression had a positive effect on growth rate and survival in soft agar. The effect of EIF3S3 inhibition was studied in prostate and breast cancer cell lines using the siRNA method. After four days, the reduction in cell growth was significant in all four cell lines. The results imply that EIF3S3 has a significant role in regulating cell growth, and its overexpression may give rise to improved cancer cell survival