A importância dos conhecimentos e dos modos de vida locais no desenvolvimento sustentável : estudo exploratório sobre o impacto da Reserva Natural das Ilhas Berlengas na comunidade piscatória

Neste trabalho apresenta-se um estudo exploratório sobre o impacto da Reserva Natural das Ilhas Berlengas (RNB) nos modos de vida locais, em particular na comunidade piscatória, evidenciando as suas racionalidades leigas (percepções, práticas e representações). Procuramos conhecer as dimensões das interações culturais, sociais e económicas das populações locais com a reserva, parte fundamental da estratégia de conservação da biodiversidade e do desenvolvimento sustentável. Partindo de uma metodologia qualitativa, assente em entrevistas exploratórias em profundidade a informantes privilegiados da comunidade piscatória e a técnicos que tenham estado no processo de implementação e de gestão da reserva, procuramos os sentidos e os significados construídos na interação com a implementação do estatuto de reserva e a percepção dos seus impactos ambientais, sociais e culturais, com vista a construir e validar instrumentos que nos permitam amplificar este estudo inicial. Na construção dos guiões das entrevistas, previu-se uma análise comparativa entre o estado imediatamente anterior à consagração do estatuto da reserva e a situação presente. Embora partindo de uma amostra reduzida dos atores sociais em presença, os testemunhos recolhidos sobre a RNB nas suas diversas facetas e impactos, demonstraram formas de ver e pensar diferenciadas entre a população local e os técnicos. Os atuais ou antigos pescadores, identificaram a constituição da reserva como uma dificuldade suplementar para o exercício da atividade piscatória em Peniche e principalmente na área demarcada pela RNB, em comparação com a situação na época imediatamente anterior à sua formação. Por seu lado, todos os técnicos entrevistados consideraram a RNB um valor ambientalmente vulnerável mas de grande importância para o presente e para o futuro da região e do país. Este trabalho tenta responder à escassez de estudos sobre os desafios e ganhos em bem-estar para as populações locais comparativamente a uma longa investigação existente sobre os benefícios ecológicos das Reservas na preservação da biodiversidade e na gestão sustentável dos seus recursos naturais.This paper describes an exploratory study done by a multi-disciplinary group of researchers on the impact of the Natural Reserve of the Berlengas Islands on the way of life of its local inhabitants, more specifically on its local fishing community, as evidenced by its conceptions and representations. The study aims to analyse the cultural, social and economic interactions between the reserve and the local population, being a fundamental element of the biodiversity conservation and sustainable management strategy. Using a qualitative methodology based on exploratory interviews with privileged informants within the fishing community and technicians involved in the implementation and management processes of the reserve, we set out to find the meanings constructed in interaction with the implementation of the reserve status and their environmental, social and cultural impact. In developing the interview scripts, we focused on a comparative analysis between the state immediately before and after the attribution of reserve status. Despite being based on a small sample, the collected data on the NRB revealed differences in perspective and thought between the local population and the technicians. Current and former fishermen identified the creation of the reserve as a further complication to the fishing industry in Peniche, especially in the area demarcated by the NRB. Another view, however, is held by the interviewed technicians, who consider the NRB to be an important, albeit environmentally vulnerable, factor to the present and future development of the region. While there have been many studies pertaining to the ecological benefits of reserves on the preservation of biodiversity and sustainability management of their natural resources, this study has as its focus the less researched area of the welfare challenges and gains of reserves on the local population

Indigenous yeasts in Madeira wines: impact on the physicochemical and sensorial characterization

O Vinho Madeira é produzido pela fermentação espontânea através de leveduras indígenas presentes em uvas e adegas. A crescente exigência dos consumidores leva à necessidade de uniformizar o processo de vinificação. O presente trabalho visa avaliar a composição química de vinhos Madeira produzidos em diferentes adegas e com uvas colhidas de diferentes localizações (sul e norte). Depois, isolar e identificar as leveduras indígenas de mostos da casta Tinta Negra de diferentes localizações e adegas, e avaliar o impacto do uso de 5 leveduras indígenas não-Saccharomyces selecionadas (Hanseniaspora uvarum, Starmerella bacillaris, Pichia terricola, Pichia fermentans e Pichia kluyveri) na produção de vinho Madeira, como culturas puras iniciadoras, na composição química, perfil volátil e características sensoriais. Os resultados mostraram variabilibidade na composição química nas diferentes adegas, e baixa reprodutibilidade entre lotes da mesma adega. Uvas da região sul apresentaram níveis mais elevados de açúcares (196.32 g/L), polifenóis totais (270.18 mg GAE/L) e potencial antioxidante (128.48 mg Trolox/L). Os estudos da microflora de leveduas indígenas envolvidas na produção de vinho Madeira permitiram identificar 11 espécies nas adegas (Hanseniaspora uvarum, Starmerella bacillaris, Pichia kluyveri, Pichia fermentans, Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora delbrueckii, Candida apicola, Cystobasidium minutum, Pichia terricola, Cystobasidium slooffiae, e Wicheramomyces anolalus) e 6 espécies nas uvas (Hanseniaspora uvarum, Starmerella bacillaris, Pichia kluyveri, Pichia fermentans, Saccharomyces cerevisiae, and Hanseniaspora opuntiae). Os vinhos produzidos por Pichia spp. demonstraram níveis mais elevados de polifenóis totais (367.68 mg GAE/L), enquanto os vinhos produzidos por Starmerella bacillaris demonstraram maior acidez (9.23 g/L) e menor conteúdo de voláteis (11.26%). O vinho produzido por Pichia kluyveri destacou-se na concentração total de volatéis (24.50%), dos quais 77.35% são estéres, obtendo 37% de preferência dos consumidores, com notas intensas de caramelo e especiarias. Portanto, Pichia kluyveri demonstrou potencial para ser utilizada como cultura iniciadora de fermentação na produção de vinho Madeira.Madeira wines are produced by spontaneous fermentation with indigenous yeasts from grapes and wineries. Increasing demands from consumers have led to the need to standardize the winemaking process. This work aims, first, to evaluate the chemical composition of Madeira wines produced by different wineries and with grapes from vineyards located in the south and north regions. Then, to isolate and identify indigenous yeasts in Tinta Negra grape musts from different vineyard locations and wineries and evaluate the impact of using five selected indigenous non-Saccharomyces yeasts (Hanseniaspora uvarum, Starmerella bacillaris, Pichia terricola, Pichia fermentans, and Pichia kluyveri), as a starter culture, in the chemical composition, volatile profile, and sensory characteristics of Madeira wines. Results showed variability in the chemical composition of samples from different wineries and a lack of reproducibility between batches from the same winery. Grapes from southern vineyard locations presented higher levels of sugars (196.32 g/L), total phenolic content (270.18 mg GAE/L), and antioxidant potential (128.48 mg Trolox/L). Studies about the indigenous yeasts involved in Madeira wine production identified 11 yeast species from wineries (Hanseniaspora uvarum, Starmerella bacillaris, Pichia kluyveri, Pichia fermentans, Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora delbrueckii, Candida apicola, Cystobasidium minutum, Pichia terricola, Cystobasidium slooffiae, and Wicheramomyces anolalus) and 6 yeast species from vineyards (Hanseniaspora uvarum, Starmerella bacillaris, Pichia kluyveri, Pichia fermentans, Saccharomyces cerevisiae, and Hanseniaspora opuntiae). Wines produced by Pichia spp. showed higher total phenolic content (367.68 mg GAE/L), while wines produced by Starmerella bacillaris showed higher acidity (9.23g/L) and lower volatile content (11.26%). Wines produced by Pichia kluyveri revealed higher total volatile content (24.50%), of which 77.35% were esters, and a score of 37% in a preference test by regular wine consumers, described with intense caramel and spicy notes. Therefore, Pichia kluyveri showed potential to be used as a starter culture in the production of Madeira wines

The importance of the Portuguese as a host language in the integration of immigrants and refugees at the Federal Institute of Brasilia – IFB

As sociedades contemporâneas são marcadas pela diversidade, pela heterogeneidade e complexidade das relações. Atravessadas pela intensidade dos fluxos migratórios, as instituições educativas, enquanto espaços democráticos para o exercício da cidadania, devem atender à multiplicidade de origens geográficas dos seus estudantes e às diferenças sociais, culturais e étnicas que os caraterizam. Assim, a presente pesquisa, enquadrada no domínio da Educação Social, foi realizada no Instituto Federal de Brasília (IFB), considerando os desafios que se colocam às instituições educativas com a chegada de alunos imigrantes e refugiados, cuja integração educacional e social é preciso promover. A pesquisa realizada corresponde a um estudo exploratório, com recurso às metodologias qualitativas através da técnica de entrevistas. Foram entrevistados alunos matriculados em diferentes cursos do IFB, oriundos de diversos países como Nigéria, Peru, Guiné Bissau, Venezuela e Paraguai. Além das entrevistas com os alunos, foram realizadas entrevistas com representantes de instituições públicas e da sociedade civil que já desenvolvem trabalho na integração de imigrantes e refugiados. A partir da análise da informação levantada, identificámos áreas-problema significativas, passíveis de intervenção por parte do Educador Social, nomeadamente no que respeita à aprendizagem da língua e da cultura do país de acolhimento. Esta questão é percebida pelos alunos imigrantes e refugiados entrevistados como de total importância na sua inclusão social e profissional, para a promoção da igualdade de oportunidades e contribuindo para o pleno exercício de cidadania.Contemporary societies are marked by diversity, the heterogeneity and complexity of relationships. Crossed by the intensity of migratory flows, educational institutions, as democratic spaces for the exercise of citizenship, must attend to the multiplicity of geographical origins of their students and to the social, cultural and ethnic differences that characterize them. Thus, the present research in the field of Social Education was carried out at the Federal Institute of Brasília (IFB), considering the challenges faced by educational institutions with the arrival of immigrant and refugee students whose educational and social integration must be promoted. The research corresponds to an exploratory study, using qualitative methodologies through interviews technique. We interviewed students enrolled in IFB courses from different countries such as Nigeria, Peru, Guinea Bissau, Venezuela and Paraguay. In addition to interviews with students, interviews were conducted with representatives of public institutions and of the civil society who are already working on the integration of immigrants and refugees. Based on the analysis of the information collected, we identified significant problem areas that could be addressed by the Social Educator, particularly in relation to learning the language and culture of the host country. This issue is perceived by the immigrant and refugee students interviewed as of utmost importance in their social and professional inclusion, in order to promote equal opportunities and contribute to the full exercise of citizenship.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Efeito de duas intervenções de fisioterapia no alívio de dor e aumento da amplitude articular em doentes com Artrite Reumatóide - estudo comparativo

O estudo teve como objectivo comparar os efeitos de 2 intervenções de Fisioterapia: uma realizada em meio aquático (G1) e outra em meio terrestre (G2), quanto ao alívio da dor e aumento da amplitude articular (AA) dos membros superiores de doentes com Artrite Reumatóide. Foram seleccionados 30 participantes, 15 para cada grupo. Utilizouse a escala numérica da dor para avaliar a dor e o goniómetro universal para a AA. Os participantes foram avaliados antes de iniciarem fisioterapia e após 20 sessões realizadas. Não houveram diferenças entre os efeitos das intervenções, excepto em 2 movimentos articulares, nos quais o G1 apresentou melhores resultados. The aim of the study was to compare the effects of 2 Physiotherapy´s interventions: 1 performed in aquatic environment (G1) and other in terrestrial environment (G2), on pain relief and range of motion (RM) improvement of the upper limbs in Rheumatoid Arthritis patients. 30 participants were selected, 15 for each group. The pain was determined by the use of numerical rating pain scale and the RM by the universal goniometer, before and after 20 physiotherapy´s sessions. No significant differences were found between the effects of the interventions, except in 2 joint movements, in which the G1 present better results

A God looking for identity : Dionysius in Frogs

Em Ras, Aristófanes encarna no deus do teatro o propulsor de uma viagem, ao longo da qual Dioniso se debate com uma permanente indefiniçao de identidade: quem é este Dioniso errante, à procura de um fortalecimento que a ressurreiçao de um poeta representa? De resto, esta pergunta sobre a identidade de Dioniso nao se esgota dentro da mera estrutura cómica. Ela suscita uma questao que se estende à própria natureza ambigua ou múltipla do deus e que se reflecte no seu culto. Logo o ritual permite a reviravolta da normatidade da vida social: que a ordem sexual flutue, ou que a hierarquia de classes sofra uma inversao podem ser entendidas como faces especificas de urna festa que comporta principios essenciais de subversao e de questionamento.In the Frogs, Aristophanes gives to the god of theater the initiative of a trip, during which Dionysus faces a permanent problem of identity: who is this Dionysus looking for the power that a poet's resurrection represents? The question about Dionysus' identity doesn't find an answer within the play; it also puts under discussion the ambiguity of the god and his cult. The ritual allows changes on normal life: sexual order and social hierarchy may be subverted as part of a festival, where subversion and questioning are a priority

Knowledge and Power of the Civil Society: an empirical study of Brazilian professionals working in the NGOs

This study critically analyses the way Non-Governmental Organizations (NGOs) operate in Brazil and their contribution to the development of the Brazilian civil society. The notion of "power fields" and "habitus", proposed by Bourdieu (1989; 1996), provides the theoretical backdrop to our discussions. This focusses largely on the recursive connection between structure and agency which resonates with the work of Fligstein (2006). This study seeks to critically analyse the learning and social practice developed by professionals in NGOs in their daily activities. This study is based on qualitative research and the results indicated that the knowledge produced by Brazilian NGOs, through the recursive connection between the agents of the fields and the structures underpinning them, contributes to the expansion and transformation of the field in which they operate. This perspective shows that the knowledge generated by this NGOs give them a certain level of power and influence in the Brazilian civil society

Human vitreous proteome in vitreoretinal diseases

Vitreous, also termed vitreous body or vitreous humor, is a transparent fluid that fills the posterior cavity of the eye, surrounded by the neurosensorial retina, and lens. For a long time, the vitreous was not appreciated for its role in health and disease, and its function was thought to be merely structural. Nevertheless, the analysis of vitreous proteome has gained a growing interest in recent years. These studies proved that vitreous is highly complex and biologically more active than initially thought. As a matter of fact, changes in vitreous proteome reflect the physiological and pathological state of the eye, and, therefore, it is the ideal matrix for studying vitreoretinal diseases. Although the search for sensitive and specific vitreous biomarkers in ocular disease has not been successful so far, the analysis of vitreous proteome has been seen to be promising in elucidating some of the pathological mechanisms underlying vitreoretinal diseases. In this project, several gel-based and gel-free techniques were developed and applied for the analysis of vitreous proteome in retinal detachment (RD), diabetic retinopathy (DR), and age-related macular degeneration (AMD). Since the early proteomic studies, two-dimensional gel electrophoresis (2DE) has been the preferential method for the separation and identification of vitreous proteins. If combined with more sensitive detection techniques, refined gel image processing, and proper sample preparation, 2DE is still a valuable tool for high-resolution separation and routine analysis of proteoforms. Despite technological advances, 2DE of biological fluids, such as vitreous, remains a major challenge. Therefore, in the first part of this work, an artificial neural network was applied to optimize the recovery of vitreous proteins and their detection by 2DE analysis through the combination of several solubilizing agents (CHAPS, Genapol, DTT, IPG buffer) and physical parameters (temperature and total voltage). Using a mathematical model created by ANN, both the protein recovery and the number of spots detected in 2DE gels were significantly improved. The optimized response (580 spots) represents a 2.4-fold improvement over the standard conditions applied for vitreous analysis by 2DE. Our results clearly indicate that it is crucial to combine appropriate amounts of solubilizing agents to improve the extraction, solubilization, and detection of vitreous proteins, and to obtain well-resolved gels. Beyond that, our results also indicate that physical parameters have a significant influence on isoelectric focusing and, thereby, should be adjusted and monitored. When working with biological fluids, it is also important to reduce their complexity before 2DE analysis to facilitate the detection of low-abundant proteins, and to increase the detected in the gel increased 1.3-fold over the optimal output refined by the ANN model, with an average of 761 spots detected in vitreous from different vitreoretinopathies, including rhegmatogenous retinal detachment (RRD) and the proliferative diabetic retinopathy (PDR). In the second task of this Ph.D. project, the performance of gel-free proteomic techniques combined with stable-isotope labeling was tested for the analysis of vitreous samples in RRD. RRD is a potentially blinding condition characterized by a physical separation between the neurosensory retina and retinal pigment epithelium. Vitreous has a central role in the onset of RRD, which may be triggered by vitreous liquefaction. It reduces the vitreoretinal adhesion, leading to the accumulation of vitreous fluid in subretinal space, and, subsequently, to the physical separation between the neuronal retina and the retinal pigment epithelium. Quantitative proteomics can help to understand the changes that occur in the eye, providing additional information about the molecular mechanisms underlying RRD pathogenesis. In this study, the proteome of vitreous collected from patients with RRD was analyzed and compared to epimacular membranes (MEM) using iTRAQ reagents (Isobaric tags for relative and absolute quantitation) combined with analysis by two-dimensional liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (2D-LC-MS/MS). Using this strategy, we identified 6078 peptides corresponding to 1030 proteins, with 2613 out of these corresponded to unique peptides. Overall, 150 proteins were found differentially expressed in the RRD vitreous, including 96 overexpressed and 54 underexpressed. Among overexpressed proteins, several glycolytic enzymes (fructose-bisphosphate aldolase A, gamma-enolase, and phosphoglycerate kinase 1), glucose transporters (GLUT-1), and protease inhibitors (metalloproteinase inhibitor 1, plasminogen activator inhibitor 1) are regulated by hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1), which suggests that HIF-1 signaling pathway can be triggered in response to RRD. Also, the accumulation of photoreceptor proteins, including phosducin, rhodopsin, and s-arrestin, and vimentin in vitreous may indicate that photoreceptor degeneration occurs in RRD. Nevertheless, the overexpression of proteins of carbon metabolism or molecular chaperones or, among others, suggests that different mechanisms are activated after RRD to promote the survival of retinal cells through complex cellular responses, e.g. the activation of the HIF-1 signaling pathway. In the third task, a label-free quantitative (LFQ) method was applied to analyze the vitreous proteome in PDR and dry AMD. DR and AMD are leading causes of visual impairment and blindness in people aged 50 years or older in middle-income and industrialized countries. Although Anti-VEGF therapies have improved the management of neovascular AMD (nAMD) and PDR, no treatment options exist for dry AMD. Therefore, quantitative proteomics can help to recognize the biological mechanisms underlying these pathologies and to find new potential biomarkers and/or pharmaceutical targets. For this purpose, the proteome of vitreous collected from patients with PDR (n=4) were compared to dry AMD (n=4) and epiretinal membranes (ERM) (n=4) using an LFQ method that combines a fractionation by short SDS–polyacrylamide gel electrophoresis and analysis by LC-MS/MS. A total of 680 proteins were identified, of which 586 were identified using the software search engine MASCOT and 580 using MaxQuant. Subsequently, post hoc tests, hierarchical clustering, and multiple t-tests were performed for differentiating the three disease groups in terms of protein expression based on their intensity. Post hoc tests revealed that 96 proteins are capable of differentiating among the different groups, whereas 118 proteins (17 up- and 101 down-regulated) were found differentially regulated in PDR compared to ERM and 95 proteins (10 up- and 85 down-regulated) in PDR compared to dry AMD. Functional enrichment analysis indicates that these underexpressed proteins are correlated to pathways/ biological processes, such as extracellular matrix (ECM) disassembly and organization, platelet degranulation, lysosomal degradation, cell adhesion, and central nervous system development. In turn, mediators of complement and coagulation cascades and acute-phase inflammatory responses were found enriched in PDR vitreous, reinforcing the role of these pathways in its pathogenesis of PDR. For last, some potential biomarkers were selected according to iTRAQ and LFQ experiments and validated by multiple reaction monitoring (MRM) in a larger set of vitreous samples. Therefore, we develop a scheduled MRM method for the analysis of 35 proteins in vitreous samples collected from patients with ERM (n=21), DR/PDR (n=20), AMD (n=11), and RRD (with and without proliferative vitreoretinopathy) (n=13). Of these, 26 proteins have been shown the potential to differentiate between different disease groups according to MRM results and respective receiver operating characteristic curves. Complement and coagulation components (C6, C8B, prothrombin), acute-phase proteins (alpha-1-antichymotrypsin), adhesion molecules (galectin-3-binding protein), ECM components (opticin), and neurodegeneration biomarkers (beta-amyloid, amyloid-like protein 2) stand out as the more efficient biomarkers to discriminate among the different disease groups. In conclusion, several gel-based and gel-free strategies were develop ed and implemented for the preparation and analysis of the proteome of vitreous in different vitreoretinal diseases. Concerning the gel-based method, a mathematical model created by ANN provided an effective 2DE protocol for high-resolution analysis of vitreous proteome, which can be advantageous for analysis of specific proteoforms, including different isoforms and post-translational modified proteins. On the other hand, high-throughput methods, such as iTRAQ and LFQ, provided a more in-depth analysis of vitreous proteome. In these techniques, we identified 1030 proteins by iTRAQ and 680 by LFQ, some of them have not been previously identified. Even more relevant is the fact that vitreous analysis using these techniques provided new insights on the pathogenesis of RRD, PDR, and AMD. Beyond that, they provided fundamental information regarding potential biomarkers, which enabled the successful validation of 26 proteins by MRM. Nevertheless, it must be taken into consideration that vitreous biomarkers cannot be used for regular diagnosis due to invasive sampling. However, they can be candidates for new pharmaceutical targets and, when the samples are obtained as part of the clinical routine, be used for the prognosis of the patient's disease evolution and/or to predict the proper response to treatment.O vítreo, também denominado por corpo vítreo ou humor vítreo, é um fluido transparente que preenche a cavidade posterior do olho entre a retina neurossensorial e o cristalino. Durante muitos anos, o papel do vítreo na saúde e na doença foi negligenciado, pensando-se que a sua função era meramente estrutural. No entanto, tem-se registado um crescente interesse pela análise do proteoma vítreo nos últimos anos. Estes estudos comprovaram que o vítreo é altamente complexo e biologicamente mais ativo do que se pensava inicialmente. De facto, alterações a nível do proteoma do vítreo refletem o estado fisiológico e patológico do olho e, portanto, esta é a matriz ideal para o estudo das doenças vitreorretinianas. Embora a procura de biomarcadores no vítreo, mais sensíveis e específicos para cada patologia ocular, não tenha sido bem-sucedida até o momento, a análise do proteoma vítreo mostrou-se promissora na elucidação de alguns dos mecanismos patológicos subjacentes a estas patologias. Neste projeto, diversas técnicas proteómicas baseadas na separação de proteínas em gel de poliacrilamida (gel-based proteomics) ou no fracionamento de péptidos por cromatografia líquida (gel-free proteomics) foram desenvolvidas e aplicadas para a análise do proteoma do vítreo no descolamento da retina (RD), na retinopatia diabética (DR) e na degeneração macular relacionada com a idade (AMD). Desde os primeiros estudos em proteómica, a eletroforese bidimensional do gel (2DE) foi o método preferencial para a separação e a identificação de proteínas do vítreo. A 2DE é uma ferramenta valiosa para a separação com elevada resolução e análise de rotina de proteoformas, principalmente se for combinada com técnicas de deteção mais sensíveis, com um processamento de imagem mais refinado e com uma preparação adequada das amostras. Portanto, na primeira parte deste trabalho, aplicou-se uma rede neural artificial (ANN) para a otimização da extração de proteínas do vítreo e da sua análise por 2DE, através da combinação de vários agentes solubilizantes (CHAPS, Genapol, DTT, tampão IPG) e parâmetros físicos (temperatura e voltagem total). Pela aplicação de um modelo matemático criado por ANN, a extração de proteínas e o número de spots detetados após a sua análise por 2DE melhoram significativamente. A resposta otimizada (580 spots detetados) representa um incremento melhoria de 2,4 vezes comparando com as condições padrão utilizadas no desenho experimental inicial. Os resultados alcançados indicam claramente que é crucial combinar as concentrações adequadas de agentes solubilizantes para melhorar a extração, solubilização e a deteção das proteínas do vítreo, assim como para obter géis bem resolvidos. Para além disso, os nossos resultados também indicam que os parâmetros físicos têm uma influência significativa na focagem isoelétrica e, por esta razão, devem ser ajustados e monitorizados neste tipo de análise. Quando se trabalha com fluidos biológicos também é importante reduzir a sua complexidade antes da análise por 2DE, de modo a facilitar a deteção de proteínas pouco abundantes e a aumentar a cobertura do proteoma. Após a remoção da albumina e da imunoglobulina G, o número de proteínas detetadas no gel aumentou 1,3 vezes quando comparado com o ponto ótimo do modelo proposto por ANN, com uma média de 761 spots detetados no vítreo em doenças vitreorretinianas, como, por exemplo, o descolamento regmatogénico da retina (RRD) ou a retinopatia diabética proliferativa (PDR). Na segunda tarefa deste projeto de doutoramento, testou-se a performance das técnicas de marcação isobárica, na análise de amostras de vítreo de RRD. O RRD é uma das causas de cegueira e é caracterizado por uma separação física entre a retina neurossensorial e o epitélio pigmentar da retina (RPE). O vítreo tem um papel central no aparecimento do RRD, que pode ser provocado pela liquefação do vítreo. Esta reduz a adesão vitreorretiniana, conduzindo assim à acumulação de líquido do vítreo no espaço subretinal, e, consequentemente, à separação física entre a retina e o RPE. Assim, a proteómica quantitativa pode contribuir para a compreensão das alterações que ocorrem no olho, providenciando uma informação complementar sobre os mecanismos moleculares subjacentes à patogénese do RRD. No presente estudo, o proteoma do vítreo recolhido de doentes com RRD foi analisado e comparado com amostras de vítreo de membranas epimaculares (MEM) usando reagentes iTRAQ (Isobaric tags for relative and absolute quantitation) em combinação com análise por Cromatografia Líquida Bidimensional acoplada à Espectrometria de Massa em Tandem (2D-LC-MS/MS). A análise destas amostras por LC-MS/MS resultou na identificação de 6078 péptidos relativos a 1030 proteínas, 2613 dos quais correspondem a péptidos únicos. Das proteínas identificadas, um total de 150 estava diferencialmente expressa no vítreo de doentes com RRD, incluindo 96 proteínas sobreexpressas e 54 subexpressas. Entre as sobreexpressas encontraram-se várias enzimas glicolíticas (frutose-bifosfato aldolase A, gama-enolase e fosfoglicerato cinase 1), transportadores de glicose (GLUT-1), e inibidores de proteases (inibidor da metaloproteinase 1, inibidor do ativador de plasminogénio 1) que são regulados pelo fator induzido por hipóxia (HIF-1), o que sugere que a via de sinalização HIF-1 pode ser activada em resposta à RRD. Além disso, a acumulação no vítreo de proteínas intracelulares dos fotorreceptores, incluindo fosducina, rodopsina e S-arrestina, ou da vimentina revela que a RRD leva a uma degeneração significativa das células fotorreceptoras. No entanto, a sobreexpressão de proteínas envolvidas no metabolismo do carbono ou chaperones moleculares, entre outras, indica que diversos mecanismos são ativados em resposta ao RRD de forma a promover a sobrevivência das células retinianas através de respostas celulares complexas, como por exemplo, a ativação da via de sinalização HIF-1. Na terceira tarefa, aplicou-se um método quantitativo label-free (LFQ) para analisar o proteoma do vítreo na PDR e na forma seca da AMD (dry AMD). DR e AMD são as principais causas de deficiência visual e cegueira em indivíduos com idade igual ou superior a 50 anos, em países industrializados ou de rendimento médio. Embora as terapias direcionadas à inibição do fator de crescimento vascular (VEGF) tenham melhorado o tratamento da forma neovascular da AMD (nAMD) e da PDR, neste momento não existem opções terapêuticas para a AMD seca. Portanto, a proteómica quantitativa pode contribuir para o conhecimento dos mecanismos biológicos subjacentes a estas patologias e a encontrar novos potenciais biomarcadores e/ou alvos terapêuticos. Com esta finalidade, o proteoma do vítreo recolhido de doentes com PDR (n=4) foi comparado com o de doentes com AMD seca (n=4) e com membranas epiretinianas (ERM) (n=4) utilizando um método LFQ, que combina o fracionamento “curto” por eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida e análise por LC-MS/MS. Foram identificadas 680 proteínas, das quais 586 foram identificadas com recurso ao software MASCOT e 580 com o software MaxQuant. Posteriormente, foram realizados testes post hoc, métodos hierárquicos para análise de agrupamento de dados e testes t múltiplos para diferenciar os três grupos de doenças em termos de expressão proteica com base na sua intensidade. Os testes post hoc revelaram que 96 proteínas são capazes de diferenciar entre os diferentes grupos, enquanto 118 proteínas (17 para sobreexpressas e 101 subexpressas) foram identificados como diferencialmente expressas na PDR em comparação com doentes com ERM e 95 proteínas (10 sobreexpressas e 85 subexpressas) em comparação com os doentes com AMD seca. A análise de enriquecimento funcional indica que estas proteínas subexpressas estão correlacionadas com vias/processos biológicos, como reorganização da matriz extracelular (ECM), desgranulação das plaquetas, digestão intracelular nos lisossomas, adesão celular e desenvolvimento do sistema nervoso central. Por sua vez, os resultados indicam que o vítreo de doentes com PDR é enriquecido em mediadores dos sistemas de complemento e coagulação e da fase aguda da inflamação, reforçando o papel destas vias na sua patogénese. Por último, alguns potenciais biomarcadores foram selecionados de acordo com os resultados obtidos na quantificação do proteoma do vítreo por iTRAQ e LFQ e validados pela monitorização de múltiplas reações (MRM) num maior número de amostras de vítreo. Assim, desenvolveu-se um método de MRM scheduled para a análise de 35 proteínas, em amostras de vítreo recolhidas de doentes com ERM (n=21), DR/PDR (n=20), AMD (n=11) e RRD (com e sem vitreorretinopatia proliferativa) (n=13). Desta forma, 26 proteínas demostraram potencial para discriminar entre os diferentes grupos de doenças de acordo com os resultados obtidos no MRM e as respectivas curvas ROC (receiver operating characteristic curve). Componentes das cascatas do complemento e coagulação (C6, C8B, protrombina), proteínas de fase aguda (alfa-1-antiquimotripsina), moléculas de adesão (proteína galectina-3), componentes da ECM (opticina) e biomarcadores de neurodegeneração (beta-amilóide, proteína tipo-precursora amilóide 2) destacam-se como os biomarcadores mais eficientes para discriminar entre os diferentes grupos de doenças. Em conclusão, foram desenvolvidas e implementadas diversas estratégias para a preparação e análise do proteoma do vítreo em diferentes doenças vitreorretinianas, baseadas na separação por 2DE ou por LC. Em relação ao método baseado na separação em gel, um modelo matemático criado por ANN permitiu o desenvolvimento de um protocolo altamente eficiente para a análise de elevada resolução do proteoma do vítreo por 2DE, o que pode ser vantajoso para a detecção de proteoformas específicas, incluindo diferentes isoformas e proteínas com modificações pós-traducionais. Por outro lado, métodos de alta produtividade, como iTRAQ e LFQ, proporcionaram uma análise mais aprofundada do proteoma do vítreo. Nestas técnicas, foram identificadas 1030 proteínas pela técnica de iTRAQ e 680 por LFQ, sendo que algumas não tinham sido identificadas anteriormente. Ainda mais relevante é o fato de que a análise do proteoma do vítreo, com base nestas técnicas, forneceu novos perspetivas sobre a patogénese do RRD, PDR e AMD. Além disso, estes estudos forneceram informações fundamentais sobre potenciais biomarcadores, o que permitiu a validação de 26 proteínas por MRM. No entanto, deve ter-se em consideração que os biomarcadores encontrados no vítreo não podem ser utilizados para um diagnóstico médico regular, devido ao modo de recolha invasivo deste tipo de amostras. Porém, estes podem ser candidatos a novos alvos farmacêuticos e, quando as amostras são obtidas como parte da rotina clínica, podem ser usados para o prognóstico da evolução da doença e/ou para prever a resposta adequada ao tratamento

Chromatographic design for the purification of recombinant human membrane COMT

Several studies suggest that membrane form of catechol-O-methyltransferase OMT (MB-COMT) is the main responsible for O-methylation at physiologically low concentrations of catecholamines. Despite this, until now no studies have been allowed the total isolation of MB-COMT. Then, a sustainable chromatographic step should be developed in order to obtain significant quantities of active and pure enzyme for posterior application on biochemical, kinetic and structural studies. For the first time, we intend to compare the performance of three hydrophobic adsorbents (Butyl-, Epoxy- and Octyl-sepharose) in the purification of human membrane-bound COMT (hMBCOMT) from crude Brevibacillus choshinensis cell lysates. The hydrophobic matrices were evaluated in terms of selectivity, binding and elution conditions. Results show that the isolation of MB-COMT was possible using 375 mM monosodium phosphate concentrations for its adsorption. The hMB-COMT, as the soluble form, was found to elute at four different fractions at 0.25; 0.7 and 1% Triton X-100. Preliminary chromatographic trials indicate that hMBCOMT may be isolated on octyl- with mild salt conditions but on epoxy- were required high salt concentrations to complete enzyme adsorption. Thereby and in conclusion, in this work and for the first time was possible the total isolation of significant amounts of MB-COMT on a single chromatography step with high selectivity. Although successful applications of Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC) in the purification of membrane proteins are uncommon, in this work we prove that traditional hydrophobic matrices can open a promising unexplored field in order to fulfill specific requirements for kinetic and pharmacological trials