Development of gene therapy to deliver the receptor-specific rhTRAIL DHER variant to induce apoptosis in activated hepatic stellate cells for the treatment of liver fibrosis

Dissertação de Mestrado, Engenharia Biológica, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2014O fígado é um dos maiores órgãos do corpo humano e é responsável por funções vitais para o organismo, compreendendo o suporte e o apoio a outros órgãos. Este órgão é responsável pela síntese de componentes sanguíneos, regulação dos níveis de glucose, desintoxicação, produção de bílis e síntese de componentes essenciais à função de outros órgãos. O fígado é constituído por quatro lobos com diferentes tamanhos e formas, e por dois principais vasos sanguíneos, a artéria hepática e as veias-porta. A artéria hepática transporta o sangue da artéria aorta, enquanto as veias-porta transportam o sangue rico em nutrientes da digestão e também do pâncreas e baço. Os vasos sanguíneos subdividem-se em capilares, que se ligam a um lóbulo, a unidade funcional do fígado. Cada lóbulo contém milhões de células hepáticas (~80% de todo o fígado), as responsáveis pela função metabólica. As restantes células que constituem o fígado são células endoteliais, estreladas, linfócitos, células de Kupffer e células biliares epiteliais. As doenças hepáticas crónicas são caracterizadas por uma repetida lesão nas células hepáticas, devido a infeção por vírus (hepatite B e C), doenças autoimunes, excesso de álcool e drogas, doenças inflamatórias, doenças genéticas ou fatores esporádicos. Contudo, a constante lesão destas células leva a acumulação de ferimentos no fígado induzindo este órgão a um estado fibrótico, podendo evoluir para cirrose ou cancro. Como resposta aos ferimentos causados pelas mais diversas lesões, inicia-se um processo de acumulação de matriz extracelular. Este processo deve-se sobretudo às células estreladas do fígado, que evoluem para um estado ativo, devido ao aumento da sua resposta fenotípica, sintetizando em excesso diversos fatores de crescimento que são responsáveis não só pela fibrogénese como também por respostas inflamatórias crónicas. A ativação das células estreladas do fígado é realizada em três fases: a iniciação ou fase pré-inflamatória, onde se inicia a alteração do fenótipo e a expressão dos genes, devido sobretudo à estimulação pancreática graças ao excesso de produção de fatores de crescimento; a fase de perpetuação é devida a numerosas reações distintas, tais como, a proliferação, a contractilidade, a fibrogénese, a degradação da matriz, a perda de retinóides e de células inflamatórias; Por fim, a fase de reversão ou apoptose, é a fase em que nas células estreladas é desencadeada a apoptose, e, é nesta fase que podem interferir determinados fatores que levam à reversão da lesão das células e, por conseguinte, a reversão da fibrose. O Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) é um dos fatores que está associado à promoção da apoptose das células estreladas ativadas, pois estas células expressam em excesso o recetor para este fator. Sendo um membro da família Tumor Necrosis Factor (TNF) é uma proteína transmembranar tipo 2 e é expressa nos mais variados tecidos. O TRAIL interage com os recetores na superfície membranar das células e induz a apoptose. Até ao momento foram descritos cinco recetores: TRAIL DR4, DR5, DcR1, DcR2 e osteoprotegerin (OPG). O recetor TRAIL DR4 e DR5 têm um domínio e sinais de apoptose. Apesar de os DcR1 e DcR2 terem homologia com domínios de apoptose, o DcR1 tem um domínio de morte citoplasmática truncada e não funcional, enquanto o DcR2 falta uma região citosólica e está ancorado na membrana plasmática. O TRAIL recombinante solúvel é interessante para terapias do cancro e fibrose no fígado, uma vez que é mais específico na indução da apoptose, e a produção de um TRAIL solúvel recombinante específico para os recetores DR5 e DR4 é permitirá o desenvolvimento de terapias mais específicas. Um dos objetivos do nosso trabalho é a construção de um vector que contenha o gene para o TRAIL recombinante variante D269H e E195R, promovendo uma ligação mais específica ao recetor TRAIL DR5, logo uma apoptose mais rápida e eficaz. Contudo, a administração de proteínas diretamente ao paciente não é tão eficaz como quando a proteína é produzida diretamente nas células alvo. Por esta razão, nós pretendemos construir um vector adenoviral, que contenha o gene de interesse para a produção da proteína rhTRAIL DHER. Os nossos resultados demonstraram que o vector construído, pADTRACK-CMV-IGK-HÁ-rhTRAIL DHER, tem capacidade de expressar aquando transfectado em células, HEK-293. Além disso, a proteína produzida tem atividade biológica e exerce as funções esperadas, quando o mesmo é adicionado a uma linha celular bastante sensível para o TRAIL recombinante solúvel, onde promove a apoptose das células, como esperado. A utilização de vectores adenovirais é de grande importância em terapia genética, devido à rápida infeção do vírus nas células alvo, à baixa patogenicidade em seres humanos e ao facto de o genoma do vírus não sofrer rearranjo nas células hospedeiras. Porém, a construção do vector adenoviral não correu como esperado, possivelmente pela baixa possibilidade de recombinação de um vector digerido com outro não digerido por enzimas de restrição. No entanto, sendo um dos objetivos a promoção da apoptose em células estreladas ativadas, a proteína rhTRAIL DHER foi adicionada a uma linha celular fibrótica do fígado (LX2) e também a uma linha celular hepática não fibrótica (HepG2). A proteína, rhTRAIL DHER, de origem bacteriana, foi utilizada em vez da proteína produzida em células humanas devido à quantidade disponível. Os nossos resultados demonstraram um efeito promotor de apoptose nas células LX2 e a ausência de efeito nas HepG2. Este efeito, embora reduzido, permitiu concluir que a indução de apoptose foi específica para as células que expressam o recetor TRAIL DR5 (LX2). Terapeuticamente, este resultado é importante porque as células saudáveis expressam o recetor TRAIL DR5 em quantidades reduzidas, comparando com células fibróticas. Como descrito na literatura, a administração conjunta de inibidores HDACs com as proteínas rhTRAIL DHER, 4C7 ou WT poderá promover maior indução de apoptose e ao mesmo tempo aumentar a especificidade celular. Assim, o último objetivo do nosso trabalho consistiu em confirmar uma maior indução de apoptose aquando da administração conjunta da proteína rhTRAIL DHER,4C7 ou WT com inibidores HDAC (histonas deacetilases) como, SAHA e Entinostat. Simultaneamente, pretendemos verificar se inibidores HAT (histona acetiltransferase), MG149 e C646 exercem um efeito de proteção aquando da conjugação com as proteínas rhTRAIL DHER, 4C7 ou WT. Os inibidores HAT, histona acetiltransferase, transferem um grupo acetil da acetil co-enzima A para o grupo ε-amino num resíduo específico de lisina existente nas caudas amino-terminal das histonas, resultando de uma neutralização de carga positiva. Porém a reação inversa é catalisada por as histonas deacetilases. A nossa hipótese é que os HAT, combinados com as proteínas rhTRAIL DHER, 4C7 e WT poderiam ter um efeito protetor nas células cancerígenas. Os nossos resultados mostram que, MG149 não exerce qualquer efeito em combinação com as proteínas. Os nossos resultados comprovaram o efeito sinergético da combinação de SAHA com as proteínas rhTRAIL DHER, 4C7 e WT, quando adicionado em diferentes linhas celulares, HepG2, HUH-7 e H460. Contudo, ao contrário do que já foi demonstrado por outros autores, a combinação do Entinostat com as proteínas rhTRAIL DHER,4C7 e WT demonstrou efeito sinérgico reduzido, o que poderá ser considerado um efeito de proteção, pois não existe promoção de apoptose das células. Relativamente, aos inibidores HAT, C646 e MG149, os resultados demonstram que a combinação do MG149 com a proteína rhTRAIL DHER não exerce qualquer efeito de apoptose, o que pode indicar um efeito de proteção. O mesmo se verificou para o inibidor C646, apesar de o efeito de proteção ser menor, pois promove uma pequena percentagem de apoptose nas células

Nogo-A is secreted in extracellular vesicles, occurs in blood and can influence vascular permeability

Nogo-A is a transmembrane protein with multiple functions in the central nervous system (CNS), including restriction of neurite growth and synaptic plasticity. Thus far, Nogo-A has been predominantly considered a cell contact-dependent ligand signaling via cell surface receptors. Here, we show that Nogo-A can be secreted by cultured cells of neuronal and glial origin in association with extracellular vesicles (EVs). Neuron- and oligodendrocyte-derived Nogo-A containing EVs inhibited fibroblast spreading, and this effect was partially reversed by Nogo-A receptor S1PR2 blockage. EVs purified from HEK cells only inhibited fibroblast spreading upon Nogo-A over-expression. Nogo-A-containing EVs were found in vivo in the blood of healthy mice and rats, as well as in human plasma. Blood Nogo-A concentrations were elevated after acute stroke lesions in mice and rats. Nogo-A active peptides decreased barrier integrity in an in vitro blood-brain barrier model. Stroked mice showed increased dye permeability in peripheral organs when tested 2 weeks after injury. In the Miles assay, an in vivo test to assess leakage of the skin vasculature, a Nogo-A active peptide increased dye permeability. These findings suggest that blood borne, possibly EV-associated Nogo-A could exert long-range regulatory actions on vascular permeability

MAP Kinase Pathways in Brain Endothelial Cells and Crosstalk with Pericytes and Astrocytes Mediate Contrast-Induced Blood–Brain Barrier Disruption

Neurointervention with contrast media (CM) has rapidly increased, but the impact of CM extravasation and the related side effects remain controversial. This study investigated the effect of CM on blood–brain barrier (BBB) integrity. We established in vitro BBB models using primary cultures of rat BBB-related cells. To assess the effects of CM on BBB functions, we evaluated transendothelial electrical resistance, permeability, and tight junction (TJ) protein expression using immunohistochemistry (IHC) and Western blotting. To investigate the mechanism of iopamidol-induced barrier dysfunction, the role of mitogen-activated protein (MAP) kinases in brain endothelial cells was examined. We assessed the effect of conditioned medium derived from astrocytes and pericytes under iopamidol treatment. Short-term iopamidol exposure on the luminal side induced transient, while on the abluminal side caused persistent BBB dysfunction. IHC and immunoblotting revealed CM decreased the expression of TJ proteins. Iopamidol-induced barrier dysfunction was improved via the regulation of MAP kinase pathways. Conditioned medium from CM-exposed pericytes or astrocytes lacks the ability to enhance barrier function. CM may cause BBB dysfunction. MAP kinase pathways in brain endothelial cells and the interactions of astrocytes and pericytes mediate iopamidol-induced barrier dysfunction. CM extravasation may have negative effects on clinical outcomes in patients

The Effect of Sodium Bicarbonate, a Beneficial Adjuvant Molecule in Cystic Fibrosis, on Bronchial Epithelial Cells Expressing a Wild-Type or Mutant CFTR Channel

International audienceClinical and experimental results with inhaled sodium bicarbonate as an adjuvant therapy in cystic fibrosis (CF) are promising due to its mucolytic and bacteriostatic properties, but its direct effect has not been studied on respiratory epithelial cells. Our aim was to establish and characterize co-culture models of human CF bronchial epithelial (CFBE) cell lines expressing a wild-type (WT) or mutant (deltaF508) CF transmembrane conductance regulator (CFTR) channel with human vascular endothelial cells and investigate the effects of bicarbonate. Vascular endothelial cells induced better barrier properties in CFBE cells as reflected by the higher resistance and lower permeability values. Activation of CFTR by cAMP decreased the electrical resistance in WT but not in mutant CFBE cell layers confirming the presence and absence of functional channels, respectively. Sodium bicarbonate (100 mM) was well-tolerated by CFBE cells: it slightly reduced the impedance of WT but not that of the mutant CFBE cells. Sodium bicarbonate significantly decreased the more-alkaline intracellular pH of the mutant CFBE cells, while the barrier properties of the models were only minimally changed. These observations indicate that sodium bicarbonate is beneficial to deltaF508-CFTR expressing CFBE cells. Thus, sodium bicarbonate may have a direct therapeutic effect on the bronchial epithelium

Severe Asthma Standard-of-Care Background Medication Reduction With Benralizumab: ANDHI in Practice Substudy

Background: The phase IIIb, randomized, parallel-group, placebo-controlled ANDHI double-blind (DB) study extended understanding of the efficacy of benralizumab for patients with severe eosinophilic asthma. Patients from ANDHI DB could join the 56-week ANDHI in Practice (IP) single-arm, open-label extension substudy. Objective: Assess potential for standard-of-care background medication reductions while maintaining asthma control with benralizumab. Methods: Following ANDHI DB completion, eligible adults were enrolled in ANDHI IP. After an 8-week run-in with benralizumab, there were 5 visits to potentially reduce background asthma medications for patients achieving and maintaining protocol-defined asthma control with benralizumab. Main outcome measures for non-oral corticosteroid (OCS)-dependent patients were the proportions with at least 1 background medication reduction (ie, lower inhaled corticosteroid dose, background medication discontinuation) and the number of adapted Global Initiative for Asthma (GINA) step reductions at end of treatment (EOT). Main outcomes for OCS-dependent patients were reductions in daily OCS dosage and proportion achieving OCS dosage of 5 mg or lower at EOT. Results: For non-OCS-dependent patients, 53.3% (n = 208 of 390) achieved at least 1 background medication reduction, increasing to 72.6% (n = 130 of 179) for patients who maintained protocol-defined asthma control at EOT. A total of 41.9% (n = 163 of 389) achieved at least 1 adapted GINA step reduction, increasing to 61.8% (n = 110 of 178) for patients with protocol-defined EOT asthma control. At ANDHI IP baseline, OCS dosages were 5 mg or lower for 40.4% (n = 40 of 99) of OCS-dependent patients. Of OCS-dependent patients, 50.5% (n = 50 of 99) eliminated OCS and 74.7% (n = 74 of 99) achieved dosages of 5 mg or lower at EOT. Conclusions: These findings demonstrate benralizumab's ability to improve asthma control, thereby allowing background medication reduction

TRY plant trait database – enhanced coverage and open access

Plant traits - the morphological, anatomical, physiological, biochemical and phenological characteristics of plants - determine how plants respond to environmental factors, affect other trophic levels, and influence ecosystem properties and their benefits and detriments to people. Plant trait data thus represent the basis for a vast area of research spanning from evolutionary biology, community and functional ecology, to biodiversity conservation, ecosystem and landscape management, restoration, biogeography and earth system modelling. Since its foundation in 2007, the TRY database of plant traits has grown continuously. It now provides unprecedented data coverage under an open access data policy and is the main plant trait database used by the research community worldwide. Increasingly, the TRY database also supports new frontiers of trait‐based plant research, including the identification of data gaps and the subsequent mobilization or measurement of new data. To support this development, in this article we evaluate the extent of the trait data compiled in TRY and analyse emerging patterns of data coverage and representativeness. Best species coverage is achieved for categorical traits - almost complete coverage for ‘plant growth form’. However, most traits relevant for ecology and vegetation modelling are characterized by continuous intraspecific variation and trait–environmental relationships. These traits have to be measured on individual plants in their respective environment. Despite unprecedented data coverage, we observe a humbling lack of completeness and representativeness of these continuous traits in many aspects. We, therefore, conclude that reducing data gaps and biases in the TRY database remains a key challenge and requires a coordinated approach to data mobilization and trait measurements. This can only be achieved in collaboration with other initiatives

Abstracts from the 20th International Symposium on Signal Transduction at the Blood-Brain Barriers

https://deepblue.lib.umich.edu/bitstream/2027.42/138963/1/12987_2017_Article_71.pd

Prevalence, associated factors and outcomes of pressure injuries in adult intensive care unit patients: the DecubICUs study

Funder: European Society of Intensive Care Medicine; doi: http://dx.doi.org/10.13039/501100013347Funder: Flemish Society for Critical Care NursesAbstract: Purpose: Intensive care unit (ICU) patients are particularly susceptible to developing pressure injuries. Epidemiologic data is however unavailable. We aimed to provide an international picture of the extent of pressure injuries and factors associated with ICU-acquired pressure injuries in adult ICU patients. Methods: International 1-day point-prevalence study; follow-up for outcome assessment until hospital discharge (maximum 12 weeks). Factors associated with ICU-acquired pressure injury and hospital mortality were assessed by generalised linear mixed-effects regression analysis. Results: Data from 13,254 patients in 1117 ICUs (90 countries) revealed 6747 pressure injuries; 3997 (59.2%) were ICU-acquired. Overall prevalence was 26.6% (95% confidence interval [CI] 25.9–27.3). ICU-acquired prevalence was 16.2% (95% CI 15.6–16.8). Sacrum (37%) and heels (19.5%) were most affected. Factors independently associated with ICU-acquired pressure injuries were older age, male sex, being underweight, emergency surgery, higher Simplified Acute Physiology Score II, Braden score 3 days, comorbidities (chronic obstructive pulmonary disease, immunodeficiency), organ support (renal replacement, mechanical ventilation on ICU admission), and being in a low or lower-middle income-economy. Gradually increasing associations with mortality were identified for increasing severity of pressure injury: stage I (odds ratio [OR] 1.5; 95% CI 1.2–1.8), stage II (OR 1.6; 95% CI 1.4–1.9), and stage III or worse (OR 2.8; 95% CI 2.3–3.3). Conclusion: Pressure injuries are common in adult ICU patients. ICU-acquired pressure injuries are associated with mainly intrinsic factors and mortality. Optimal care standards, increased awareness, appropriate resource allocation, and further research into optimal prevention are pivotal to tackle this important patient safety threat