Development of gene therapy to deliver the receptor-specific rhTRAIL DHER variant to induce apoptosis in activated hepatic stellate cells for the treatment of liver fibrosis
Dissertação de Mestrado, Engenharia Biológica, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2014O fígado é um dos maiores órgãos do corpo humano e é responsável por funções vitais para o organismo, compreendendo o suporte e o apoio a outros órgãos. Este órgão é responsável pela síntese de componentes sanguíneos, regulação dos níveis de glucose, desintoxicação, produção de bílis e síntese de componentes essenciais à função de outros órgãos. O fígado é constituído por quatro lobos com diferentes tamanhos e formas, e por dois principais vasos sanguíneos, a artéria hepática e as veias-porta. A artéria hepática transporta o sangue da artéria aorta, enquanto as veias-porta transportam o sangue rico em nutrientes da digestão e também do pâncreas e baço. Os vasos sanguíneos subdividem-se em capilares, que se ligam a um lóbulo, a unidade funcional do fígado. Cada lóbulo contém milhões de células hepáticas (~80% de todo o fígado), as responsáveis pela função metabólica. As restantes células que constituem o fígado são células endoteliais, estreladas, linfócitos, células de Kupffer e células biliares epiteliais.
As doenças hepáticas crónicas são caracterizadas por uma repetida lesão nas células hepáticas, devido a infeção por vírus (hepatite B e C), doenças autoimunes, excesso de álcool e drogas, doenças inflamatórias, doenças genéticas ou fatores esporádicos. Contudo, a constante lesão destas células leva a acumulação de ferimentos no fígado induzindo este órgão a um estado fibrótico, podendo evoluir para cirrose ou cancro. Como resposta aos ferimentos causados pelas mais diversas lesões, inicia-se um processo de acumulação de matriz extracelular. Este processo deve-se sobretudo às células estreladas do fígado, que evoluem para um estado ativo, devido ao aumento da sua resposta fenotípica, sintetizando em excesso diversos fatores de crescimento que são responsáveis não só pela fibrogénese como também por respostas inflamatórias crónicas.
A ativação das células estreladas do fígado é realizada em três fases: a iniciação ou fase pré-inflamatória, onde se inicia a alteração do fenótipo e a expressão dos genes, devido sobretudo à estimulação pancreática graças ao excesso de produção de fatores de crescimento; a fase de perpetuação é devida a numerosas reações distintas, tais como, a proliferação, a contractilidade, a fibrogénese, a degradação da matriz, a perda de retinóides e de células inflamatórias; Por fim, a fase de reversão ou apoptose, é a fase em que nas células estreladas é desencadeada a apoptose, e, é nesta fase que podem interferir determinados fatores que levam à reversão da lesão das células e, por conseguinte, a reversão da fibrose.
O Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) é um dos fatores que está associado à promoção da apoptose das células estreladas ativadas, pois estas células expressam em excesso o recetor para este fator. Sendo um membro da família Tumor Necrosis Factor (TNF) é uma proteína transmembranar tipo 2 e é expressa nos mais variados tecidos. O TRAIL interage com os recetores na superfície membranar das células e induz a apoptose. Até ao momento foram descritos cinco recetores: TRAIL DR4, DR5, DcR1, DcR2 e osteoprotegerin (OPG). O recetor TRAIL DR4 e DR5 têm um domínio e sinais de apoptose. Apesar de os DcR1 e DcR2 terem homologia com domínios de apoptose, o DcR1 tem um domínio de morte citoplasmática truncada e não funcional, enquanto o DcR2 falta uma região citosólica e está ancorado na membrana plasmática.
O TRAIL recombinante solúvel é interessante para terapias do cancro e fibrose no fígado, uma vez que é mais específico na indução da apoptose, e a produção de um TRAIL solúvel recombinante específico para os recetores DR5 e DR4 é permitirá o desenvolvimento de terapias mais específicas. Um dos objetivos do nosso trabalho é a construção de um vector que contenha o gene para o TRAIL recombinante variante D269H e E195R, promovendo uma ligação mais específica ao recetor TRAIL DR5, logo uma apoptose mais rápida e eficaz.
Contudo, a administração de proteínas diretamente ao paciente não é tão eficaz como quando a proteína é produzida diretamente nas células alvo. Por esta razão, nós pretendemos construir um vector adenoviral, que contenha o gene de interesse para a produção da proteína rhTRAIL DHER.
Os nossos resultados demonstraram que o vector construído, pADTRACK-CMV-IGK-HÁ-rhTRAIL DHER, tem capacidade de expressar aquando transfectado em células, HEK-293. Além disso, a proteína produzida tem atividade biológica e exerce as funções esperadas, quando o mesmo é adicionado a uma linha celular bastante sensível para o TRAIL recombinante solúvel, onde promove a apoptose das células, como esperado. A utilização de vectores adenovirais é de grande importância em terapia genética, devido à rápida infeção do vírus nas células alvo, à baixa patogenicidade em seres humanos e ao facto de o genoma do vírus não sofrer rearranjo nas células hospedeiras. Porém, a construção do vector adenoviral não correu como esperado, possivelmente pela baixa possibilidade de recombinação de um vector digerido com outro não digerido por enzimas de restrição.
No entanto, sendo um dos objetivos a promoção da apoptose em células estreladas ativadas, a proteína rhTRAIL DHER foi adicionada a uma linha celular fibrótica do fígado (LX2) e também a uma linha celular hepática não fibrótica (HepG2). A proteína, rhTRAIL DHER, de origem bacteriana, foi utilizada em vez da proteína produzida em células humanas devido à quantidade disponível. Os nossos resultados demonstraram um efeito promotor de apoptose nas células LX2 e a ausência de efeito nas HepG2. Este efeito, embora reduzido, permitiu concluir que a indução de apoptose foi específica para as células que expressam o recetor TRAIL DR5 (LX2). Terapeuticamente, este resultado é importante porque as células saudáveis expressam o recetor TRAIL DR5 em quantidades reduzidas, comparando com células fibróticas. Como descrito na literatura, a administração conjunta de inibidores HDACs com as proteínas rhTRAIL DHER, 4C7 ou WT poderá promover maior indução de apoptose e ao mesmo tempo aumentar a especificidade celular.
Assim, o último objetivo do nosso trabalho consistiu em confirmar uma maior indução de apoptose aquando da administração conjunta da proteína rhTRAIL DHER,4C7 ou WT com inibidores HDAC (histonas deacetilases) como, SAHA e Entinostat. Simultaneamente, pretendemos verificar se inibidores HAT (histona acetiltransferase), MG149 e C646 exercem um efeito de proteção aquando da conjugação com as proteínas rhTRAIL DHER, 4C7 ou WT. Os inibidores HAT, histona acetiltransferase, transferem um grupo acetil da acetil co-enzima A para o grupo ε-amino num resíduo específico de lisina existente nas caudas amino-terminal das histonas, resultando de uma neutralização de carga positiva. Porém a reação inversa é catalisada por as histonas deacetilases. A nossa hipótese é que os HAT, combinados com as proteínas rhTRAIL DHER, 4C7 e WT poderiam ter um efeito protetor nas células cancerígenas. Os nossos resultados mostram que, MG149 não exerce qualquer efeito em combinação com as proteínas.
Os nossos resultados comprovaram o efeito sinergético da combinação de SAHA com as proteínas rhTRAIL DHER, 4C7 e WT, quando adicionado em diferentes linhas celulares, HepG2, HUH-7 e H460. Contudo, ao contrário do que já foi demonstrado por outros autores, a combinação do Entinostat com as proteínas rhTRAIL DHER,4C7 e WT demonstrou efeito sinérgico reduzido, o que poderá ser considerado um efeito de proteção, pois não existe promoção de apoptose das células. Relativamente, aos inibidores HAT, C646 e MG149, os resultados demonstram que a combinação do MG149 com a proteína rhTRAIL DHER não exerce qualquer efeito de apoptose, o que pode indicar um efeito de proteção. O mesmo se verificou para o inibidor C646, apesar de o efeito de proteção ser menor, pois promove uma pequena percentagem de apoptose nas células
