Apport des nouvelles générations de séquençage pour accéder à la diversité des communautés microbiennes du sol : nécessité d’un ‘pipeline’ bio-informatique pour les biologistes

Communication orale, résuméLa diversité microbienne d’un sol est difficile à caractériser. Ceci s’explique par une accessibilité plus ou moins importante des populations au sein d’une matrice hétérogène et structurée, mais aussi par l’incapacité à résoudre une information constituée de 100 000 à 1 000 000 d’espèces différentes par gramme de sol. Toutefois, récemment, d’importantes avancées en biologie moléculaire ont permis de mieux caractériser la diversité des communautés microbiennes du sol in situ et ce sans a priori. Ainsi, la puissance des nouvelles générations de séquençage comme le pyroséquençage permettent de travailler en haut-débit afin d’obtenir plusieurs dizaines, voire plusieurs centaines de milliers de séquences à partir d’un ADN méta-génomique. De premières études ont déjà été réalisées avec cette technique afin d’aborder la diversité bactérienne des sols. Ces études ont, pour la première fois, permis de quantifier de façon exhaustive la diversité microbienne de sols en termes de richesse spécifique et de démontrer la pertinence, la faisabilité et la robustesse de cette approche. Cette approche est maintenant unanimement reconnue pour sa pertinence et ses potentialités très importantes, et ce afin de déterminer la diversité des microorganismes telluriques. Notre approche consiste en la caractérisation de la diversité taxonomique (bactérienne et fongique) de sols sur des échantillonnages de grande ampleur dans le temps et dans l’espace, avec comme objectifs : (i) de faire un inventaire exhaustif de la diversité microbienne tellurique, (ii) d’évaluer sa distribution spatiale, (iii) de mieux comprendre sa régulation et, (iv) in fine, de pouvoir relier cette diversité en fonctionnement biologique du sol et en services écosystémiques [1-3]. Cependant, l’étude d’un aussi grand nombre d’échantillons va entraîner la production massive de séquences. Ce caractère massif, ainsi que les caractéristiques inhérentes aux séquences obtenues par cette technique requièrent le développement d’outils bioinformatiques adaptés, optimisés et évalués, afin d’analyser rapidement et efficacement ce type de données. Ce nouveau pipeline d’analyse doit tout d’abord être facile d’utilisation et répondre aux attentes des différents utilisateurs, qu’ils soient compétents en bio-informatique, ou novices dans l’analyse de tels jeux de données. Il doit également permettre de gérer un grand nombre de séquences et d’automatiser les grandes étapes d’analyse (prétraitement, filtration, clustérisation, assignation taxonomique, calculs d’indices d’abondance et de diversité, taux de couverture,…). L’ensemble du système devra enfin être transféré sur un serveur de calcul et accessible au travers d’un serveur Web pour être accessible à la collectivité des écologistes microbiens. L’objectif étant de coupler, sur un grand nombre d’échantillons, cette approche avec des mesures d’activités et de faire le lien entre la diversité microbienne et l’aptitude des sols à rendre des services

Identification of transcriptional signals in Encephalitozoon cuniculi widespread among Microsporidia phylum: support for accurate structural genome annotation

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Microsporidia are obligate intracellular eukaryotic parasites with genomes ranging in size from 2.3 Mbp to more than 20 Mbp. The extremely small (2.9 Mbp) and highly compact (~1 gene/kb) genome of the human parasite <it>Encephalitozoon cuniculi </it>has been fully sequenced. The aim of this study was to characterize noncoding motifs that could be involved in regulation of gene expression in <it>E. cuniculi </it>and to show whether these motifs are conserved among the phylum Microsporidia.</p> <p>Results</p> <p>To identify such signals, 5' and 3'RACE-PCR experiments were performed on different E. cuniculi mRNAs. This analysis confirmed that transcription overrun occurs in E. cuniculi and may result from stochastic recognition of the AAUAAA polyadenylation signal. Such experiments also showed highly reduced 5'UTR's (<7 nts). Most of the <it>E. cuniculi </it>genes presented a CCC-like motif immediately upstream from the coding start. To characterize other signals involved in differential transcriptional regulation, we then focused our attention on the gene family coding for ribosomal proteins. An AAATTT-like signal was identified upstream from the CCC-like motif. In rare cases the cytosine triplet was shown to be substituted by a GGG-like motif. Comparative genomic studies confirmed that these different signals are also located upstream from genes encoding ribosomal proteins in other microsporidian species including <it>Antonospora locustae</it>, <it>Enterocytozoon bieneusi</it>, <it>Anncaliia algerae </it>(syn. <it>Brachiola algerae</it>) and <it>Nosema ceranae</it>. Based on these results a systematic analysis of the ~2000 E. cuniculi coding DNA sequences was then performed and brings to highlight that 364 translation initiation codons (18.29% of total CDSs) had been badly predicted.</p> <p>Conclusion</p> <p>We identified various signals involved in the maturation of E. cuniculi mRNAs. Presence of such signals, in phylogenetically distant microsporidian species, suggests that a common regulatory mechanism exists among the microsporidia. Furthermore, 5'UTRs being strongly reduced, these signals can be used to ensure the accurate prediction of translation initiation codons for microsporidian genes and to improve microsporidian genome annotation.</p

Detecting variants with Metabolic Design, a new software tool to design probes for explorative functional DNA microarray development

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Microorganisms display vast diversity, and each one has its own set of genes, cell components and metabolic reactions. To assess their huge unexploited metabolic potential in different ecosystems, we need high throughput tools, such as functional microarrays, that allow the simultaneous analysis of thousands of genes. However, most classical functional microarrays use specific probes that monitor only known sequences, and so fail to cover the full microbial gene diversity present in complex environments. We have thus developed an algorithm, implemented in the user-friendly program Metabolic Design, to design efficient explorative probes.</p> <p>Results</p> <p>First we have validated our approach by studying eight enzymes involved in the degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons from the model strain <it>Sphingomonas paucimobilis </it>sp. EPA505 using a designed microarray of 8,048 probes. As expected, microarray assays identified the targeted set of genes induced during biodegradation kinetics experiments with various pollutants. We have then confirmed the identity of these new genes by sequencing, and corroborated the quantitative discrimination of our microarray by quantitative real-time PCR. Finally, we have assessed metabolic capacities of microbial communities in soil contaminated with aromatic hydrocarbons. Results show that our probe design (sensitivity and explorative quality) can be used to study a complex environment efficiently.</p> <p>Conclusions</p> <p>We successfully use our microarray to detect gene expression encoding enzymes involved in polycyclic aromatic hydrocarbon degradation for the model strain. In addition, DNA microarray experiments performed on soil polluted by organic pollutants without prior sequence assumptions demonstrate high specificity and sensitivity for gene detection. Metabolic Design is thus a powerful, efficient tool that can be used to design explorative probes and monitor metabolic pathways in complex environments, and it may also be used to study any group of genes. The Metabolic Design software is freely available from the authors and can be downloaded and modified under general public license.</p

Recruitment of Glycosyl Hydrolase Proteins in a Cone Snail Venomous Arsenal: Further Insights into Biomolecular Features of Conus Venoms

Cone snail venoms are considered an untapped reservoir of extremely diverse peptides, named conopeptides, displaying a wide array of pharmacological activities. We report here for the first time, the presence of high molecular weight compounds that participate in the envenomation cocktail used by these marine snails. Using a combination of proteomic and transcriptomic approaches, we identified glycosyl hydrolase proteins, of the hyaluronidase type (Hyal), from the dissected and injectable venoms (“injectable venom” stands for the venom variety obtained by milking of the snails. This is in contrast to the “dissected venom”, which was obtained from dissected snails by extraction of the venom glands) of a fish-hunting cone snail, Conus consors (Pionoconus clade). The major Hyal isoform, Conohyal-Cn1, is expressed as a mixture of numerous glycosylated proteins in the 50 kDa molecular mass range, as observed in 2D gel and mass spectrometry analyses. Further proteomic analysis and venom duct mRNA sequencing allowed full sequence determination. Additionally, unambiguous segment location of at least three glycosylation sites could be determined, with glycans corresponding to multiple hexose (Hex) and N-acetylhexosamine (HexNAc) moieties. With respect to other known Hyals, Conohyal-Cn1 clearly belongs to the hydrolase-type of Hyals, with strictly conserved consensus catalytic donor and positioning residues. Potent biological activity of the native Conohyals could be confirmed in degrading hyaluronic acid. A similar Hyal sequence was also found in the venom duct transcriptome of C. adamsonii (Textilia clade), implying a possible widespread recruitment of this enzyme family in fish-hunting cone snail venoms. These results provide the first detailed Hyal sequence characterized from a cone snail venom, and to a larger extent in the Mollusca phylum, thus extending our knowledge on this protein family and its evolutionary selection in marine snail venoms

New design of probes for functional DNA microarrays and characterization of the biodegradation capacities of bacterial communities in hydrocarbon polluted soils

Les activités humaines sont à l’origine de nombreuses pollutions par des hydrocarbures au niveau des écosystèmes, et plus particulièrement au niveau des sols. Afin de préserver la santé humaine et environnementale, il est nécessaire d’éliminer les polluants présents. Dans ce but, les techniques de bioremédiation apparaissent aujourd’hui comme de réelles alternatives aux techniques classiques, invasives et onéreuses. Cependant, l’utilisation optimale de tels procédés nécessite une meilleure connaissance des capacités métaboliques des communautés microbiennes impliquées dans la biodégradation de ces polluants. Dans ce cadre, l’utilisation des biopuces ADN fonctionnelles pour analyser ces écosystèmes semble très appropriée.Cependant, une de ses limitations actuelles est la détermination des sondes, qui ne ciblent que les gènes dont les séquences ont été caractérisées. Pour cela, un outil informatique (Metabolic Design) a été mis au point, afin de déterminer des sondes exploratoires pour biopuces fonctionnelles. L’étude, avec notre biopuce fonctionnelle, des capacités métaboliques de dégradation des HAP de la souche Sphingomonas paucimobilis sp. EPA505 a permis de mettre en évidence la sensibilité et la spécificité des sondes développées, ainsi que leur aspect exploratoire. Puis, nous nous sommes attachés à caractériser les capacités métaboliques des communautés bactériennes d’un sol pollué principalement par des HAP, sans à priori sur les séquences ou les organismes présents, montrant l’efficacité de notre approche.Soil ecosystems are sensitive to damage from pollutions, and there is an increasing need to develop better methods for removing pollutants from soils. The removal of pollutants, such as polycyclic aromatic hydrocarbons, by bioremediation, is a less invasive and expensive process than classical decontamination. However, use and optimization of bioremediation treatments require knowledge on metabolic capacites of microbial communities involved in the biodegradation of such pollutants. To assess their huge metabolic potentialities, we need high throughput tools, such as functional microarrays, that allow the simultaneous analysis of thousands of genes. However, most classical functional microarrays use specific probes that monitor only known sequences and so, fail to cover the full microbial gene diversity present in complex environments. We have thus developed a program, named Metabolic Design, to design efficient explorative probes for functional microarrays. Then, we successfully validated our new functional microarray studying metabolic capacities of Sphnigomonas paucimobilis sp. EPA505 able to degrade polycyclic aromatic hydrocarbons. Finally, we assessed metabolic capacities of microbial communities in soil, contaminated with aromatic hydrocarbons. Results show that our probe design (sensitivity and explorative quality) can be used to study a complex environment efficiently

Nouveau design de sondes pour biopuces ADN fonctionnelles et caractérisation des capacités de biodégradation des communautés bactériennes de sols pollués par des hydrocarbures

Soil ecosystems are sensitive to damage from pollutions, and there is an increasing need to develop better methods for removing pollutants from soils. The removal of pollutants, such as polycyclic aromatic hydrocarbons, by bioremediation, is a less invasive and expensive process than classical decontamination. However, use and optimization of bioremediation treatments require knowledge on metabolic capacites of microbial communities involved in the biodegradation of such pollutants. To assess their huge metabolic potentialities, we need high throughput tools, such as functional microarrays, that allow the simultaneous analysis of thousands of genes. However, most classical functional microarrays use specific probes that monitor only known sequences and so, fail to cover the full microbial gene diversity present in complex environments. We have thus developed a program, named Metabolic Design, to design efficient explorative probes for functional microarrays. Then, we successfully validated our new functional microarray studying metabolic capacities of Sphnigomonas paucimobilis sp. EPA505 able to degrade polycyclic aromatic hydrocarbons. Finally, we assessed metabolic capacities of microbial communities in soil, contaminated with aromatic hydrocarbons. Results show that our probe design (sensitivity and explorative quality) can be used to study a complex environment efficiently.Les activités humaines sont à l’origine de nombreuses pollutions par des hydrocarbures au niveau des écosystèmes, et plus particulièrement au niveau des sols. Afin de préserver la santé humaine et environnementale, il est nécessaire d’éliminer les polluants présents. Dans ce but, les techniques de bioremédiation apparaissent aujourd’hui comme de réelles alternatives aux techniques classiques, invasives et onéreuses. Cependant, l’utilisation optimale de tels procédés nécessite une meilleure connaissance des capacités métaboliques des communautés microbiennes impliquées dans la biodégradation de ces polluants. Dans ce cadre, l’utilisation des biopuces ADN fonctionnelles pour analyser ces écosystèmes semble très appropriée.Cependant, une de ses limitations actuelles est la détermination des sondes, qui ne ciblent que les gènes dont les séquences ont été caractérisées. Pour cela, un outil informatique (Metabolic Design) a été mis au point, afin de déterminer des sondes exploratoires pour biopuces fonctionnelles. L’étude, avec notre biopuce fonctionnelle, des capacités métaboliques de dégradation des HAP de la souche Sphingomonas paucimobilis sp. EPA505 a permis de mettre en évidence la sensibilité et la spécificité des sondes développées, ainsi que leur aspect exploratoire. Puis, nous nous sommes attachés à caractériser les capacités métaboliques des communautés bactériennes d’un sol pollué principalement par des HAP, sans à priori sur les séquences ou les organismes présents, montrant l’efficacité de notre approche

Nouveau design de sondes pour biopuces ADN fonctionnelles et caractérisation des capacités de biodégradation des communautés bactériennes de sols pollués par des hydrocarbures

Les activités humaines sont à l origine de nombreuses pollutions par des hydrocarbures au niveau des écosystèmes, et plus particulièrement au niveau des sols. Afin de préserver la santé humaine et environnementale, il est nécessaire d éliminer les polluants présents. Dans ce but, les techniques de bioremédiation apparaissent aujourd hui comme de réelles alternatives aux techniques classiques, invasives et onéreuses. Cependant, l utilisation optimale de tels procédés nécessite une meilleure connaissance des capacités métaboliques des communautés microbiennes impliquées dans la biodégradation de ces polluants. Dans ce cadre, l utilisation des biopuces ADN fonctionnelles pour analyser ces écosystèmes semble très appropriée.Cependant, une de ses limitations actuelles est la détermination des sondes, qui ne ciblent que les gènes dont les séquences ont été caractérisées. Pour cela, un outil informatique (Metabolic Design) a été mis au point, afin de déterminer des sondes exploratoires pour biopuces fonctionnelles. L étude, avec notre biopuce fonctionnelle, des capacités métaboliques de dégradation des HAP de la souche Sphingomonas paucimobilis sp. EPA505 a permis de mettre en évidence la sensibilité et la spécificité des sondes développées, ainsi que leur aspect exploratoire. Puis, nous nous sommes attachés à caractériser les capacités métaboliques des communautés bactériennes d un sol pollué principalement par des HAP, sans à priori sur les séquences ou les organismes présents, montrant l efficacité de notre approche.Soil ecosystems are sensitive to damage from pollutions, and there is an increasing need to develop better methods for removing pollutants from soils. The removal of pollutants, such as polycyclic aromatic hydrocarbons, by bioremediation, is a less invasive and expensive process than classical decontamination. However, use and optimization of bioremediation treatments require knowledge on metabolic capacites of microbial communities involved in the biodegradation of such pollutants. To assess their huge metabolic potentialities, we need high throughput tools, such as functional microarrays, that allow the simultaneous analysis of thousands of genes. However, most classical functional microarrays use specific probes that monitor only known sequences and so, fail to cover the full microbial gene diversity present in complex environments. We have thus developed a program, named Metabolic Design, to design efficient explorative probes for functional microarrays. Then, we successfully validated our new functional microarray studying metabolic capacities of Sphnigomonas paucimobilis sp. EPA505 able to degrade polycyclic aromatic hydrocarbons. Finally, we assessed metabolic capacities of microbial communities in soil, contaminated with aromatic hydrocarbons. Results show that our probe design (sensitivity and explorative quality) can be used to study a complex environment efficiently.CLERMONT FD-Bib.électronique (631139902) / SudocSudocFranceF

Assessing microbial biogeography by using a metagenomic approach

EABIOmEIPMUBINRASoils are highly complex ecosystems and are considered as one of the Earth’s main reservoirs of biological diversity. Bacteria account for a major part of this biodiversity, and it is now clear that such microorganisms have a key role in soil functioning processes. However, environmental factors regulating the diversity of below-ground bacteria still need to be investigated, which limits our understanding of the distribution of such bacteria at various spatial scales. The overall objectives of this study were: (i) to determine the spatial patterning of bacterial community diversity in soils at a broad scale, and (ii) to rank the environmental filters most influencing this distribution. This study was performed at the scale of the France by using the French Soil Quality Monitoring Network. This network includes more than 2,200 soil samples along a systematic grid sampling. For each soil, bacterial diversity was characterized using a pyrosequencing approach targeting the 16S rRNA genes directly amplified from soil DNA, obtaining more than 18 million of high-quality sequences. This study provides the first estimates of microbial diversity at the scale of France, with for example, bacterial richness ranging from 555 to 2,007 OTUs (on average: 1,289 OTUs). It also provides the first extensive map of bacterial diversity, as well as of major bacterial taxa, revealing a bacterial heterogeneous and spatially structured distribution at the scale of France. The main factors driving bacterial community distribution are the soil physico-chemical properties (pH, texture...) and land use (forest, grassland, crop system...), evidencing that bacterial spatial distribution at a broad scale depends on local filters such as soil characteristics and land use when regarding the community (quality, composition) as a whole. Moreover, this study also offers a better evaluation of the impact of land uses on soil microbial diversity and taxa, with consequences in terms of sustainability for agricultural systems

Nouvelles techniques de méta-omiques pour le diagnostic de la qualité microbiologique des sols

National audienceLes nouvelles techniques de méta-omiques ont bouleversé le domaine de l’écologie microbienne, notamment grâce à l’apport des nouvelles techniques de séquençage à haut débit. Cette révolution a aussi été bénéfique en proposant des outils afin de mesurer et de réaliser des diagnostics de la qualité microbiologique des sols. Quels sont les bio-indicateurs utilisés ? Comment sont-ils étudiés et appliqués à grande échelle ? Dans cet article, seront présentées les différentes techniques de méta-omiques illustrées par des exemples validés ou en cours de validation ainsi que les développements futurs afin de répondre à l’enjeu essentiel d’une meilleure compréhension et préservation des sols.Abstact: New meta-omics techniques for diagnosis of soil microbial quality.The new meta-omics techniques have upset the field of microbial ecology, particularly due to the contribution of the new high-throughput sequencing technologies. This revolution has benefited from fundamental research point of view but also by giving access to tools dedicated to new measurements and to carry out soil microbial quality diagnosis. What are the bio-indicators used? How are they studied and applied on a large scale? This article will be focused on the different meta-omic techniques illustrated by valid or undergoing validation examples, as well as future developments in order to answer the essential challenge of a better understanding and preservation of the soil