Towards improvement of Haematococcus pluvialis cultures by cell sorting and auv mutagenesis

Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017Nowadays, there is an increased interest in biological active compounds derived from natural sources, especially compounds with medical applications, nutrient rich food and feed, and health promoting compounds. Microalgae are a potential valuable resource for a biotech purposes, as new sources of biomolecules such as pigments, lipids, carbohydrates and proteins. Natural pigments have pharmacological properties and have increased marketability of products advantages over synthetic products. Commercial production of natural carotenoids from microalgae is an eco-friendlier and safer approach than synthetic manufacture by chemical procedures. Of several naturally occurring carotenoids, astaxanthin is considered one of the best, being able to protect cells, lipids and membrane lipoproteins against oxidative damage. Haematococcus pluvialis is the richest source of natural astaxanthin and is produced at large scale. The work herein described had the objective to improve H. pluvialis strains with an enhanced accumulation of astaxanthin content. For the strain improvement three approaches have been used: (i) screening of different strains to select those with a superior performance; (ii) flow cytometry assisted cell sorting of cells subpopulations with increased astaxanthin production and (iii) random mutagenesis by UV-C irradiation and mutants selection. For this purpose, seven H. pluvialis strains were used and a characterization was conducted throughout the 3-steps cultivation experimental strategy: green vegetative growth, induction of astaxanthin accumulation and additional salinity stress stages. This integrative characterization focused on a number of microalgae physiological properties, intending to thoroughly assess the evolution and heterogeneity of their vitality and astaxanthin accumulation capacity. HP_02 and HP_03 were the most promising selected strains, reaching respectively 3.8 % and 4.4 % (of their DW) of astaxanthin content, and presenting high growth rates of 0.58 day-1 and 0.52 day-1. The two strains were submitted to fluorescence activated cell sorting for enrichment of astaxanthin over-producers. Both strains showed similar performances and no specific cell properties and/or stresses responses could be point as particularly relevant. The HP_03 strain was further subjected to random mutagenesis by exposure to UV-C radiation in order to promote heterogeneity in the cell population. The isolation of cells sub-populations of interest, with high recovery and high degree of purity, was not achieved, due to the homogeneity of the populations of the analyzed strains, and due to technical impossibility of the sorting device. However, it is noteworthy that, flow cytometry allowed the monitoring of astaxanthin content during the induction phase of the culture, and showed that the autofluorescence of this pigment can be a good indicator of its intracellular accumulation and can therefore be monitored in real time by flow cytometry. The results of the preliminary random mutagenesis assay, by exposure to UV-C radiation seem to indicate that this strategy is promising to increase the subpopulation of astaxanthin producing cells. Further similar studies with different strains and additional parameters should be performed to better clarify this subject.As microalgas estão a emergir como uma das mais promissoras fontes sustentáveis de biomassa, combustível, alimentação, rações e outros produtos. Estes microrganismos têm um potencial enorme na área da biotecnologia por serem uma fonte valiosa de metabolitos como pigmentos (ex. astaxantina, β-caroteno), proteínas (ex. ficocianina), lípidos (ex. ómega-3, DHA, EPA) e hidratos de carbono. Embora os seus compostos ativos apresentem vantagens relativamente aos produtos sintéticos ou outros produtos de fontes naturais, têm contudo, desvantagens a nível de custos (Borowitzka, 2013; Demirbas, 2011; Milledge, 2010). O maior desafio na aplicação das microalgas para fins comerciais tem sido minimizar os custos de produção e extração dos compostos, devido à complexidade da fase de cultivo e dos processos a jusante (ex. extração dos compostos de valor acrescentado). Entre os metabolitos de elevado valor acrescentado, a astaxantina (3,3’-dihidroxi-β,β’-caroteno-4,4’diona), carotenoide secundário, é considerada um composto valioso com um elevado número de aplicações, desde sectores alimentares, cosméticos a farmacêuticos. Este pigmento tem como fonte natural microalgas como Chlorella zofingiensis, Chlorococcum, Haematococcus pluvialis, leveduras vermelhas, Phaffia rhodozyma e bactérias, Paracoccus carotinifaciens. Haematococcus pluvialis, é considerada a maior fonte natural de astaxantina, podendo acumular até 6 % do seu peso seco e é a melhor fonte natural de astaxanthina para consumo humano (Ambati et al., 2014; Lorenz, 1999; Olaizola, 2003; Yuan et al., 2010). A acumulação de carotenoides secundários, como a astaxantina, é uma característica de resposta ao stress de certas microalgas como é o caso de H. pluvialis. Quando há privação de nutrientes, aumento da intensidade luminosa, salinidade, etanol e hormonas entre outros fatores desfavoráveis ao crescimento da microalga, esta começa a induzir (Sarada et al., 2002a; Su et al., 2014; Zhang et al., 2014). A fase de indução, também conhecida como fase vermelha, corresponde à produção e acumulação da astaxantina, essencial para H. pluvialis sobreviver a condições adversas (Hagen et al., 2002; Wayama et al., 2013). Devido às flutuações das condições de stress que podem ser aplicadas para iniciar o processo de indução, todas as estratégias devem ser otimizadas para que a acumulação de astaxantina seja o mais reprodutível possível. O desenvolvimento de novas tecnologias para produção de microalgas, em sistemas abertos (ex. raceways) e sistemas fechados (ex. fotobioreactores), assim como a otimização das condições de cultivo (um ou duas fases de produção) têm maximizado o crescimento e a produção de biomassa, teor de pigmentos e outros produtos, reduzindo os custos de produção à escala industrial (Der Rio et al., 2007; Fábregas et al., 2001; Shah et al., 2016). Contudo, existem ainda muitos desafios e problemas na produção a grande escala de H. pluvialis. A otimização não tem de ser restrita ao melhoramento das condições de cultivo e aos sistemas de produção. O melhoramento do desempenho das estirpes de H. pluvialis também tem sido alvo de estudos recentes. Para aumentar o conteúdo de astaxantina acumulado, as células podem ser submetidas a agentes mutagénicos químicos, como etil-metano-sulfanato (EMS) ou N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), ou agentes físicos, como radiação ultravioleta ou raio-X (Chen et al., 2003; Kamath et al., 2008; Tjahjono et al.,1994; Tripathi et al., 2001). Mutações mais direcionadas também foram aplicadas a estas microalgas, como modificações genéticas (Forján et al., 2015; Sharon-Gojman et al., 2015). O trabalho desenvolvido no âmbito desta tese teve como principal objetivo o melhoramento de estirpes de H. pluvialis, pertencentes à coleção de microalgas da empresa A4F, para aumentar o teor intracelular de astaxantina. Para o melhoramento das estirpes foram utilizadas três abordagens: (i) caracterização de diferentes estirpes para posterior seleção daquelas que apresentaram desempenho superior; (ii) separação física (cell sorting) de subpopulações de células com aumento da produção de astaxantina, por citometria de fluxo e (iii) mutagénese aleatória por irradiação com UV-C e seleção de mutantes. Neste trabalho foram inicialmente utilizadas sete estirpes de H. pluvialis (HP_01 to HP_07) cultivadas numa estratégia experimental em três fases: na primeira fase de crescimento vegetativo ou fase verde, as diferentes estirpes foram crescidas em condições ótimas durante 7 dias, avaliando-se e comparando as taxas de crescimento e produtividade da biomassa; na segunda fase de indução ou fase vermelha, aplicaram-se dois fatores de stress, privação de nutrientes e aumento da intensidade luminosa (150 μmol.m-2.s-1), durante 17 dias, analisando-se a produtividade e a acumulação máxima de astaxatina nas diferentes estirpes; na terceira fase aplicou-se um stress salino adicional, analisando-se o seu impacto na biomassa e no conteúdo máximo de astaxantina das culturas já induzidas. Esta caracterização integrativa enfocou um número de propriedades fisiológicas das microalgas, com a intenção de avaliar completamente a evolução e heterogeneidade de sua vitalidade e capacidade de acumulação de astaxantina. Os parâmetros avaliados foram: contagem de células, peso seco, produtividade e viabilidade de biomassa e análise de pigmentos. Os resultados obtidos no decurso deste trabalho permitiram caracterizar as diferentes estirpes de H. pluvialis e selecionar as que apresentaram as melhores características relativamente à taxa de crescimento e produtividade de biomassa na fase de crescimento, e com especial interesse à sua produtividade e teor em astaxantina na fase de indução. Das sete, destacaram-se as estirpes HP_02 e HP_03, que durante a fase de crescimento apresentaram elevadas taxas de crescimento (0,52 e 0,58 dia-1, respetivamente) e produtividades similares de biomassa comparativamente às outras estirpes (0,27 e 0,22 g.L-1.dia-1, respetivamente). HP_02 e HP_03, obtiveram o maior conteúdo de astaxantina acumulado (3,8 % e 4,4 % respetivamente), e registaram produtividades de astaxanina elevadas, (2,31 e 2,58 mg.g-1.dia-1 respetivamente), superiores às outras estirpes estudadas. As duas estirpes foram submetidas a cell sorting para enriquecimento de sobre-produtores de astaxantina. Ambas as estirpes apresentaram desempenhos semelhantes e não foram consideradas particularmente relevantes propriedades específicas das células. A estirpe HP_03 foi ainda sujeita a mutagénese aleatória por exposição à radiação UV-C de modo a promover a heterogeneidade na população celular. Os pigmentos fotossintéticos presentes nas microalgas são clorofilas e carotenóides, e a sua concentração intracelular depende das condições de cultivo. Esta concentração está linearmente correlacionada com a fluorescência dos pigmentos, o principal componente da fluorescência endógena (autofluorescência) (Hyka et al., 2013). Assim, a intensidade de autofluorescência foi utilizada para a identificação e quantificação de pigmentos de microalgas por citometria de fluxo. Esta metodologia permitiu ainda detetar alterações no estado fisiológico das células; a morfologia, incluindo tamanho e complexidade celular dependem das condições de cultivo e estão correlacionadas com os dois sinais de dispersão da luz, medidos por citometria, nomeadamente dispersão direta (FSC) e ortogonal (SSC). A acumulação de astaxantina das 7 estirpes, foi monitorizada por citometria de fluxo, no início e ao longo da fase de indução, assim como foi seguida a evolução do estado fisiológico das células. É de salientar que os resultados da quantificação de astaxantina por citometria de fluxo (valores médios das intensidades de fluorescência) foram consistentes com os determinados pelo método de extração de pigmentos totais, confirmados pela forte correlação linear encontrada (r = 0,98) entre o conjunto completo de valores dos dois parâmetros. Demonstrou-se assim que, a autofluorescência da astaxantina é um bom indicador da sua acumulação intracelular, podendo ser monitorizada em tempo real por citometria de fluxo. Para concluir a fase de caracterização das estirpes, os resultados obtidos após adição de NaCl (10 g/L) mostraram que o aumento do conteúdo de astaxantina não é estatisticamente significativo, à exceção de HP_01 que obteve um aumento de 2,5 % para 3,4 % (p < 0,001). A aplicação do stress salino adicional, ainda que apenas durante um curto período de tempo, 1 a 2 dias, determinou um aumento do teor de astaxantina, começando as culturas a perder biomassa após o terceiro dia, e como tal teve efeitos negativos no conteúdo de astaxantina acumulado. A maior produtividade global de astaxantina foi obtida pelas estirpes HP_02 e HP_03, atingindo 1,63 e 1,88 mg.g-1.dia-1, respetivamente. Este valor foi baseado no tempo essencial para as estirpes alcançarem o valor máximo de astaxantina, incluindo as duas fases de cultivo durante 24 dias. A partir das culturas selecionadas, HP_02 e HP_03, o isolamento de subpopulações de células de interesse, com alta recuperação e alto grau de pureza, não foi alcançado, devido à homogeneidade das populações das estirpes analisadas, e devido à impossibilidade técnica do dispositivo de sorting. Como terceira abordagem para o melhoramento das estirpes, a HP_03 foi selecionada, realizou-se mutagénese aleatória por exposição à radiação ultravioleta (UV-C), criando condições propícias a que as células sofressem alterações genéticas de modo a potenciar a produção de astaxantina. O efeito letal da exposição à radiação foi estudado analisando a viabilidade celular por citometria de fluxo, usando como fluoróforo um oxonol [DiBAC4(3)], que responde ao potencial de membrana. Os resultados obtidos permitiram seguir a evolução da viabilidade celular com o aumento do tempo de exposição à radiação, observando-se uma despolarização progressiva da membrana, que terminou ao fim de 100 s de exposição por uma dissipação generalizada do potencial. No entanto, nos resultados obtidos pela análise de citometria de fluxo, não foi notável um aumento da heterogeneidade populacional, mantendo-se a dificuldade da realização do sorting das células com maior conteúdo de astaxantina. Este ensaio preliminar de mutágenese aleatória apresentou resultados promissores, na medida em que um dos mutantes isolados, Mut 2, atingiu valores superiores de astaxantina, 4,1 % por peso seco, relativamente ao controlo que obteve 3,1 % de astaxantina, para o mesmo período de tempo. Uma vez que as estirpes selecionadas apresentaram um desempenho análogo e uma homogeneidade populacional, torna-se difícil identificar propriedades celulares ou respostas ao stress que possam ser particularmente relevantes para o melhoramento das estirpes com vista a uma maior acumulação de astaxantina. Deverão realizar-se novos estudos com recurso a estirpes com maior heterogeneidade, que possibilitem o isolamento das células com as propriedades desejadas, e as configurações do citómetro de fluxo e do dispositivo de sorting devem ser otimizadas de modo a permitir separação física (cell sorting) de subpopulações de células com aumento da produção de astaxantina, com alta recuperação e alto grau de pureza

Liquid-Phase Peptide Synthesis Optimisation: Selection of Quenching Reagents and Peptide Solubility Estimation

With the increasing demand on peptides market, the peptide synthesis process must be kept upgraded. Therefore, the focus of this project is the optimisation of liquid-phase peptide synthesis. During peptide synthesis, the by-products and the amino acid excess must be kept controlled to not interfere with the main reactions and, consequentially, with the final product yield and purity. In order to achieve this, a quenching reagent is added to inactivate the amino acid in excess. An optimisation study was performed for the quenching reaction, where it was found that 2 or 3 amino acids equivalents reacting with 2.1 quenching reagent equivalents allowed the best conditions for a controlled reaction. From there, with the conditions established, three reagents – piperidine, aniline, thiomalic acid – were used in the quenching reaction, where the quenching efficiency was evaluated by the quenching rate constant (kq). The kq values for piperidine, thi-omalic acid and aniline we deduced to 2.962, 1.849, and 0.020 min-1 respectively. Piperidine was then determined as the best quenching reagent, followed by thiomalic acid and aniline, respec-tively. The second problem of peptide synthesis that this project approached, was the determina-tion of the peptide solubility. Currently, the solubility of peptides is measured experimentally, which is a time-consuming and wasteful process once it needs to be measured in different sol-vents, thus increasing the process cost. The second part of the project investigated two theoretical approaches – Solubility Param-eters and COSMO-RS – to predict the best and worst solvents for free peptides and peptides attached to a hub (wang and rink amide nanostar). DMSO was found the best solvent for most of the peptides, followed by NFM, which also presented itself as the best green solvent. The valida-tion of the COSMO-RS method was tested and exhibited a RMSE of between 1.10 – 0.74 loga-rithmic units. Therefore, this model is presented as a tool to be implemented in determining the solubility of the amino acids.O aumento da procura de mercado por peptídeos obriga a constante otimização do seu processo de síntese. Assim, o foco deste projeto é a otimização da síntese de peptídeos em fase líquida. Durante o processo, os by-products e os aminoácidos em excesso devem ser controlados, de forma a não afetar o rendimento e a pureza do produto final. Para tal, é necessário proceder à sua inativação com a adição de um reagente. A primeira parte deste projeto apresenta um estudo das condições ótimas para a reação de inativação, que determinou-se sendo 2 ou 3 equivalentes de aminoácido a reagir com 2.1 equivalentes de reagente. Com base nas condições estabelecidas, três reagentes – piperidina, anilina e ácido tiomálico - foram testados e avaliados pelas constante de inativação (kq). Os valores de kq obtidos foram 2.962, 1.849, e 0.020 min-1 respetivamente à piperidina, ácido tiomálico e anilina. Visto que a piperidina apresentou os melhores resultados, a mesma foi reconhecida como o melhor reagente para a inativação dos aminoácidos. O segundo e principal problema da síntese de peptídeos abordado neste projeto é a determinação da solubilidade dos peptídeos. Atualmente, a solubilidade dos peptídeos é determinada experimentalmente, sendo um processo demorado e com elevado desperdício, uma vez que os peptídeos precisam de ser avaliados em diferentes solventes, tendo por consequência o aumento do custo do processo. Este projeto apresenta duas abordagens teóricas – Parâmetros de Solubilidade e COSMO-RS – que preveem quais os melhores e piores solventes para os peptídeos e para os peptídeos ligados à âncora, quer por ligantes wang ou rink amide. No geral, o DMSO mostrou-se como o melhor solvente, seguido pelo NFM, que também se apresentou como o melhor solvente verde. A validade do método COSMO-RS foi testada e exibiu um erro médio quadrático de entre 1.10 – 0.74 unidades logarítmicas. Deste modo, este modelo apresenta-se como uma ferramenta a implementar na determinação da solubilidade dos aminoácido

Bringing the biorefinery concept to the health-care facilities: use of industrial by-products against multi-drug resistant bacteria

Multi-drug resistant bacteria (MDRB) are a public health issue worldwide, being alternatives to the conventional failing antibiotherapy required. This fact has turned attention to bioactive compounds with antimicrobial activity features. These bioactives can be extracted from several biomasses sources, namely industrial by-products, within a biorefinery concept. The main objective of this Thesis was the design of a novel antiseptic formulation (AF), based on natural plant extracts, obtained from forest/agriculture industries by-products. The antimicrobial activities of three extracts from different sources were studied: Eucalyptus nitens total bark (ENTB) extract, Cynara cardunculus leaves (CcL) extract and dry olive pomace (DOP) extract. Those that presented better antibacterial activity were chosen to be included in the AF. Studies regarding formulation design and its antibacterial performance were made. ENTB extract was the one with better anti-MDRB performance, particularly against Staphylococcus spp., with minimal inhibitory concentrations between 64 and 2048 μg/mL, being included in the AF. The antibacterial activity of ENTB extract-based-AF presented promising results, achieving a 97±2% bacterial growth inhibition after exposure to 45% of AF. In conclusion, the developed AF presents potential to be further investigated, namely for hand sanitation within healthcare environment, but additional adjustments should be executed, namely in order to turn it more appellative to users

Understanding students’ academic achievement in public High School : evidence for Portugal

Dissertation presented as the partial requirement for obtaining a Master's degree in Information Management, specialization in Knowledge Management and Business IntelligenceSeveral papers and studies have been conducted to better understand what are the main factors that influence students’ academic achievement and what measures should be taken to improve it. Therefore, based on 383.560 students’ observations, evaluated on secondary Portuguese public schools in 2014/2015 academic year, the purpose of this study is to provide a new approach to the collected data by using Data Mining predictive models. The results show differences on the academic achievement among females and male students, where females got better academic results. Access to computer and Internet found to be powerful tools in education that students can explore to their benefit and show to have a positive influence on academic results. Students benefiting from financial social support prove to have a lower performance in academic achievement. Results also point to the fact that the number of reproves still has a great negative impact on students’ academic achievement. This is one of the first studies to the best of the authors knowledge to employ analytic techniques on such a large dataset on the context of academic achievement

The Terceira Rift, Azores: a melt inclusion study of submarine lavas

The Azores plateau, a bathymetric high, is seated on an anomalous mantle domain located in the Azores Triple Junction where the American, EUR and AFR lithospheric plates meet. The cause for these anomalies is controversial but many authors consider the presence of an anomalously hot/wet enriched mantle probably supplied by a plume [3]. The origin, size and present location of the plume is under debate but an area near Terceira is the favoured plume centre [2]. The Terceira Rift (TR) defines the EUR/AFR plate boundary of the Azores triple junction. The TR is a 550 km long, generally ESE trending line of volcanic massifs along the axis (e.g. São Miguel, D. João de Castro, Terceira and Graciosa) alternating with deep basins (e.g. Hirondelle basin) interpreted as volcanically unfilled rift valley segments [3]. Vesicular, porphyritic basalts were sampled along the Terceira Rift during Portuguese scientific cruises (EMEPC 2007-2009). Initial studies focused on the adjacent areas Don João de Castro - DJC (submarine volcano) and Hirondelle - Hir (basin). Major and trace element data of phenocrysts (olivine, clinopyroxene, plagioclase), groundmass and exposed melt inclusions found in these vesicular lavas depict only slight differences between the two sites. DJC samples depict higher Fo and Mg# in olivine and clinopyroxene, respectively. Chondrite-normalized REE data indicate that groundmass material is LREE-enriched in both Hir and DJC lavas. Exposed melt inclusions (MI) show similar REE patterns compared to their hosts. Clinopyroxene in both sites display L-MREE enriched, HREE depleted sinusoidal patterns. MI were found in olivine, clinopyroxene and plagioclase phenocrysts. MI are glassy to completely opaque and devitrified, with one or more bubbles, and sulfide globules (SG). SG are spherical, depict two-phase lamellar intergrowths of Fe-Ni and Cu-Fe phases, and are ubiquitous in DJC and Hir lava samples. Some lavas display SG within clinopyroxene-hosted MI and dispersed in the groundmass. Preliminary data suggest that lavas found in these areas of the Terceira Rift were sulfur-saturated in different stages of their evolution; during early fractionation and prior to eruption. The geochemistry of melt inclusion will contribute to the understanding of mantle source, melting and mixing processes in the Terceira Rift, Azores

Sensores em POF baseados em intensidade para a avaliação da qualidade de águas

Nowadays there is the need for low-cost and user-friendly solutions for water quality assessment which can allow for remote, in-site and real-time monitoring of water contaminants. POF sensing technologies combined with specially developed sensitive layers for chemical detection may offer these possibilities, with proper interrogation systems. POF sensing platforms based on low-cost procedures were developed and characterized using aqueous solutions of different refractive indices (RI). The POF RI sensors were optimized by varying the length and/or roughness of the sensing region. The suitability of these sensing platforms for chemical detection was evaluated through the coating with sensitive layers, namely molecularly imprinted polymers (MIPs) using different deposition techniques. The dependency of proteins immobilization on the POF’s surface was evaluated aiming future developments in chemical detection using POF biosensors. A D-shaped POF chemical sensor was successfully developed using a sensitive MIP layer, allowing the detection of perfluorooctanoate (POFA/PFO-) in aqueous media with a limit of detection of 0.20 – 0.28 ppb. The collaboration of researchers from different areas was essential for the success of the developed work.Hoje em dia há uma necessidade de soluções simples e de baixo custo para a avaliação da qualidade de águas e que permitam a monitorização remota de contaminantes, no local e em tempo real. As tecnologias baseadas em POF podem oferecer essa possibilidade através de sistemas de interrogação óptica adequados, combinados com camadas sensíveis especialmente desenvolvidas para detecção química. As plataformas ópticas baseadas em POF foram desenvolvidas e caracterizadas com soluções aquosas com diferentes índices de refracção. Os sensores foram optimizados através da variação do comprimento e/ou rugosidade da região sensível. A capacidade de detecção química das plataformas ópticas desenvolvidas foi avaliada através do revestimento com camadas sensíveis, nomeadamente polímeros molecularmente impressos (PMI), utilizando diferentes técnicas de deposição. A dependência da imobilização de proteínas na superfície de POFs modificadas foi avaliada com o objectivo de desenvolver biossensores para detecção química. Um sensor POF para detecção química, em configuração D-shape, foi desenvolvido com sucesso através do revestimento com um PMI, permitindo a detecção de perfluorooctanoato (POFA/PFO-) em soluções aquosas com um limite de detecção entre 0.20 – 0.28 ppb. A colaboração com investigadores de diferentes áreas foi essencial para o sucesso do trabalho desenvolvido.Programa Doutoral em Engenharia Físic

Infrared spectroscopy : a groundbreaking tool for monitoring mammalian cells’ processes

Fourier Transform Infrared (FTIR) spectroscopy is a high sensitive technique, which is able to detect vibrational modes of biomolecules, with a consequent world of applications. In the present work, the potential of this technique, working in the mid-infrared region (MIR), was explored for studying three distinct mammalian cells’ processes, working in a rapid, reagent free and in a high-throughput mode. FT-MIR spectroscopy was applied to monitor the expansion of human mesenchymal stem cells (hMSCs) in microcarriers and cultured in spinner flasks. It was possible to develop partial least squares (PLS) regression models to quantify, directly from the spectral data, key analytes, e.g., glucose, lactate and ammonia. Also, information about the cellular growth stage was possible to be extracted by the development of principal component analysis (PCA) models. Additionally, were developed PLS regression models for estimating the transfection efficiency in a cell population without the need for a reporter gene. The model is valid for two distinct cell lines, the adherent cell line AGS and the semi-adherent cell line HEK, both transfected with pVAX containing the GFP gene. Besides an accurate estimation of the transfection efficiency, it was also possible to extract some meaningful information about the biochemical cellular effect of the transfection reagent on cells and the transfection event itself, proving the sensitiveness of the technique. Finally, AGS cells infected with ten different Helicobacter pylori strains were analyzed based on FT-MIR spectral data. The different H. pylori strains presented different CagA/VacA genotypes, and were isolated from patients with different gastric pathologies (non-ulcer dyspepsia, peptide ulcer disease and gastric cancer). It was possible to differentiate cell samples according to the strain causing the infection, through PCA and cluster analysis.A espectroscopia de infravermelho é uma técnica extremamente sensível, com a capacidade de detetar modos vibracionais de biomoléculas, tendo, consequentemente, um mundo de aplicações. No presente trabalho esta técnica foi usada para estudar vários processos com recurso a células animais. A espectroscopia FT-MIR (do inglês Fourier transform mid-infrared region) foi utilizada para estudar a expansão de células mesenquimais estaminais (hMSCs) em microcarriers. Foi possível estimar a concentração de metabolitos chave para o crescimento celular, como a glucose, o lactato e a amónia, diretamente a partir de dados espectrais. Foi ainda possível inferir informação relativa ao ciclo celular das células em crescimento, através do desenvolvimento de modelos PCA (do inglês principal component analysis). Adicionalmente, desenvolveram-se modelos de regressão PLS (do inglês partial least squares) com o objetivo de estimar a eficiência de transfeção numa população de células. Trabalhou-se com duas linhas celulares distintas, uma linha aderente, AGS, e uma linha semiaderente, HEK, ambas transfetadas com o plasmídeo pVAX contendo o gene da GFP (do inglês green fluorescent protein). Para além de ter sido possível determinar, com elevada precisão, a eficiência de transfeção, independentemente do tipo de célula, foi ainda possível extrair informação extremamente relevante sobre o estado celular, nomeadamente o efeito da exposição ao reagente de transfeção e ainda alterações metabólicas resultantes do próprio evento de transfeção celular, provando a elevada sensibilidade da técnica. Por fim, estudou-se o efeito da infeção por Helicobacter pylori em células gástricas humanas, AGS. As células foram infetadas com dez estirpes diferentes de H. pylori, incluindo estirpes com diferentes genótipos CagA/VacA e isoladas de pacientes com diferentes patologias gástricas, como gastrite, úlcera e cancro gástrico. Foi ainda possível distinguir as células infetadas de acordo com a estirpe responsável pela infeção, quer através de modelos PCA, e ainda com recurso a algoritmos de agrupamento

Spirituality in Agri-food sector: a complementary vision of slow food principles

The goal of this paper is to develop a better understanding on the potential to recognise a fourth principle encompassed by the slow food movement – agri-food philosophy – supported in three factors: spirituality, socialization, and knowledge. Twenty-four national experts from business, administration and academic backgrounds have contributed their thoughts over three rounds: the first round was to auto-evaluate the degree of knowledge and the contributions of each expert, improving the design of the final questionnaire, which was answered in two successive rounds in a set of 105 statements. Statistical measures (arithmetic mean, standard deviation and coefficient of variation) were used. The results allowed to predict that until 2027 for the new principle purposed – Philosophical Dimension, the value of food will involve, the "training of taste" and the "wise gourmand" of food traditions and artisans. This scenario can occur in (89.4%) as a Socialization factor.On the other hand, based on the spirituality factor, the experts panel states that food associated with physical exercise and meditation will be, in 2027, the most important axes for achieving harmony of being. It will be a trend with the possibility of occurring around 82.8%.In contrast, one of the trends pointed out by the expert panel is that the food purchase decision will be based on individual beliefs. This trend has an 80.4% probability of occurring.Additionally, in 2027, the several forms of human sensations (e.g., smell, taste, vision) will influenced the perception of food consumption. This trend has an 76.5% probability of occurring.As a result of the knowledge factor, it was concluded that a standard of conduct assumed by all stakeholders will be possible based on full transparency (from raw materials to consumption) and access to true information. This trend can occur in 88.9%

Jazigos de sombra : o ritual da morte na performance contemporânea

Mestrado em Criação Artística ContemporâneaA morte e os seus rituais têm expressão espontânea e visível na performance artística contemporânea, ao contrário do que sucede no quotidiano da sociedade ocidental do século XXI, que promove a sua ocultação. Esta investigação tem como objectivo analisar dois casos de performance artística, Hermann Nitsch e Marina Abramovic, à luz de um corpo conceptual de análise centrado nos rituais da morte ocidentais. Para melhor compreensão deste processo, procura-se estabelecer a ligação entre ritual e performance. Dado que o ritual mantém igualmente uma relação de proximidade com a religião, pretende-se averiguar se, e de que modo, na performance artística contemporânea, a morte e os seus rituais conseguem atingir os propósitos de um ritual religioso. No decorrer desta pesquisa também se verifica que a intenção inicial da performance artística, que era unir a vida e a arte, permanece no domínio da utopia ABSTRACT: Death and its rituals have a visible and spontaneous expression in contemporary performance, as opposed to what happens in the daily routine of XXI century western society that hides it. This investigation aims to analyze two cases of performance, Hermann Nitsch and Marina Abramovic, according to a conceptual body of analysis centered in western death rituals. In order to have a better understanding of this process, the relation between ritual and performance is established. Because ritual is also closely connected with religion, this study seeks to acknowledge if and how death and its rituals are able to achieve the purpose of a religious ritual in contemporary performance. During this research it is verified that the original intention of performance, which was the union of life and art, remains in the realm of utopia

Spirituality, Socialization and Knowledge: a Philosophical Approach to the Slow Food Agri-food System

The goal of this paper is to develop a better understanding on the potential to recognise a fourth principle encompassed by the slow food movement – agri-food philosophy – supported in three factors: spirituality, socialization, and knowledge. Employing a Delphi method to forecast if this new principle might constitute a future trend in agri-food systems, in a ten years timeframe, twenty-four national experts from business, administration and academic backgrounds have contributed their thoughts over three rounds. The results allowed to predict several trends associated with each of the three factors. Firstly, regarding the Socialization factor, findings revealed the growing importance given to three trends: the value of food, the "training of taste" and the "wise gourmand" of food traditions and artisans. This scenario can occur in 89.4%. Secondly, and concerning the Spirituality factor, the panel of experts validated that food associated with physical exercise and meditation will be the most important axes for achieving harmony of being. This trend observes can occur 82.8%. Finally, and in relation to the Knowledge factor, it was concluded that a standard of conduct assumed by all stakeholders will be possible based on full transparency (from raw materials to consumption) and access to true information. This trend can occur in 88.9%. This research allowed to conclude that there is space to reflect on the importance of philosophical standpoints to forecast trends in future agri-food systems. More importantly, it can stimulate serious and deeply critical thinking about the current state of agri-food systems and contribute to help and develop new research approaches, on the need to promote changes, not only in lifestyles and food consumption, but mainly in establishing and improving more transparency in all types of agri-food systems