Transcriptional Insights for Spinal Cord Injury and Neural Precursor Cell Therapy: Toward a Novel Optogenetics-Based Treatment for cAMP Neuronal Induction

[ES] La lesión medular traumática (LM) se refiere a una condición neurológica en la que un insulto mecánico interrumpe la adecuada comunicación de impulsos nerviosos a través del sistema nervioso central (SNC), resultando en la pérdida de función locomotora por debajo del área lesionada. Lamentablemente, en la actualidad aún no existe cura efectiva para restaurar la funcionalidad después de una LM. La búsqueda de un tratamiento eficiente sigue siendo un gran desafío debido a nuestra aún incompleta comprensión de la multitud de procesos biológicos desencadenados por la lesión. La terapia celular destaca como la aproximación más recurrente para el tratamiento de la LM. En las últimas décadas, se han explorado varias estrategias celulares, siendo una de las más prometedoras el trasplante de células progenitoras neurales (CPN). Muchos estudios preclínicos demostrado el potencial del trasplante de CPN para proporcionar una recuperación motora en modelos animales, sin embargo, las mejoras funcionales en ensayos clinicos humanos son limitadas. Por lo tanto, aún se deben realizar esfuerzos para descubrir la cascada precisa de procesos moleculares a lo largo de la fisiopatología de LM, así como el mecanismo subyacente de los CPN. En ese contexto, el Capítulo 1 del presente trabajo tuvo como objetivo proporcionar una caracterización de los cambios en el perfil transcripcional medular a lo largo de las diferentes etapas temporales de una lesión severa contusiva. Además, hemos descrito el impacto transcripcional del trasplante de CPN en ratas lesionadas. Hemos demostrado que mientras la LM conllevó una fuerte desregulación de varios componentes de señalización de AMPc (entre ellos EPAC2), el trasplante de CPN pudo restaurar estas alteraciones transcripcionales. Para explorar el papel de EPAC2 en el mecanismo terapéutico mediado por CPN, realizamos un experimento de inhibición sostenida de EPAC2 mediante la administración de ESI-05. En comparación con los animales solo trasplantados, los animales CPN +ESI-05 mostraron un aumento en el área de cicatriz, una exacerbación de la polarización de la microglía hacia un perfil inflamatorio y una ampliación de la brecha de neuronas preservadas a lo largo de la lesión, sugiriendo que el trnasplante de CPN en el contexto de LM implican un mecanismo dependiente de EPAC2, reduciendo la neuroinflamación y proporcionando un entorno neuro-permisivo. El Capítulo 2 explora el potencial del AMPc para la regeneración de la LM. Hemos diseñado una estrategia innovadora para inducir AMPc en las neuronas corticoespinales a través de la activación optogenética de un adenilato ciclasa foto-inducible (bPAC). La estimulación optogenética en ratas con una hemisección dorsal torácica promovió una recuperación locomotora en comparación con el grupo control. Además, la estimulación de bPAC aumentó el número de neuronas marcadas retrógradamente desde el segmento lumbar tanto en la corteza motora como en la formación rafe-reticular, pero no en el núcleo rojo.La inmunotinción del tracto rafespinal mostró que la estimulación de bPAC aumenta el ratio de axones serotonérgicos caudales a la lesión correlacionando con una mejora funcional. Por último, la depleción del sistema serotoninérgico mediante la administración de 5,7-Dihydroxytryptamina suprimió la abolió la mejora mediada por bPAC, confirmando la implicación de la vía serotoninérgica en la recuperación de los animales estimulados. En resumen, se han proporcionado nuevos conocimientos sobre los cambios transcripcionales que ocurren a lo largo de la progresión de la LM y tras el trasplante de CPN, con énfasis en la señalización de AMPc. La manipulación optogenética de AMPc en las neuronas corticoespinales después de la LM ha demostrado ser efectiva para la recuperación funcional y permitido descubrir una ruta cortical alternativa a través del tracto descendente serotoninérgico[CA] Lesió medul·lar traumàtica (LM) es una condició neurològica en la qual un traumatisme interromp la comunicació adequada dels impulsos a través del sistema nerviós central (SNC), amb el resultat de la pèrdua de la funció locomotora per baix de la zona lesionada. Lamentablement, en l'actualitat encara no hi ha una cura efectiva per a restaurar completament la funcionalitat de la medul·la espinal després de la lesió. La recerca d'un tractament eficient per a la LM roman un repte complex a causa de la nostra comprensió encara incompleta de la gran quantitat de processos biològics desencadenats per la lesió primària. La teràpia cel·lular destaca com l'aproximació més recurrent per al tractament de la LM. En les dècades passades, s'ha explorat diverses estratègies basades en cèl·lules i una de les més prometedores és el trasplantament de cèl·lules progenitores neurals (CPN). Molts estudis preclínics han demostrat el potencial del trasplantament de CPN per proporcionar una recuperació motora en models animals, no obstant això, les millores funcionals en pacients humans tractats són limitades. Per tant, encara s'han de fer esforços per a descobrir la cascada precisa de processos moleculars al llarg de la fisiopatologia de la LM, així com el mecanisme subjacent dels CPN. El Capítol 1 del present treball va tindre com a objectiu proporcionar una caracterització dels canvis en el perfil transcripcional espinal al la llarga de les diferents etapes temporals de una lesió contusiva. A més, s'ha descrit l'impacte transcripcional del trasplantament d'CPN en animals lesionats. S'ha demostrat que mentre la LM va causar una forta desregulació de diversos components de senyalització de AMPc (sent EPAC2 el gen més regulat a la baixa), el transplantament de CPN van ser capaç de restaurar les alteracions derivades de la LM. Per a explorar el paper d'EPAC2 en el mecanisme terapèutic mediat per CPN, es va realitzar un experiment de inhibició sostinguda d'EPAC2 degut a l'administració d'ESI en animals lesionats. En comparació amb els animals només trasplantats, els animals CPN+ESI-05 van mostrar un augment de l'àrea de cicatriu, una exacerbació de la polarització de les micròglies cap a un perfil inflamatori i una ampliació de la bretxa de neurones preservades a través de la lesió.Aquests resultats suggereixen que el trasplantament de CPN en el context de la LM involucren un mecanisme depenent d'EPAC2, reduint la neuroinflamació i proporcionant un entorn més neuropermissiu. El Capítol 2 va tindre com objectiu explotar el potencial de regeneració de AMPc dissenyant una nova estratègia per a les induccions artificials de AMPc en les neurones corticoespinals mitjançant l'activació optogenètica d'una adenilat ciclasa fotoinduïble (bPAC). L'estimulació diària de AMPc en rates que pateixen una hemisècció dorsal toràcica va promoure una recuperació en comparació amb els control. L'estimulació de bPAC va augmentar el nombre de neurones marcades retrògradament des del segment lumbar, tant a l'escorça motora com a la formació rafe-reticular, però no al nucli roig. A més, la immunotinció del tracte rafespinal va mostrar que l'estimulació de bPAC va augmentar la ràtio d'axons serotoninèrgic cabals a la lesió, cosa que es va correlacionar significativament amb una millora dels paràmetres funcionals. Finalment, la depleció del sistema serotoninèrgic mitjançant l'administració de 5,7-Dihydroxytryptamina va abolir la millora mediada per bPAC, confirmant la implicació de la via serotoninèrgica en la recuperació. En resum, la investigació ha proporcionat coneixements sobre els canvis transcripcionals que tenen lloc a la llarga de la progressió de la LM i després del trasplantament de CPN, amb un èmfasi especial en la senyalització d'AMPc. La manipulació optogenètica d'AMPc a les neurones corticoespinals després de la LM ha demostrat ser efectiva per a la recuperació funcional i ha permès descobrir una ruta cortical alternativa a través del tracte descendent serotoninèrg[EN] Traumatic spinal cord injury (SCI) refers to a neurological condition in which a mechanic insult disrupts the proper communication of the impulses through the central nervous system (CNS), resulting on the loss of locomotor function below the injured area. Unfortunately, nowadays there is still no effective cure to completely restore the functionality of the spinal cord after the injury. Cell therapy is the most recurring approach for SCI treatment. In the past decades several cell-based strategies have been explored, being one of the most promising the transplantation of neural progenitor cells (NPCs). Many pre-clinical studies evidenced the potential of the NPCs transplantation to provide a substantial motor recovery in animal models, yet functional improvements in clinical trials have been limited. Therefore, efforts still need to be made in disclosing the precise cascade of molecular processes along SCI pathophysiology as well as the NPCs underlying mechanism. In that context, Chapter 1 of the present work aimed to provide a comprehensive characterization of the spinal transcriptional changes along the different temporal stages of rats suffering a severe contusive injury. Additionally, we have described the transcriptional impact of acute and subacute NPCs transplantation in injured animals. Interestingly we have shown that while SCI caused a strong dysregulation of several cAMP-signaling components (being EPAC2 the most downregulated gene), NPCs was able to restore SCI-derived alterations over this pathway with EPAC2 significant upregulation. In order to further explore EPAC2 role in NPCs-mediated therapeutical mechanism we performed a loss-of-function experiment by sustained EPAC2 inhibition via ESI-05 administration along with NPCs transplantation after SCI. Compared with only transplanted animals, NPCs+ESI-05 animals showed increased scar area, exacerbated microglia polarization into an inflammatory profile and widened gaps of preserved neurons across the lesion. Overall, these results suggest that NPC therapeutic mechanisms in the context of SCI involve an EPAC2-dependent mechanism, reducing neuroinflammation and providing a neuro-permissive environment. Chapter 2 aimed to further explore cAMP potential for SCI regeneration. We designed a novel strategy for artificial cAMP inductions in corticospinal neurons via optogenetic activation of a photoinducible adenylyl cyclase (bPAC). Daily optogenetic cAMP stimulation in rats suffering a thoracic dorsal hemisection, which completely disrupt the dorsal aspect of the corticospinal tract (CST), promoted and early and sustained locomotor recovery compared to non-treated control animals. We have shown that bPAC stimulation increased the number of retrograde traced neurons from the lumbar segment both in the motor cortex and the raphe-reticular formation, but not in the red nuclei. Moreover, immunolabelling of the raphespinal tract by 5-HT showed that bPAC stimulation increased the ratio of descending serotoninergic axons caudal to the injury which significantly correlated with improved functional parameters. Our results from corticobulbar projection study, WGA trans-synaptic tracing, and P-CREB analysis suggest that bPAC modulation of cortico-serotonergic pathway might occurs at the brainstem level. Lastly, the serotonergic system depletion by 5,7-Dihydroxytryptamine administration suppressed bPAC-mediated recovery, confirming the implication of the serotonergic tract in the recovery of stimulated animals. In summary, our research has provided new insights into the transcriptional changes that occur along SCI progression and after NPCs transplantation with a special emphasis on cAMP signaling. Optogenetic cAMP manipulation in corticospinal neurons after SCI has proven to be effective for functional recovery and allowed to unveil a cortical rerouting pathway through the serotonergic descending tract.This research was funded by FEDER/Ministerio de Ciencia e Innovación – Agencia Estatal de Investigación [RTI2018-095872-BC21/ERDF]. Part of the equipment employed in this work was funded by Generalitat Valenciana and cofinanced with ERDF funds (OP ERDF of Comunitat Valenciana 2014– 2020) and the UE; Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) incluido en el Programa Operativo FEDER de la Comunidad Valenciana 2014-2020. B. MartinezRojas was supported by a grant from the Conselleria de Educación, Investigación, Cultura y Deporte de la Generalitat Valenciana and the European Social Fundation ACIF/2019/120.Martínez Rojas, B. (2024). Transcriptional Insights for Spinal Cord Injury and Neural Precursor Cell Therapy: Toward a Novel Optogenetics-Based Treatment for cAMP Neuronal Induction [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/20297

Evaluation of IT resources for the learning and professional experience of engineering students

The adaptation and implementation of the European Higher Education Area (EEES) [1] has meant an important change in university teaching models. These changes include the use of Information and Communication Technologies (ICT), continuous assessment and participatory teaching in which the student is placed as an active element in the teaching-learning process. ICT are offering new tools that allow students to discover, construct and transform their knowledge in a different way to how it has traditionally been done [2,3], where the expository method or master class was the only teaching methodology and the student achieves specific disciplinary competences in isolation, ignoring systemic and transversal, personal and participative competences, which are very relevant for students in the field of engineering [4]. The purpose of this work is to study the attitudes of engineering students towards the use of computers as a tool for learning at university and for their future employment. To achieve this purpose, more than 200 engineering students will be asked to answer a questionnaire that takes several aspects that are relevant both for the learning process and for their future career into account. The questionnaire has been implemented in Google Form to facilitate the response process, as well as to facilitate the process of analysis and extraction of information from the results obtained. Once the answers have been obtained, they will be analysed with the aim of finding out the different resources used by the students and those that will be necessary for their future employment

Analysis of forearm muscles activity by means of new protocols of multichannel EMG signal recording and processing

Los movimientos voluntarios del cuerpo son controlados por el sistema nervioso central y periférico a través de la contracción de los músculos esqueléticos. La contracción se inicia al liberarse un neurotransmisor sobre la unión neuromuscular, iniciando la propagación de un biopotencial sobre la membrana de las fibras musculares que se desplaza hacia los tendones: el Potencial de Acción de la Unidad Motora (MUAP). La señal electromiográfica de superficie registra la activación continua de dichos potenciales sobre la superficie de la piel y constituye una valiosa herramienta para la investigación, diagnóstico y seguimiento clínico de trastornos musculares, así como para la identificación de la intención movimiento tanto en términos de dirección como de potencia. En el estudio de las enfermedades del sistema neuromuscular es necesario analizar el nivel de actividad, la capacidad de producción de fuerza, la activación muscular conjunta y la predisposición a la fatiga muscular, todos ellos asociados con factores fisiológicos que determinan la resultante contracción mioeléctrica. Además, el uso de matrices de electrodos facilita la investigación de las propiedades periféricas de las unidades motoras activas, las características anatómicas del músculo y los cambios espaciales en su activación, ocasionados por el tipo de tarea motora o la potencia de la misma. El objetivo principal de esta tesis es el diseño e implementación de protocolos experimentales y algoritmos de procesado para extraer información fiable de señales sEMG multicanal en 1 y 2 dimensiones del espacio. Dicha información ha sido interpretada y relacionada con dos patologías específicas de la extremidad superior: Epicondilitis Lateral y Lesión de Esfuerzo Repetitivo. También fue utilizada para identificar la dirección de movimiento y la fuerza asociada a la contracción muscular, cuyos patrones podrían ser de utilidad en aplicaciones donde la señal electromiográfica se utilice para controlar interfaces hombre-máquina como es el caso de terapia física basada en robots, entornos virtuales de rehabilitación o realimentación de la actividad muscular. En resumen, las aportaciones más relevantes de esta tesis son: * La definición de protocolos experimentales orientados al registro de señales sEMG en una región óptima del músculo. * Definición de índices asociados a la co-activación de diferentes músculos * Identificación de señales artefactuadas en registros multicanal * Selección de los canales mas relevantes para el análisis Extracción de un conjunto de características que permita una alta exactitud en la identificación de tareas motoras Los protocolos experimentales y los índices propuestos permitieron establecer que diversos desequilibrios entre músculos extrínsecos del antebrazo podrían desempeñar un papel clave en la fisiopatología de la epicondilitis lateral. Los resultados fueron consistentes en diferentes ejercicios y pueden definir un marco de evaluación para el seguimiento y evaluación de pacientes en programas de rehabilitación motora. Por otra parte, se encontró que las características asociadas con la distribución espacial de los MUAPs mejoran la exactitud en la identificación de la intención de movimiento. Lo que es más, las características extraídas de registros sEMG de alta densidad son más robustas que las extraídas de señales bipolares simples, no sólo por la redundancia de contacto implicada en HD-EMG, sino también porque permite monitorizar las regiones del músculo donde la amplitud de la señal es máxima y que varían con el tipo de ejercicio, permitiendo así una mejor estimación de la activación muscular mediante el análisis de los canales mas relevantes.Voluntary movements are achieved by the contraction of skeletal muscles controlled by the Central and Peripheral Nervous system. The contraction is initiated by the release of a neurotransmitter that promotes a reaction in the walls of the muscular fiber, producing a biopotential known as Motor Unit Action Potential (MUAP) that travels from the neuromuscular junction to the tendons. The surface electromyographic signal records the continuous activation of such potentials over the surface of the skin and constitutes a valuable tool for the diagnosis, monitoring and clinical research of muscular disorders as well as to infer motion intention not only regarding the direction of the movement but also its power. In the study of diseases of the neuromuscular system it is necessary to analyze the level of activity, the capacity of production of strength, the load-sharing between muscles and the probably predisposition to muscular fatigue, all of them associated with physiological factors determining the resultant muscular contraction. Moreover, the use of electrode arrays facilitate the investigation of the peripheral properties of the active Motor Units, the anatomical characteristics of the muscle and the spatial changes induced in their activation of as product of type of movement or power of the contraction.The main objective of this thesis was the design and implementation of experimental protocols, and algorithms to extract information from multichannel sEMG signals in 1 and 2 dimensions of the space. Such information was interpreted and related to pathological events associated to two upper-limb conditions: Lateral Epicondylitis and Repetitive Strain Injury. It was also used to identify the direction of movement and contraction strength which could be useful in applications concerning the use of biofeedback from EMG like in robotic- aided therapies and computer-based rehabilitation training.In summary, the most relevant contributions are:§The definition of experimental protocols intended to find optimal regions for the recording of sEMG signals. §The definition of indices associated to the co- activation of different muscles. §The detection of low-quality signals in multichannel sEMG recordings.§ The selection of the most relevant EMG channels for the analysis§The extraction of a set of features that led to high classification accuracy in the identification of tasks.The experimental protocols and the proposed indices allowed establishing that imbalances between extrinsic muscles of the forearm could play a key role in the pathophysiology of lateral epicondylalgia. Results were consistent in different types of motor task and may define an assessment framework for the monitoring and evaluation of patients during rehabilitation programs.On the other hand, it was found that features associated with the spatial distribution of the MUAPs improve the accuracy of the identification of motion intention. What is more, features extracted from high density EMG recordings are more robust not only because it implies contact redundancy but also because it allows the tracking of (task changing) skin surface areas where EMG amplitude is maximal and a better estimation of muscle activity by the proper selection of the most significant channels

Looking for the Why in Event Logs for Robotic Process Automation

The concept of Robotic Process Automation (RPA) has gained relevant attention in both industry and academia. RPA raises a way of automating mundane and repetitive human tasks requiring less intrusiveness with the IT infrastructure. Besides traditional user interviews and process document analysis, a common practice starts by observing the behavior of humans with the information systems while they perform the process to be automated. This sequence of human interactions with the user interface (i.e., mouse clicks and keystrokes) is stored in logs for later analysis. Analyzing these interactions brings significant benefits when conducting RPA projects. Nonetheless, some decision-based behaviors of humans require additional information to be explained. For example, a human may reject an invoice because some field is missing on a form. However, there is no interaction with that field since such information is not stored in the log. Therefore, this Ph.D. elaborates on a method to obtain additional information based on screenshots collected during the process execution. Some features are extracted from the screenshots to enrich the log, which is later used for classifying human decisions in a machine-and-human-readable form. The proposed method can be applied to generate advanced support in the RPA projects, e.g., producing an enhanced process analysis, supporting the robot development, or generating predictions and simulations. The approach has been validated using synthetic data where promising results were obtained.Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2019-105455GB-C31Ministerio de Educación y Formación Profesional FPU20/0598