Quantification of the in-vivo affinity of PI(4,5)P2 effectors and sensors with the phosphoinositide phosphatase Ci-VSP

Zusammenfassung Quantifizierung der in-vivo Affinität von PI(4,5)P2- Effektoren und Sensoren mit der Phosphoinositidphosphatase Ci-VSP Phosphoinositide (PI) sind Mitglieder einer Familie kleiner Membranphospholipide, die wichtige Aufgaben in vielen eukaryotischen Signaltransduktionswegen übernehmen. Das PI Phosphoinositid(4,5)biphosphat (PI(4,5)P2) z.B. ist vorwiegend in Plasmamembranen lokalisiert und reguliert viele zelluläre Funktionen, wie z.B. die Aktivierung von Proteinen (z.B. Ionenkanäle). In Anbetracht der Vielfalt zellulärer PI(4,5)P2 abhängiger Funktionen ist es unklar, wie eine Spezifität dieser Signalwege erzielt werden kann, so dass z.B. nur ein Teil potentieller Effektorproteine auf eine gegebene PI(4,5)P2 Konzentrationsänderung antwortet. Ein wichtiger Faktor, der die Spezifität der PI(4,5)P2-Signalwege in Bezug auf die verschiedenen Zielproteine bestimmt, ist die PI(4,5)P2-Affinität dieser Effektoren. Um den Einfluss dynamischer PI(4,5)P2 Konzentrationsänderungen auf Effektorproteine zu verstehen, ist es notwendig die PI(4,5)P2-Affinitäten dieser Proteine zu kennen. Jedoch fehlte den bisherigen Methoden das Potential, die PI(4,5)P2-Affinität der Effektoren (z.B. Ionenkanälen) unter physiologischen Bedingungen, wie z.B. in der lebenden Zelle, zu untersuchen. Deshalb müssen die PI(4,5)P2-Affinitäten vieler Proteine immer noch bestimmt werden. In dieser Studie wurde eine spannungsgesteuerte 5’ Phosphatase des Ascids Ciona intestinalis (Ci-VSP) als neues Werkzeug verwendet um die PI(4,5)P2- Affinitäten von Effektoren und Sensoren zu quantifizieren. Ionenkanäle stellen eine Klasse physiologisch relevanter PI(4,5)P2-Effektoren mit verschiedenen PI(4,5)P2- Affinitäten dar und ihre Regulation durch PIs war Gegenstand weitreichender Untersuchungen. Die Aktivität von einwärts rektifizierenden Kalium-(Kir) Kanälen wird z.B. durch die Bindung von PI(4,5)P2 reguliert. Deshalb wurden Kir-Kanäle als Modellsystem verwendet um abzuschätzen, wie gut Ci-VSP geeignet ist, die PI(4,5)P2-Affinität dieser Kanäle festzustellen. Kir-Ströme wurden während der Ci- VSP-Aktivität mit Hilfe von Whole-cell Patch-Clamp an CHO-Zellen und mit Hilfe von Zwei-Elektroden Voltage-Clamp an Xenopus laevis Oocyten abgeleitet. Die Kir- Ströme nahmen bei Depolarisation aufgrund der Ci-VSP-vermittelten PI(4,5)P2- iv Depletion ab und nahmen bei Repolarisation aufgrund der endogenen PI(4,5)P2- Resynthese wieder zu. Der Gleichgewichtszustand der Kanaldeaktivierung bei gradueller Ci-VSP-Aktivierung diente dem Auslesen des Grades der PI(4,5)P2- Affinität. Aufgrund ihrer verschiedenen Affinitäten musste die Ci-VSP unterschiedlich stark aktiviert werden um die untersuchten Kir-Kanäle zu deaktivieren. In Übereinstimmung mit früheren Studien wurde ermittelt, dass Kir2.1WT-Kanäle eine hohe, Kir1.1WT-Kanäle eine mittlere und Kir3-Kanäle eine niedrige PI(4,5)P2-Affinität haben. Ebenfalls wurde die reduzierte PI(4,5)P2-Affinität von Mutanten (z.B. R228Q in Kir2.1), die zu schweren Erkrankungen wie das Anderson Syndrom führen können, erfolgreich mit Hilfe der Ci-VSP detektiert. Genauso konnte erfolgreich die sich ändernde PI(4,5)P2-Affinität von Kir3-Kanälen bei Modulation durch Gβγ nachvollzogen werden. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Verwendung der Ci-VSP, verglichen mit früheren Methoden PI(4,5)P2-Level zu manipulieren und Protein- PI(4,5)P2-Affinitäten zu quantifizieren, eine graduelle und reversible Titration des endogenen PI(4,5)P2 in intakten Zellen erlaubt. Die Reliabilität der Ci-VSP wurde bekräftigt durch den Vergleich der erhaltenen Resultate mit einer unabhängigen Methode PI(4,5)P2 zu depletieren. Die Depletion wurde durch eine chemisch gesteuerte Membranrekrutierung einer 5’ Phosphatase, der Inp54p, erzielt. Die Ströme aller untersuchten Kir-Kanäle nahmen infolge der Inp54p-induzierten PI(4,5)P2-Depletion, ähnlich wie bei Ci-VSPAktivierung beobachtet, ab. Zuletzt wurde die Ci-VSP dazu verwendet die kontroversen PI(4,5)P2- Affinitäten zweier PI(4,5)P2-Bindungsdomänen (PLCδ1-PH-Domäne und tubby-CT) aufzulösen um ihre Tauglichkeit in Bezug auf die Visualisierung von PI(4,5)P2- Dynamiken in künftigen Studien abzuschätzen. Der dynamische Bereich des tubby- CT-Sensors stimmte mit dem physiologischen PI(4,5)P2-Konzentrationsbereich überein, welcher durch die Aktivität von KCNQ2-Kanälen in simultanen Messungen mit Patch-Clamp angezeigt wurde. Zusammengefasst zeigen die Resultate, dass Ci-VSP als neues Werkzeug geeignet ist zuverlässig PI(4,5)P2-Level in lebenden Zellen reversibel und graduell zu manipulieren. Ci-VSP erlaubt die quantitative Ermittlung von PI(4,5)P2-Sensitivitäten zellulärer Effektoren und genetisch kodierter fluoreszierender Sensoren von PI(4,5)P2-Signalwegen

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