Redox-linked proton transfer by cytochrome c oxidase

The respiratory chain is found in the inner mitochondrial membrane of higher organisms and in the plasma membrane of many bacteria. It consists of several membrane-spanning enzymes, which conserve the energy that is liberated from the degradation of food molecules as an electrochemical proton gradient across the membrane. The proton gradient can later be utilized by the cell for different energy requiring processes, e.g. ATP production, cellular motion or active transport of ions. The difference in proton concentration between the two sides of the membrane is a result of the translocation of protons by the enzymes of the respiratory chain, from the negatively charged (N-side) to the positively charged side (P-side) of the lipid bilayer, against the proton concentration gradient. The endergonic proton transfer is driven by the flow of electrons through the enzymes of the respiratory chain, from low redox-potential electron donors to acceptors of higher potential, and ultimately to oxygen. Cytochrome c oxidase is the last enzyme in the respiratory chain and catalyzes the reduction of dioxygen to water. The redox reaction is coupled to proton transport across the membrane by a yet unresolved mechanism. Cytochrome c oxidase has two proton-conducting pathways through which protons are taken up to the interior part of the enzyme from the N-side of the membrane. The K-pathway transfers merely substrate protons, which are consumed in the process of water formation at the catalytic site. The D-pathway transfers both substrate protons and protons that are pumped to the P-side of the membrane. This thesis focuses on the role of two conserved amino acids in proton translocation by cytochrome c oxidase, glutamate 278 and tryptophan 164. Glu278 is located at the end of the D-pathway and is thought to constitute the branching point for substrate and pumped protons. In this work, it was shown that although Glu278 has an important role in the proton transfer mechanism, its presence is not an obligatory requirement. Alternative structural solutions in the area around Glu278, much like the ones present in some distantly related heme-copper oxidases, could in the absence of Glu278 support the formation of a long hydrogen-bonded water chain through which proton transfer from the D-pathway to the catalytic site is possible. The other studied amino acid, Trp164, is hydrogen bonded to the ∆-propionate of heme a3 of the catalytic site. Mutation of this amino acid showed that it may be involved in regulation of proton access to a proton acceptor, a pump site, from which the proton later is expelled to the P-side of the membrane. The ion pair that is formed by the ∆-propionate of heme a3 and arginine 473 is likely to form a gate-like structure, which regulates proton mobility to the P-side of the membrane. The same gate may also be part of an exit path through which water molecules produced at the catalytically active site are removed towards the external side of the membrane. Time-resolved optical and electrometrical experiments with the Trp164 to phenylalanine mutant revealed a so far undetected step in the proton pumping mechanism. During the A to PR transition of the catalytic cycle, a proton is transferred from Glu278 to the pump site, located somewhere in the vicinity of the ∆-propionate of heme a3. A mechanism for proton pumping by cytochrome c oxidase is proposed on the basis of the presented results and the mechanism is discussed in relation to some relevant experimental data. A common proton pumping mechanism for all members of the heme-copper oxidase family is moreover considered.Respirationskedjan består av en samling membranproteiner som finns i det inre mitokondriemembranet hos däggdjur och andra högre organismer, och i plasmamembranet hos många bakterier. Enzymerna i respirationskedjan katalyserar de sista stegen i cellandningen, dvs. den process varmed kemisk energi utvinns ur olika födoämnen och omvandlas till ATP. Respirationskedjans enzymer lagrar den utvunna energin i formen av en elektrokemisk protongradient över membranet, som kan utnyttjas för att driva olika energikrävande processer i cellen, bl.a produktionen av ATP. Den elektrokemiska protongradienten upprätthålls av respirationskedjans enzymer genom att de transporterar protoner från den negativt laddade sidan (N-sidan) till den positivt laddade sidan (P-sidan) av membranet, emot protonernas koncentrationsgradient. Transporten av protoner drivs av den energi som frigörs när elektroner flyttas från ett enzym i respirationskedjan till ett annat, från en elektondonator med låg redox potential till en acceptor med högre redox potential och slutligen till syre. Cytokrom c oxidas är det sista enzymet i respirationskedjan. Enzymet katalyserar reduktionen av syre till vatten och använder energin från denna redox reaktion till att transportera protoner över membranet. Den exakta mekansimen för hur detta sker är ännu oklar, trots att det i år har förflutit 30 år sedan cytokrom c oxidas förmåga att transportera protoner upptäcktes. Cytokrom c oxidas innehåller två kanaler genom vilka protoner kan tas upp från N-sidan av membranet till närheten av det katalytiska centret, där reduktionen av syre till vatten sker. Den sk. K-kanalen förmedlar endast kemiska protoner, dvs. de protoner som konsumeras när vatten bildas. Den sk. D-kanalen förmedlar både kemiska protoner och de protoner som transporteras till P-sidan av membranet. Den här avhandlingen fokuserar på två specifika aminosyror i cytockrome c oxidas, glutamat 278 och tryptofan 164, och deras roll i transporten av protoner. Glu278 återfinns i slutet av D-kanalen nära det katalytiska centret. Glu278 har en viktig roll för funktionen av cytokrom c oxidas och anses utgöra den punkt där kemiska protoner avskiljs från de protoner som pumpas över membranet. I detta arbete kunde vi visa att trots att Glu278 är en viktig aminosyra är den inte absolut nödvändig för cytokrom c oxidas funktion. I ett försök att efterlika strukturen av vissa avlägset besläktade hem-coppar oxidaser byttes Glu278 och några aminosyror i dess absoluta närheten ut mot andra aminosyror genom mutagenes. Den förändrade strukturen stabiliserar bildandet av en lång kedja av vattenmolekyler, sammankopplade genom vätebindningar, genom vilken protoner kan transporteras från D-kanalen till det katalytiska centret även i avsaknad av Glu278. Den andra aminosyra som studerats in denna avhandling, tryptofan 164, bildar en vätebinding med ∆-propionaten på hem a3, som är en del av enzymets katalytiska center. Mutation av Trp164 visade att aminosyran indirekt påverkar tillförseln av protoner till en protonmottagare i närheten av hem a3:s ∆-propionat, varifrån protonerna senare förs till P-sidan av membranet. Hem a3:s ∆-propionat bildar tillsammans med arginin 473 en stark jonbinding. Experiment visar att jonbindningen troligen utgör en portliknande struktur som reglerar rörligheten av protoner till den yttre sidan av membranet. Samma port kan även vara en del av den rutt genom vilken vattenmolekyler som produceras vid det katalytiskta centret lämnar enzymet. De optiska och elektrometriska experiment med cytokrom c oxidas där Trp164 muterats till fenylalanin avslöjade ett hittills oupptäckt steg i transporten av protoner. Under den sk. A till PR transitionen i den katalytiska cykeln flyttas en proton från Glu278 till en protonmottagare någonstans i närheten av ∆-propionaten på hem a3. På basen av de resultat som presenteras i avhandlingen och tidigare resultat från vår forskningsgrupp ges ett förslag på en mekanism varmed cytokrom c oxidas pumpar protoner över membranet. Den föreslagna mekanismen diskuteras i förhållande till relevanta experiment. Avhandligen spekulerar även i huruvida samma mekanism för transport av protoner över membranet kan gälla för alla enzymer i den stora hem-coppar oxidasfamiljen dit cytokrom c oxidas hör

Språkbad som undervisningsprogram - Lärarreflektioner kring undervisningsmetoder och arbetssätt i åk 1

Tutkielmassani kartoitan kielikylpyopettajien opetusmenetelmiä ja työtapoja kielikylvyn 1. luokalla. Tavoitteenani on antaa kattava kuva kielikylpyopettajien luokkahuonetodellisuudesta sekä verrata tätä alan kirjallisuuteen ja teoriaan. Kielikylvyn teorian pohjalta olen työstänyt kolmiosaisen kyselylomakkeen, johon sain kahdeksan vastausta. Kyselylomakkeeni osat koostuvat kielikylvyn pääperiaatteista ja opetusmetodeista, kielen ja sisällön integroinnista sekä kielikylvyn työtavoista. Analyysissä käytän pääsääntöisesti laadullista tutkimusmenetelmää ja tavoitteeni on antaa kokonaislaatuinen kuva kielikylpyopettajien työtodellisuudesta. Analysoin 8 eri opettajan vastauksia. Koska analysoitavaa aineistoa on määrällisesti vähän, painotan tutkielmassani laadullista ja kuvailevaa lähestymistapaa. Tästä syystä annan tutkimusaineistoni pohjalta useita esimerkkejä, joita analysoin ja vertaan teoriaan. Tutkimustulokseni osoittavat että opetusmetodit ja työtavat, jotka aikoinaan olivat kielikylpyopetuksen peruskivet, ovat edelleen osa kielikylpyopettajien päivittäistä työtä. Jokainen teoriasta nostamani menetelmä sekä työtapa ovat osa vastaajieni opetustodellisuutta. Vastausteni perusteella voin todeta että eroavaisuudet opettajien kesken koskevat lähinnä eri menetelmien ja työtapojen käytön yleisyyttä. Tämä saattaa johtua siitä, että vastaajilla on eri tavoitteet menetelmille ja työtavoille. Myös oppilaat sekä luokkahenki voivat vaikuttavat eri menetelmien ja työtapojen yleisyyteen. Tutkimukseni perusteella voi todeta että kielikylpyopetus perustuu edelleenkin samojen periaatteiden pohjalle kuin kolmekymmentä vuotta sitten, kun Suomen ensimmäinen opetusryhmä aloitti kielikylvyssä. Vähäisestä vastausmäärästä johtuen en pysty yleistämään tutkimustuloksiani, mutta vastaajieni kesken tämä pitää paikkansa.fi=Opinnäytetyö kokotekstinä PDF-muodossa.|en=Thesis fulltext in PDF format.|sv=Lärdomsprov tillgängligt som fulltext i PDF-format

"Om de bara sett mina styrkor" : Riskbeteenden och riskfaktorer hos lagöverträdande unga män

Sammanfattning Arbetet är en del av projektet Young Euroman och syftet med undersökningen är att ta reda på vilka riskfaktorer och riskbeteenden som leder till att unga män bryter mot lagen. Målgruppen i arbetet är män i åldern 15-25. Med teori om riskfaktorer och riskbeteenden som bakgrund intervjuas unga män med fängelsedom och utgående från respondenternas svar reflekteras det kring åtgärder för att förebygga lagöverträdande beteende. Vi vill ta reda på ifall bakgrundsfaktorer i barndomen och ungdomen har påverkat männens livsval. Som datainsamlingsmetod används temaintervju och utgående från de svar som fås analyseras materialet och slutligen presenteras resultatet. På basis av respondenternas svar diskuteras förebyggande åtgärder mot en kriminell livsstil. Resultaten från intervjuerna överensstämmer med litteraturen i stora drag och det kan påvisas att bakgrundsfaktorer har en inverkan på individens livssituation i ett senare skede. De största riskfaktorerna för att utveckla ett kriminellt beteende hos respondenterna var sämre hemförhållanden och ett tidigt rusmedelsbruk. Riskbeteenden som oftast förekom bland respondenterna var likgiltiga attityder och spänningssökande. Centrala förebyggande åtgärder som nämndes var tidigare omhändertagande och stöd åt och av föräldrarna.Tiivistelmä Opinnäytetyö on osa projektia Young Euroman ja tutkimuksen tarkoitus on selvittää, mitkä taustatekijät voivat vaikuttaa nuorten miesten riskikäyttäytymiseen ja siihen, että he rikkovat lakia. Tämän tutkimuksen kohderyhmänä on 15–25 vuotiaat miehet. Tutkimuksen teoreettisessa osassa käsitellään riskikäyttäytymistä ja riskitekijöitä, joiden pohjalta haastattelemme nuoria rikostaustaisia miehiä. Meitä kiinnostaa, mikäli haastateltavien taustat ovat vaikuttaneet heidän nykyiseen elämäntilanteeseen, sekä miten haastateltavien mukaan rikollisuutta voisi parhaiten ennaltaehkäistä. Tiedonkeruumenetelmänä käytetään teemahaastattelua ja vastaukset analysoidaan temaattisella sisällönanalyysimenetelmällä. Vastaukset tiivistetään ja niiden perusteella keskustellaan rikollisuutta ennaltaehkäisevistä menetelmistä. Haastatteluista saadut tulokset tukevat suurimmaksi osaksi opinnäytetyömme teoreettista sisältöä ja selkeä yhteys taustatekijöiden vaikutuksesta yksilön myöhempään elämäntilanteeseen on havaittavissa. Puutteelliseet kotiolosuhteet ja aikainen päihteiden käyttö olivat haastateltaviemme joukossa yleisimmät rikolliseen elämäntapaan johtavat riskitekijät. Riskikäyttäytymiset, jotka useimmiten esiintyivät haastateltavien keskuudessa, olivat välinpitämättömyys ja jännityksenhaku. Keskeiset ennaltaehkäisevät menetelmät haastateltavien mukaan olisivat aikaisempi huostaanotto, sekä tukea vanhemmuuteen ja vanhemmilta.Abstract This thesis is part of the Young Euroman project. The aim of the study is to find out which risk behaviour and risk factors are more likely to cause men to break the law during adolescence. We will focus on young men between the ages of 15 and 25. Based on theory about risk behaviour and risk factors during adolescence, our aim is to interview young men with prison sentences. With the help of their answers, we shall discuss what kind of measurements are needed to prevent criminal behaviour. We are interested in knowing whether their life decisions have been influenced by different factors during their childhood and adolescence. A themed interview will be used as the method, and the answers will be the subject of our analysis. We will then present the results of the study. A discussion about what can be done to prevent criminal behaviour will be held based on the information we get from the respondents. The results of the study correspond to the theory and one could claim that different factors during childhood and adolescence have a certain impact on an individual later on in life. The biggest risk factors for young men in developing criminal behaviour are poor conditions at home and early substance abuse. The most common risk behaviour is a careless attitude and the search for excitement. The most important measures to be taken to prevent criminal behaviour is earlier help from the government, such as foster care and better support system to and from the parents

Neuroblastoma Cell Lines Contain Pluripotent Tumor Initiating Cells That Are Susceptible to a Targeted Oncolytic Virus

Although disease remission can frequently be achieved for patients with neuroblastoma, relapse is common. The cancer stem cell theory suggests that rare tumorigenic cells, resistant to conventional therapy, are responsible for relapse. If true for neuroblastoma, improved cure rates may only be achieved via identification and therapeutic targeting of the neuroblastoma tumor initiating cell. Based on cues from normal stem cells, evidence for tumor populating progenitor cells has been found in a variety of cancers.Four of eight human neuroblastoma cell lines formed tumorspheres in neural stem cell media, and all contained some cells that expressed neurogenic stem cell markers including CD133, ABCG2, and nestin. Three lines tested could be induced into multi-lineage differentiation. LA-N-5 spheres were further studied and showed a verapamil-sensitive side population, relative resistance to doxorubicin, and CD133+ cells showed increased sphere formation and tumorigenicity. Oncolytic viruses, engineered to be clinically safe by genetic mutation, are emerging as next generation anticancer therapeutics. Because oncolytic viruses circumvent typical drug-resistance mechanisms, they may represent an effective therapy for chemotherapy-resistant tumor initiating cells. A Nestin-targeted oncolytic herpes simplex virus efficiently replicated within and killed neuroblastoma tumor initiating cells preventing their ability to form tumors in athymic nude mice.These results suggest that human neuroblastoma contains tumor initiating cells that may be effectively targeted by an oncolytic virus

Elevated Proton Leak of the Intermediate OH in Cytochrome c Oxidase

The kinetics of the formation and relaxation of transmembrane electric potential (Δψ) during the complete single turnover of CcO was studied in the bovine heart mitochondrial and the aa3-type Paracoccus denitrificans enzymes incorporated into proteoliposome membrane. The real-time Δψ kinetics was followed by the direct electrometry technique. The prompt oxidation of CcO and formation of the activated, oxidized (OH) state of the enzyme leaves the enzyme trapped in the open state that provides an internal leak for protons and thus facilitates dissipation of Δψ (τapp ≤ 0.5–0.8 s). By contrast, when the enzyme in the OH state is rapidly re-reduced by sequential electron delivery, Δψ dissipates much slower (τapp > 3 s). In P. denitrificans CcO proteoliposomes the accelerated Δψ dissipation is slowed down by a mutational block of the proton conductance through the D-, but not K-channel. We concluded that in contrast to the other intermediates the OH state of CcO is vulnerable to the elevated internal proton leak that proceeds via the D-channel