The respiratory chain is found in the inner mitochondrial membrane of higher organisms and in the plasma membrane of many bacteria. It consists of several membrane-spanning enzymes, which conserve the energy that is liberated from the degradation of food molecules as an electrochemical proton gradient across the membrane. The proton gradient can later be utilized by the cell for different energy requiring processes, e.g. ATP production, cellular motion or active transport of ions. The difference in proton concentration between the two sides of the membrane is a result of the translocation of protons by the enzymes of the respiratory chain, from the negatively charged (N-side) to the positively charged side (P-side) of the lipid bilayer, against the proton concentration gradient. The endergonic proton transfer is driven by the flow of electrons through the enzymes of the respiratory chain, from low redox-potential electron donors to acceptors of higher potential, and ultimately to oxygen.
Cytochrome c oxidase is the last enzyme in the respiratory chain and catalyzes the reduction of dioxygen to water. The redox reaction is coupled to proton transport across the membrane by a yet unresolved mechanism. Cytochrome c oxidase has two proton-conducting pathways through which protons are taken up to the interior part of the enzyme from the N-side of the membrane. The K-pathway transfers merely substrate protons, which are consumed in the process of water formation at the catalytic site. The D-pathway transfers both substrate protons and protons that are pumped to the P-side of the membrane.
This thesis focuses on the role of two conserved amino acids in proton translocation by cytochrome c oxidase, glutamate 278 and tryptophan 164. Glu278 is located at the end of the D-pathway and is thought to constitute the branching point for substrate and pumped protons. In this work, it was shown that although Glu278 has an important role in the proton transfer mechanism, its presence is not an obligatory requirement. Alternative structural solutions in the area around Glu278, much like the ones present in some distantly related heme-copper oxidases, could in the absence of Glu278 support the formation of a long hydrogen-bonded water chain through which proton transfer from the D-pathway to the catalytic site is possible. The other studied amino acid, Trp164, is hydrogen bonded to the ∆-propionate of heme a3 of the catalytic site. Mutation of this amino acid showed that it may be involved in regulation of proton access to a proton acceptor, a pump site, from which the proton later is expelled to the P-side of the membrane. The ion pair that is formed by the ∆-propionate of heme a3 and arginine 473 is likely to form a gate-like structure, which regulates proton mobility to the P-side of the membrane. The same gate may also be part of an exit path through which water molecules produced at the catalytically active site are removed towards the external side of the membrane.
Time-resolved optical and electrometrical experiments with the Trp164 to phenylalanine mutant revealed a so far undetected step in the proton pumping mechanism. During the A to PR transition of the catalytic cycle, a proton is transferred from Glu278 to the pump site, located somewhere in the vicinity of the ∆-propionate of heme a3. A mechanism for proton pumping by cytochrome c oxidase is proposed on the basis of the presented results and the mechanism is discussed in relation to some relevant experimental data. A common proton pumping mechanism for all members of the heme-copper oxidase family is moreover considered.Respirationskedjan består av en samling membranproteiner som finns i det inre mitokondriemembranet hos däggdjur och andra högre organismer, och i plasmamembranet hos många bakterier. Enzymerna i respirationskedjan katalyserar de sista stegen i cellandningen, dvs. den process varmed kemisk energi utvinns ur olika födoämnen och omvandlas till ATP. Respirationskedjans enzymer lagrar den utvunna energin i formen av en elektrokemisk protongradient över membranet, som kan utnyttjas för att driva olika energikrävande processer i cellen, bl.a produktionen av ATP. Den elektrokemiska protongradienten upprätthålls av respirationskedjans enzymer genom att de transporterar protoner från den negativt laddade sidan (N-sidan) till den positivt laddade sidan (P-sidan) av membranet, emot protonernas koncentrationsgradient. Transporten av protoner drivs av den energi som frigörs när elektroner flyttas från ett enzym i respirationskedjan till ett annat, från en elektondonator med låg redox potential till en acceptor med högre redox potential och slutligen till syre.
Cytokrom c oxidas är det sista enzymet i respirationskedjan. Enzymet katalyserar reduktionen av syre till vatten och använder energin från denna redox reaktion till att transportera protoner över membranet. Den exakta mekansimen för hur detta sker är ännu oklar, trots att det i år har förflutit 30 år sedan cytokrom c oxidas förmåga att transportera protoner upptäcktes. Cytokrom c oxidas innehåller två kanaler genom vilka protoner kan tas upp från N-sidan av membranet till närheten av det katalytiska centret, där reduktionen av syre till vatten sker. Den sk. K-kanalen förmedlar endast kemiska protoner, dvs. de protoner som konsumeras när vatten bildas. Den sk. D-kanalen förmedlar både kemiska protoner och de protoner som transporteras till P-sidan av membranet.
Den här avhandlingen fokuserar på två specifika aminosyror i cytockrome c oxidas, glutamat 278 och tryptofan 164, och deras roll i transporten av protoner. Glu278 återfinns i slutet av D-kanalen nära det katalytiska centret. Glu278 har en viktig roll för funktionen av cytokrom c oxidas och anses utgöra den punkt där kemiska protoner avskiljs från de protoner som pumpas över membranet. I detta arbete kunde vi visa att trots att Glu278 är en viktig aminosyra är den inte absolut nödvändig för cytokrom c oxidas funktion. I ett försök att efterlika strukturen av vissa avlägset besläktade hem-coppar oxidaser byttes Glu278 och några aminosyror i dess absoluta närheten ut mot andra aminosyror genom mutagenes. Den förändrade strukturen stabiliserar bildandet av en lång kedja av vattenmolekyler, sammankopplade genom vätebindningar, genom vilken protoner kan transporteras från D-kanalen till det katalytiska centret även i avsaknad av Glu278.
Den andra aminosyra som studerats in denna avhandling, tryptofan 164, bildar en vätebinding med ∆-propionaten på hem a3, som är en del av enzymets katalytiska center. Mutation av Trp164 visade att aminosyran indirekt påverkar tillförseln av protoner till en protonmottagare i närheten av hem a3:s ∆-propionat, varifrån protonerna senare förs till P-sidan av membranet. Hem a3:s ∆-propionat bildar tillsammans med arginin 473 en stark jonbinding. Experiment visar att jonbindningen troligen utgör en portliknande struktur som reglerar rörligheten av protoner till den yttre sidan av membranet. Samma port kan även vara en del av den rutt genom vilken vattenmolekyler som produceras vid det katalytiskta centret lämnar enzymet. De optiska och elektrometriska experiment med cytokrom c oxidas där Trp164 muterats till fenylalanin avslöjade ett hittills oupptäckt steg i transporten av protoner. Under den sk. A till PR transitionen i den katalytiska cykeln flyttas en proton från Glu278 till en protonmottagare någonstans i närheten av ∆-propionaten på hem a3. På basen av de resultat som presenteras i avhandlingen och tidigare resultat från vår forskningsgrupp ges ett förslag på en mekanism varmed cytokrom c oxidas pumpar protoner över membranet. Den föreslagna mekanismen diskuteras i förhållande till relevanta experiment. Avhandligen spekulerar även i huruvida samma mekanism för transport av protoner över membranet kan gälla för alla enzymer i den stora hem-coppar oxidasfamiljen dit cytokrom c oxidas hör
