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L'implication de l'ubiquiline-2 dans l'agrégation de TDP-43 et la pathogénèse de la sclérose latérale amyotrophique
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est la maladie du motoneurone la plus fréquente chez les adultes. Elle se caractérise par une perte progressive des motoneurones supérieurs et inférieurs menant à une paralysie et au décès entre deux à cinq ans après le début des symptômes. Environ 10% des patients ont une forme familiale (fSLA). Jusqu’à 15% des patients atteints de la SLA peuvent également présenter une démence fronto-temporale (DFT). La DFT se présente par des troubles de comportement et un changement de personnalité. Plusieurs gènes sont identifiés dans fSLA, incluant superoxide dismutase 1 (SOD1), TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43), Fused in sarcoma (FUS), optineurin (OPTN), Tank-binding kinase 1 (TBK1) et ubiquiline-2 (UBQLN2). Ces mutations ont mené à la compréhension de plusieurs mécanismes pathologiques. L’un des mécanismes les mieux décrit est la formation d’inclusions cytoplasmiques de TDP-43. Ces inclusions contiennent d’autres protéines telles qu’UBQLN2 et ubiquitine et représentent le marqueur neuropathologique classique de la maladie. UBQLN2 est une protéine impliquée dans le système de dégradation du protéasome (UPS) et l’autophagie. Des mutations dans le gène UBQLN2 ont été lié à l’agrégation de TDP-43 dans des cellules en culture. En revanche, nous possédons très peu de connaissances sur les mécanismes pathologiques impliquant UBQLN2. Dans cette thèse, nous avons utilisé des neurones en culture pour surexprimer les formes native et mutante d’UBQLN2 humain et pour étudier l’effet sur la délocalisation cytoplasmique et l’agrégation de TDP-43. La surexpression d’UBQLN2WT ou d’UBQLN2P497H entraînait une accumulation cytoplasmique et une agrégation de TDP-43. Puisque notre groupe a déjà démontré une interaction entre la sous-unité p65 de NF-κB et TDP-43, nous avons analysé l’activation du facteur NF-κB par la surexpression d’UBQLN2 WT ou P497H. Nous avons observé une activation du facteur avec l’expression des deux formes d’UBQLN2. Cette activation était dépendante de la MAPK p38 en réponse à un stress cellulaire et une accumulation cytoplasmique d’UBQLN2/TDP- 43. L’augmentation de l’activité de NF-κB causait une mort neuronale et celle-ci était réversible par le traitement des cellules avec la Withaferine A, un inhibiteur de NF-κB. Puisque nous avons déterminé qu’il y avait un effet synergique important sur l’agrégation de TDP- 43 par la surexpression d’UBQLN2, nous avons décidé de générer un nouveau modèle de souris transgénique avec mutation dans UBQLN2 et dans TDP-43. Les souris ont été générées par l’introduction du gène UBQLN2P497H sous le contrôle du promoteur du gène neurofilament lourd (NFH). Les souris simples transgéniques UBQLN2P497H étaient ensuite croisées avec nos souris TDP-43G348C précédemment décrites pour produire des souris double transgénique UBQLN2P497H; TDP-43G348C. Bien que les souris simples transgéniques UBQLN2P497H développaient seulement un trouble cognitif léger, les souris doubles transgéniques développaient les caractéristiques classiques de la SLA/DFT avec agrégation cytoplasmique de TDP-43, perte de motoneurones, dégénérescence axonale et atrophie musculaire, troubles moteurs et cognitifs et une gliose entourant les motoneurones. Nous avons ensuite utilisé ce modèle pour approfondir notre compréhension des mécanismes d’agrégation d’UBQLN2 et de TDP-43 et de leur rôle dans l’inflammation. Nous avons observé que les microglies provenant des souris doubles transgéniques étaient plus sensibles à la stimulation aux lipopolysaccharides (LPS) et que l’activité NF-κB était plus importante dans les cerveaux provenant des souris doubles transgéniques. Nos résultats ont également suggéré que l’agrégation d’UBQLN2 entraînait une séquestration d’ubiquitine, réduisant ainsi l’efficacité du protéasome et la clairance de TDP-43. D’ailleurs, l’augmentation du pool d’ubiquitine a permis d’améliorer l’efficacité du protéasome et favoriser le retrait de TDP-43 des agrégats et d’augmenter sa dégradation. En conclusion, cette thèse démontre un rôle important de la protéine UBQLN2 dans la délocalisation de TDP-43 sous formes d’agrégats en culture cellulaire et en modèle animaux. Cela suggère qu’UBQLN2 et TDP-43 possède un rôle synergique dans la physiopathologie de la SLA et dans la neuroinflammation qui leur est associée. Notre modèle double transgénique pourra certainement être utilisé pour tester des possibilités thérapeutiques. De plus, l’interaction entre UBQLN2 et TDP-43 pourrait être ciblé pour traiter la SLA/DFT.Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is the most common motor neuron disease in adults. It is characterized by progressive lost of upper and lower motor neurons leading to paralysis and eventually death from 2 to 5 years after the onset of the symptoms. Approximately 10% of the patients have a family history and the remaining patients have a sporadic form of the disease. Up to 15% also have fronto-temporal dementia (FTD) with prominent behavioral and personality changes. Numerous genes are known to be mutated in the familial form of the disease. This includes mutation in superoxide dismutase 1 (SOD1), TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43), Fused in sarcoma (FUS), optineurin (OPTN), Tank-binding kinase 1 (TBK1) and ubqiquilin-2 (UBQLN2). These mutations lead to various pathological mechanisms. One of the most defined mechanism is the formation of cytoplasmic aggregates of TDP-43. These inclusions are positive for other proteins such as UBQLN2 and ubiquitin and are the pathological hallmark of the disease. UBQLN2 plays a central role in the ubiquitin proteasome system (UPS). Mutations in UBQLN2 have been link to TDP-43 pathology in vitro. However, the mechanisms underlying TDP-43 pathology induced by UBQLN2 are still unknown. In this thesis, we used neurons in culture and overexpressed human UBQLN2WT and human UBQLN2P497H to study the interaction between TDP-43 and UBQLN2. We demonstrated that the overexpression of UBQLN2 species enhanced TDP-43 cytoplasmic accumulation and aggregation. Since TDP-43 is known to interact with the p65 subunit of the NF-κB transcriptional factor, we analyzed the effect of UBQLN2 overexpression on the p65 activation. We observed an increase in NF-κB activation in cells transfected with either UBQLN2WT or UBQLN2P497H. We observed that the hyperactivation of NF-κB was caused by the action of the p38 MAPK in response to cellular stress and UBQLN2/TDP-43 cytoplasmic accumulation. This increase in NF-κB activity enhanced motor neuron death which was reversible by treatment with Withaferin A, a known NF-κB inhibitor. Because we observed an important synergistic effect in TDP-43 aggregation with UBQLN2 overexpression, we decided to generate a new transgenic mouse model with mutations in both UBQLN2 and TDP-43. Mice were generated with the expression of UBQLN2P497H gene under the control of the neurofilament heavy (NFH) promoter. The single transgenic UBQLN2P497H were then bred with our previously described TDP-43G348C transgenic mice. Whereas the single UBQLN2P497H transgenic mice developed only mild cognitive impairment, the double transgenic UBQLN2P497H; TDP-43G348C mice developed typical features of ALS/FTD with important TDP- 43 cytoplasmic aggregation, motor neurons loss, axonal degeneration, muscle atrophy, as well as motor and cognitive symptoms and gliosis. We took advantage of our new generated double transgenic mice to analyze the interaction between UBQLN2 and TDP-43 and to study the effect of aggregation of both proteins on inflammatory pathways. We observed that microglia from double transgenic mice were hyperresponsive to intraperitoneal injection of lipopolysaccharide (LPS) and that NF-κB activity was increased in double transgenic mice. Our results also suggested that UBQLN2 up-regulation induced TDP-43 aggregation by the sequestering of ubiquitin proteins into aggregates and the reduction of the UPS efficacy. Thus, increasing the pool of ubiquitin promoted the UPS function with ensuing reduction of TDP-43 cytosolic accumulation. In conclusion, this thesis demonstrates an important role of UBQLN2 species in TDP-43 mislocalization and aggregation in vitro and in vivo. It also suggests that UBQLN2 and TDP-43 possess a synergic role in neuroinflammation. Certainly, our double transgenic mice could be used to study future therapeutic avenues and these mechanisms could be targeted to treat TDP-43- associated ALS/FTD pathology
CAPTURE ALS: The comprehensive analysis platform to understand, remedy and eliminate ALS
The absence of disease modifying treatments for amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is in large part a consequence of its complexity and heterogeneity. Deep clinical and biological phenotyping of people living with ALS would assist in the development of effective treatments and target specific biomarkers to monitor disease progression and inform on treatment efficacy. The objective of this paper is to present the Comprehensive Analysis Platform To Understand Remedy and Eliminate ALS (CAPTURE ALS), an open and translational platform for the scientific community currently in development. CAPTURE ALS is a Canadian-based platform designed to include participants\u27 voices in its development and through execution. Standardized methods will be used to longitudinally characterize ALS patients and healthy controls through deep clinical phenotyping, neuroimaging, neurocognitive and speech assessments, genotyping and multisource biospecimen collection. This effort plugs into complementary Canadian and international initiatives to share common resources. Here, we describe in detail the infrastructure, operating procedures, and long-term vision of CAPTURE ALS to facilitate and accelerate translational ALS research in Canada and beyond
MRI-guided histology of TDP-43 knock-in mice implicates parvalbumin interneuron loss, impaired neurogenesis and aberrant neurodevelopment in amyotrophic lateral sclerosis-frontotemporal dementia
Amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia are overlapping diseases in which MRI reveals brain structural changes in advance of symptom onset. Recapitulating these changes in preclinical models would help to improve our understanding of the molecular causes underlying regionally selective brain atrophy in early disease. We therefore investigated the translational potential of the TDP-43Q331K knock-in mouse model of amyotrophic lateral sclerosis-frontotemporal dementia using MRI. We performed in vivo MRI of TDP-43Q331K knock-in mice. Regions of significant volume change were chosen for post-mortem brain tissue analyses. Ex vivo computed tomography was performed to investigate skull shape. Parvalbumin neuron density was quantified in post-mortem amyotrophic lateral sclerosis frontal cortex. Adult mutants demonstrated parenchymal volume reductions affecting the frontal lobe and entorhinal cortex in a manner reminiscent of amyotrophic lateral sclerosis-frontotemporal dementia. Subcortical, cerebellar and brain stem regions were also affected in line with observations in pre-symptomatic carriers of mutations in C9orf72, the commonest genetic cause of both amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Volume loss was also observed in the dentate gyrus of the hippocampus, along with ventricular enlargement. Immunohistochemistry revealed reduced parvalbumin interneurons as a potential cellular correlate of MRI changes in mutant mice. By contrast, microglia was in a disease activated state even in the absence of brain volume loss. A reduction in immature neurons was found in the dentate gyrus, indicative of impaired adult neurogenesis, while a paucity of parvalbumin interneurons in P14 mutant mice suggests that TDP-43Q331K disrupts neurodevelopment. Computerized tomography imaging showed altered skull morphology in mutants, further suggesting a role for TDP-43Q331K in development. Finally, analysis of human post-mortem brains confirmed a paucity of parvalbumin interneurons in the prefrontal cortex in sporadic amyotrophic lateral sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis linked to C9orf72 mutations. Regional brain MRI changes seen in human amyotrophic lateral sclerosis-frontotemporal dementia are recapitulated in TDP-43Q331K knock-in mice. By marrying in vivo imaging with targeted histology, we can unravel cellular and molecular processes underlying selective brain vulnerability in human disease. As well as helping to understand the earliest causes of disease, our MRI and histological markers will be valuable in assessing the efficacy of putative therapeutics in TDP-43Q331K knock-in mice
Tissue-enhanced plasma proteomic analysis for disease stratification in amyotrophic lateral sclerosis
Motor Neurone Disease Association (Malaspina/Apr13/817–791). Wellcome
Trust support to a parallel study (Pathfinder Award, grant number 103208)
Intégration d'une méthode d'optimisation topologique dans le processus de CAO/FAO pour des pièces tridimensionnelles
Ce projet de maîtrise présente l'intégration d'une méthode d'optimisation topologique dans le processus de Conception et Fabrication Assistée par Ordinateur. Il fut réalisé dans le cadre d'un projet multidisciplinaire issu d'une collaboration entre le groupe de recherche en optimisation des structures de l'Université de Sherbrooke (OptiS) et l'Équipe de Recherche en Intégration CAO-Calcul de l'UQTR (ÉRICCA).Ce projet multidisciplinaire consiste à développer un gratuiciel multiplateforme d'optimisation des structures intégrant la CAO à l'optimisation afin de permettre le développement complet de pièces ou structures mécaniques en partant du modèle CAO initial, jusqu'au modèle CAO final optimisé. Deux objectifs principaux sont visés dans le cadre de ce projet de maîtrise. Premièrement, implanter la méthode d'optimisation topologique par homogénéisation (méthode SIMP) pour des structures quelconques en 3D. Deuxièmement, développer une méthode de lissage pour réduire le bruit présent sur le maillage optimisé résultant de l'optimisation topologique par la méthode SIMP. Nous avons atteint ces deux objectifs en développant un processus d'optimisation complètement automatique en sept étapes. Elles correspondent respectivement à la modélisation géométrique, l'entrée des données initiales du problème (conditions aux limites, matériau, etc.), la sous-division de la géométrie en sous-domaines de design et de non-design, le maillage automatique adapté aux sous-domaines multiples, l'optimisation topologique, le lissage du maillage de surface et finalement la reconstruction de la géométrie finale. Les résultats ont démontré que notre implantation de la méthode SIMP fonctionne et donne des résultats très intéressants qui s'apparentent aux résultats présentés dans la littérature. Néanmoins, le développement d'une méthode de lissage de triangulation basée sur les méthodes classiques a démontré que ces méthodes sont très mal adaptées à des maillages très bruités tels que ceux obtenus avec la méthode SIMP. En somme, ce projet a permis de faire un grand pas vers l'intégration complète de l'optimisation comme une étape à part entière du processus de CAO/FAO
Compression moulding of randomly-oriented strands thermoplastic composites: A study of the flow and deformation mechanisms
The compression moulding of Randomly-Oriented Strands (ROS) of pre-impregnated thermoplastic composites is a new process that enables forming of parts with high fibre volume content and relatively high mechanical properties that can compete with metallic alloys. With this process, parts with complex features, such as sharp corners, thickness variations, ribs and holes can be obtained in one single moulding step. This process usually requires very high pressure up to 120 bar and temperature around 400 °C to obtain good quality parts. In order to develop tools and protocols to aid predicting the required pressure and temperature to form complex parts, a deeper study of the governing flow and deformation mechanisms is required. This thesis proposes a four steps investigation of those mechanisms, with a focus on the macroscopic squeeze flow behaviour. This mechanism governs the filling of intricate part features and helps to predict the required pressure to avoid material short shots. First, an experimental characterization of the squeeze flow of unidirectional (UD) and ROS composites is presented. A simple numerical model was also developed based on existing literature, as a first step to extend the current knowledge on processing of UD thermoplastic composites to ROS. The results showed that current models fail to predict the squeeze flow of both UD and ROS composites under high pressure and large deformation. Second, an experimental investigation of the flow and deformation mechanisms was performed using X-Ray microtomography. A novel technique using marker strands coated with conductive silver paint was developed and successfully used to qualify and quantify the material evolution during squeeze flow at the meso-scopic and macro-scopic scale. The results were useful to observe and quantify some of the dominant flow and deformation mechanisms. Third, an experimental characterization of the inter-ply coefficient of friction was performed using an in-house developed testing apparatus. High temperature pull-through tests were performed on UD pre-impregnated plies under representative processing temperature, normal pressures and shear rates. The results showed that the coefficient of friction is highly dependent on the processing conditions and the test method. It increases with shear rate and decreases with applied pressure.Finally, a finite element model using an original Eulerian-Lagrangian approach was developed to predict the squeeze flow behaviour of ROS composites. A no-slip boundary condition was imposed at the tool platen interface. A smoothed yield stress behaviour was imposed for the composite melt viscosity for numerical implementation. The model was used to determine the material viscosity and yield stress of ROS composites made of different strand sizes. The results were in good agreement with the experimental data obtained for several test cases. Design charts were also generated using the model predictions. These charts provide simple guidelines to predict the pressure required to completely fill a part feature for a given strand size and feature dimensions.Le moulage par compression des composites thermoplastiques à bandes orientées aléatoirement est un nouveau procédé qui permet la mise-en-forme de pièces complexes ayant des taux de fibres élevés et de bonnes propriétés mécaniques pouvant rivaliser avec les alliages métalliques traditionnels. Ce procédé permet la mise-en-forme de pièces possédant des formes complexes, tel que des angles droits, des variations abruptes d'épaisseur, des raidisseurs et des trous, le tout en une seule étape de moulage. Ce procédé requiert habituellement une température de mise-en-forme relativement élevé et l'application de pressions élevées. Afin de développer des outils et des protocoles pour aider à prédire les pressions et températures nécessaires à la mise-en-forme de pièces complexes, une étude approfondie des mécanismes d'écoulement et de déformation du matériau est nécessaire. Cette thèse propose une étude en quatre étapes des mécanismes d'écoulement et de déformation, avec une emphase sur le mécanisme d'écoulement sous pression. Ce dernier régit le remplissage des régions complexes des pièces mise-en-forme et aide à prédire les pressions nécessaires pour éviter une mise-en-forme inadéquate et des zones vides.En premier lieu, une caractérisation expérimentale de l'écoulement sous pression de composites à fibres unidirectionnelles et à bandes orientées aléatoirement est présentée. Un modèle numérique a été développé à partir de la littérature existante, comme première étape dans l'avancement de la connaissance actuelle sur la mise-en-forme des composites étudiés. Les résultats ont démontrés que les modèles existants ne permettent pas de prédire adéquatement l'écoulement sous pression des composites étudiés sous hautes pressions et grandes déformations. En second lieu, une étude expérimentale des mécanismes d'écoulement et de déformation à l'échelle macro et méso-scopique a été effectué à l'aide de la micro-tomographie par rayons X. Une nouvelle méthode utilisant des marqueurs constitués de bandes enduites de peinture d'argent conductrice a été développé et utilisée avec succès pour observer et quantifier l'évolution de la méso-structure des composites durant l'écoulement sous pression. Les résultats de l'étude ont été utiles pour observer et caractériser certains des principaux mécanismes de déformation et d'écoulement. En troisième lieu, une caractérisation expérimentale du coefficient de friction entre les plis a été effectuée à l'aide d'un appareil de mesure développé dans nos laboratoires. Des mesures ont été effectuées sur des pré-imprégné unidirectionnels sous des températures, pressions normales et taux de déformation représentatifs du procédé de mise-en-forme. Les résultats ont démontré qu'il y a une très forte relation entre le coefficient de friction entre les plis, les paramètres de mise-en-forme et la méthode de test. Globalement, celui-ci augmente avec le taux de déformation et diminue avec la pression normale. Finalement, un modèle par éléments finis utilisant une approche Eulérienne-Lagrangienne a été développé pour prédire l'écoulement sous pression des composites à bandes orientées aléatoirement. Le matériel a été modélisé comme un fluide à seuil d'écoulement et une condition au bord de non glissement a été imposée. La viscosité du matériau a été modélisée par une approximation lissée d'un fluide à seuil, permettant l'implémentation numérique de celle-ci. Le modèle fut utilisé pour déterminer la viscosité équivalente et la limite d'écoulement de composites à bandes orientées aléatoirement avec des bandes de différentes grandeurs. Les prédictions du modèle sont en accord avec les résultats expérimentaux obtenus pour plusieurs cas d'essais. Le modèle a aussi permit d'établir des graphiques d'aide à la conception pour prédire la pression nécessaire au remplissage d'une géométrie, en fonction de la grandeur des bandes utilisés et de la géométrie de la pièce
Compression moulding of Carbon/PEEK Randomly-Oriented Strands composites: A 2D Finite Element model to predict the squeeze flow behaviour
International audienceCompression moulding of Randomly-Oriented Strands (ROS) of pre-impregnated thermoplastic composites is a process that enables the forming of complex parts with features such as ribs, thickness variations and holes in one single moulding step. This paper focuses on the macroscopic squeeze flow behaviour that occurs during forming. This mechanism rules the filling of intricate features of the mould initially empty. A 2D Finite Element model was developed to predict the squeeze flow of ROS composites. The material was modelled as a Bingham fluid and the equivalent viscosity and yield stress of three different strand sizes were determined using an inverse method. The viscosity and yield stress were found to increase with strand length. Experimental validation of the model was performed using Carbon/PEEK ROS flat samples and the average difference between experimentally measured and predicted final strain was below 5% for all cases
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