Analysis of signalling pathways required for hemocyte navigation in Drosphila

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011A migração celular é um fenómeno fundamental e altamente regulado, que desempenha um papel activo numa grande variedade de processos biológicos. Por exemplo, é essencial para os processos de gastrulação e organogénese durante o desenvolvimento embrionário e, também, para o estabelecimento e manutenção da homeostasia do organismo durante a vida adulta, onde participa na reparação de feridas e na migração de células imunitárias para locais de inflamação. Falhas nos mecanismos de migração celular podem originar diversas patologias, tais como inflamações crónicas, defeitos congénitos e metastização de tumores. Os processos que permitem a migração celular despertam, por isso, grande interesse do ponto de vista terapêutico. O mecanismo de migração celular direccionada, também designado por quimiotaxia, tem sido principalmente analisado através de estudos em cultura de células imunitárias de mamífero. Estes estudos identificaram vários estímulos quimiotácticos, receptores celulares e vias de sinalização essenciais para a migração celular. Alguns destes estímulos quimiotácticos são compostos por moléculas difusíveis designadas por quimiocinas. Estas moléculas são reconhecidas por receptores que se encontram à superfície dos leucócitos, e que fazem parte de uma vasta família de receptores celulares, os receptores associados a proteínas G ou “G-protein coupled receptors” (GPCRs). Estes promovem respostas por parte da célula através de proteínas a eles associadas, as proteínas G ou “G-proteins”. Outros tipos de estímulos quimiotácticos, tais como factores de crescimento, tem a capacidade de activar outra classe de receptores, os receptores tirosina-cinase ou “receptor tyrosine kinases” (RTKs), que são também importantes na promoção de migração celular. A activação destes receptores leva ao recrutamento de moléculas sinalizadoras, nomeadamente a cinase de fosfatidilinositol (PI3K), importante para o estabelecimento da polaridade celular necessária para a migração celular. Embora estes estudos em culturas celulares tenham contribuído bastante para o nosso conhecimento sobre os mecanismos moleculares da migração celular, pouco se sabe acerca da regulação destes mecanismos no contexto de um organismo. É, portanto, fundamental o recurso a um modelo animal simples, e ao mesmo tempo relevante, para analisar estes processos. As células imunitárias ou hemócitos de Drosophila melanogaster (mosca-da-fruta) partilham muitas características com os seus equivalentes nos mamíferos, tanto em termos de função (fagocitose de microrganismos invasores e de corpos apoptóticos, por exemplo), como no seu desenvolvimento hematopoiético (regulado por factores de transcrição das famílias GATA, RUNX, e friend-of-GATA). Em semelhança aos leucócitos, os hemócitos são expostos a uma elevada variedade de estímulos quimiotácticos que têm de ser integrados para definir a sua direcção de migração. Recentemente, os hemócitos embrionários têm sido utilizados como um excelente sistema para o estudo da migração celular e da inflamação in vivo. Estes estudos revelaram que os componentes moleculares que regulam a migração celular são muito semelhantes aos dos leucócitos. Em D. melanogaster existem receptores da familia dos GPCRs e RTKs que desempenham um papel na migração determinados tipos celulares. Um exemplo importante, é o receptor Pvr, um RTK, que é necessário à migração de hemócitos durante o desenvolvimento embrionário. Além disso, a utilização de D. melanogaster como modelo de estudo permite tirar partido de tecnologias bastante avançadas e úteis como a microscopia confocal, e de vastas bibliotecas de mutantes e transgénicos. Outra vantagem é a utilização do sistema GAL4/UAS, que permite determinar a função e localização de diferentes moléculas especificamente nos tecidos e células em estudo e no estádio de desenvolvimento relevante. Assim, o objectivo deste projecto foi analisar o papel da cinase PI3K, dos GPCRs e dos RTKs no recrutamento de hemócitos para localizações específicas, durante a terceira fase larvar de D. melanogaster. Neste estádio do desenvolvimento, uma parte dos hemócitos encontra-se associada a vários tecidos, nomeadamente, à região anterior do intestino designada “proventriculus” (PV) e ao epitélio dorsal, onde estas células se distribuem por grupos sésseis ao longo do eixo antero-posterior da larva, os “sessile patches” (SP). Em primeiro lugar, estudou-se a função da cinase PI3K através da expressão nos hemócitos de uma forma Dominante Negativa (DN) e de uma forma Constitutivamente Activa (CA) desta proteína. Enquanto a primeira bloqueia a acção de PI3K, a segunda mantém-la constantemente activada. Quando se expressou a forma DN de PI3K especificamente nos hemócitos, observou-se um aumento na população de hemócitos no PV, ao passo que nos SP foi observada uma diminuição no número destas células. O efeito da forma DN de PI3K na população de hemócitos do PV é semelhante aos resultados recentemente obtidos em modelos de ratinho para colite, o que demonstra alguma semelhança entre estes dois modelos. Por outro lado, o fenómeno oposto foi detectado após a expressão da forma CA de PI3K. Isto é, quando constitutivamente activa, a cinase PI3K leva à diminuição do número de hemócitos no PV e ao seu aumento nos SP. Verificou-se ainda que as alterações no número de hemócitos são independentes de um potencial efeito da cinase PI3K na proliferação e apoptose destas células, confirmado através da utilização de imunomarcação com o anticorpo anti-fosfo histona H3 e da técnica de TUNEL. Estes resultados revelam que a cinase PI3K poderá ter um papel na regulação da migração de hemócitos em ambas regiões da larva mas a diferentes níveis. Para além disso, verificou-se que a modulação dos níveis de activação de PI3K leva a alterações na morfologia e propriedades adesivas dos hemócitos, o que indica que PI3K também pode ter um papel na regulação das propriedades adesivas destas células. Resumindo, a cinase PI3K parece ser necessária para o controlo e manutenção do tamanho destas populações de hemócitos possivelmente através da regulação da sua migração e/ou adesão aos tecidos adjacentes. Para analisar o papel de receptores envolvidos no recrutamento e na manutenção destas populações de hemócitos, preferencialmente a montante da cinase PI3K, efectuou-se um rastreio genético baseado na utilização de RNAi para silenciar a expressão de potenciais candidatos. Uma vez que existem cerca de 270 GPCRs e 21 RTKs em D. melanogaster, optou-se por se estudar apenas RTKs e GPCRs (e suas proteínas G associadas) que se sabe serem expressos nos hemócitos. Através deste rastreio genético foi possível identificar vários genes com diferentes funções na migração e/ou manutenção das populações de hemócitos: GRHR, btl, Pvr, e GRHRII. GRHR é um GPCR que parece ser importante para a homeostasia dos hemócitos. Blt é um RTK que poderá ser necessário para a regulação negativa do número de hemócitos nos SP. Pvr é também um RTK que poderá desempenhar uma função homeostática, mas ao mesmo tempo ser necessário para a migração dos hemócitos para o PV e SP, uma vez que se observou uma diminuição no número de hemócitos em ambas as localizações quando silenciada a sua expressão. Finalmente, identificou-se o gene GRHRII, que poderá funcionar a montante da cinase PI3K, uma vez que a expressão de RNAi contra este receptor provocou um efeito semelhante ao observado através da expressão da forma DN de PI3K. Dos quatro candidatos identificados, Pvr e GHRHII parecem ser os receptores mais relevantes. Sendo estes resultados preliminares, a próxima etapa deste projecto será validar os fenótipos observados através de outros métodos de análise. Por exemplo, para confirmar a função destes genes pode recorrer-se à utilização de mutantes e a análises epistáticas para determinar se o gene GRHRII actua a montante da cinase PI3K. Em conclusão, estes resultados revelam o papel crucial de diferentes proteínas na regulação das populações de hemócitos durante a terceira fase larvar de D. melanogaster. Em particular a cinase PI3K, que poderá controlar o número de hemócitos através dois processos distintos: i) através da regulação da sua migração, e/ou ii) através da regulação das propriedades adesivas da célula. O rastreio genético realizado permitiu ainda identificar receptores que poderão estar envolvidos na regulação da migração dos hemócitos destas duas regiões, nomeadamente GRHRII e Pvr. De facto, GRHRII poderá funcionar a montante da cinase PI3K e ter um papel na regulação dos números de hemócitos do PV e dos SP. Estes resultados são especialmente interessantes. Se se confirmar o papel deste GPCR no recrutamento de hemócitos, esta será uma descoberta relevante em termos evolutivos, uma vez que demonstra, pela primeira vez, que, à semelhança do que ocorre em mamíferos, os GPCRs desempenham uma função na migração das células imunitárias em D. melanogaster. Estes resultados também apoiam a ideia de que estas células necessitam de integrar diferentes informações provenientes de regiões diferentes para definirem a sua direcção de migração. Desta forma, este estudo fornece novos conhecimentos acerca das vias de sinalização necessárias durante o recrutamento de hemócitos para regiões específicas durante a terceira fase larvar em D. melanogaster e de como estas populações são mantidas. Estes conhecimentos poderão representar um importante contributo para o estabelecimento dos hemócitos como modelos para o estudo de migração celular.Cell migration is an essential and highly regulated mechanism that plays a role in a wide variety of biological processes throughout an organism‟s life. The dysregulation of cell migration can lead to several pathologies such as chronic inflammatory diseases, congenital defects and tumour cell metastasis. Directed cell migration or chemotaxis has been intensively analyzed through cell culture studies, mainly utilizing mammalian immune cells. These models identified several guidance cues, receptors and signalling pathways important for migration of leukocytes to target tissues and to sites of inflammation and damaged epithelia. However, a simple but reliable in vivo system is needed to uncover the mechanisms underlying immune cell migration within the organism. Drosophila melanogaster hemocytes share many important similarities with their mammalian counterparts in terms of function and haematopoiesis. Embryonic hemocytes are an established model to study cell migration in vivo, due to their amenability to live imaging and the array of genetic techniques that allow for functional analysis of molecular processes in specific cell types. The aim of this project was to analyze the role of Phosphoinositide 3-kinase (PI3K), G Protein Coupled Receptors (GPCRs) and Receptor Tyrosine Kinases (RTKs) in hemocyte recruitment to specific tissue targets in Drosophila third instar larvae, namely the intestine and dorsal epithelium. Here we show that PI3K is important for regulating the size and maintenance of these tissue-associated hemocyte populations, possibly by regulating hemocyte response to external signals and/or by modifying their adhesive properties possibly through Cadherin regulation. In addition, in a candidate screen we identified two receptors, a GPCR and an RTK, potentially required for the recruitment and/or maintenance of hemocytes at these locations. In the future, these results could help to better understand innate immune cell migration and to further establish hemocytes as models for in vivo cell migration

Inventário e Georreferenciação do mundo funerário rupestre medieval no Centro de Portugal

O presente relatório resultou do estágio efetuado na DGPC, no âmbito da componente não-letiva do Mestrado em Arqueologia. O seu propósito centrou-se no Inventário e Georreferenciação das manifestações funerárias rupestres medievais, enquadradas na região do Centro de Portugal. Este trabalho possibilitou a atualização e introdução de inúmeras ocorrências, respeitantes a sepulturas e necrópoles escavadas na rocha, na base de dados da DGPC – o Endovélico. A concretização deste objetivo assentou essencialmente na consulta de bibliografia especializada, assim como de relatórios técnico-científicos. Ao constar do Endovélico, a informação inserida afigura-se como um contributo para o conhecimento e divulgação deste tipo de património medieval, auxiliando, inevitavelmente, no que concerne à sua salvaguarda e proteção. O processamento e sistematização da vasta informação inventariada e georreferenciada possibilitou o desenvolvimento de uma análise, na perspetiva das sepulturas escavadas na rocha como fenómeno funerário alto-medieval. Esta permitiu a criação de uma imagem, ainda que incompleta, dos tipos de agrupamentos existentes e da relação entre as sepulturas e as zonas envolventes, com lugar numa parte do território de Viseu.The report here presented is the result of the internship at DGPC, within the non-teaching component of the Archaeology master’s degree. Its purpose focused on Inventory and Georeferencing of the rupestrian funeral evidences in medieval times, comprised in Portuguese Central Region. This report allowed the update and recording of innumerous evidences regarding graves and necropolises dug into the rock in DGPC’s database – the Endovélico. The fulfilling of this objective was based on the consulting of specialized bibliography, as well as of technical-scientific archaeological reports. Being presented in Endovélico, the added information will be a contribute to the general knowledge and promotion of this kind of medieval heritage, inevitably aiding its safeguard and protection. The processing and systematization of the vast inventoried and georeferenced information made possible the development of an analysis, regarding graves dug into the rock as an early-medieval funeral phenomenon. This allowed the depiction, while incomplete, of the types of grave groups and the relation between those graves and the surrounding areas, which takes place in a zone of Viseu’s territory

Optimization of biomass production of an OTA-degrading Pediococcus parvulus

Dissertação de mestrado em BioengenhariaLactic acid bacteria (LAB) are considered beneficial to health due to their use in the production of fermented foods and because they have several probiotic properties. Also, certain LAB strains have the ability to detoxify mycotoxins which make them a promising solution to reduce the levels of mycotoxins in food and feed products. Pediococcus parvulus is a LAB with the ability to detoxify ochratoxin A (OTA), which is one of the most important mycotoxins found in agricultural commodities. The present work aimed to optimize the biomass production of P. parvulus using batch and fed-batch fermentation processes. Initially, the composition of culture medium and operational conditions were optimized in flaks. The biomass production was evaluated by testing three culture media (MRS, TGE and GYP), wherein with MRS was obtained the maximal biomass concentration of 0.81 g·L-1. Lactose was also tested as an alternative carbon source but P. parvulus did not metabolized this monosaccharide. Temperature, pH control and L-(+) cysteine were the factors that had the most relevant effect on bacteria growth. At this level, the highest concentration of biomass achieved (1.14 g·L-1) was obtained in batch culture in bioreactor using MRS broth supplemented with 1.0 g·L-1 of L-(+) cysteine wherein pH and temperature were maintained at 5.2 and 30 ºC, respectively. After selecting the best conditions for P. parvulus cultivation, different batch and fedbatch fermentation process were studied. In those experiments, no significant difference in biomass production were observed between batch and fed-batch fermentation, since they achieved biomass concentrations of 1.14 g·L-1 and 1.19 g·L-1, respectively. Additionally, it was observed that P. parvulus was inhibited by lactic acid making it difficult to obtain high biomass yields with a unique and simple process. To overcome this problem, a fed-batch with cells-recycling through centrifugation was finally studied. Using this process, the biomass production was further enhanced being achieved a final biomass concentration of 2.24 g·L-1 and 3.19 g·L-1, respectively, with one and two cells-recycling steps. This maximum concentration was approximately 3-fold better than the one obtained in batch cultures. Besides, the OTA-degrading capacity of P. parvulus was not affect by the different operational conditions and modes of operations. Based on this results it will be interesting, in future studies, to evaluate the performance of a cell-recycling fed-batch culture system that uses a microfiltration membrane unit to continuously recycle the cells.As bactérias láticas são consideradas benéficas para a saúde devido à sua aplicação em produtos alimentares fermentados e às suas propriedades probióticas. Outra possível vantagem destes microrganismos prende-se ao facto de certas bactérias láticas apresentarem a capacidade de degradar micotoxinas, sendo deste modo, uma solução promissora para reduzir os níveis de micotoxinas em produtos alimentares e rações animais. Pediococcus parvulus é uma bactéria lática com a capacidade de degradar ocratoxina A (OTA), que é uma das mais importantes micotoxinas encontradas nos produtos agrícolas. O estudo realizado teve com principal objetivo a otimização da produção de biomassa de P. parvulus recorrendo a processos de cultura descontínuo e semicontínuo. Inicialmente, a composição do meio de cultura e as condições de operação foram otimizadas em matraz. A produção de biomassa foi avaliada por crescimento da bactéria em três meios de cultura distintos (MRS, TGE e GYP), obtendo-se uma maior concentração de biomassa (0,81 g·L-1) com o meio MRS. A lactose foi também testada como fonte alternativa de carbono, verificando-se, contudo que P. parvulus não metaboliza este monossacarídeo. A temperatura, o pH e L- (+) cisteína foram fatores que tiveram um efeito relevante no crescimento da bactéria. A maior concentração de biomassa (1,14 g·L-1) foi obtida em bioreator usando o meio MRS suplementado com 1,0 g·L-1 de L-(+) cisteína onde o pH e a temperatura foram mantidos a 5,2 e 30 ºC, respetivamente. Depois de selecionadas as melhores condições para o crescimento de P. parvulus, diferentes processos de fermentação descontínuo e semi-contínuo foram estudados. Nestes ensaios iniciais não foram observadas diferenças significativas na produção de biomassa entre os modos descontínuo e semi-contínuo, tendo-se obtido concentrações de biomassa de 1,14 g·L-1 e 1,19 g·L- 1, respetivamente. Adicionalmente, foi observado que o crescimento de P. parvulus era inibido pelo ácido lático formado, tornando-se difícil obter concentrações elevadas com um único e simples processo. Para superar este problema, foi testada uma fermentação semi-contínua com reciclagem das células por centrifugação. Usando este processo, a produção de biomassa foi melhorada tendose obtido uma concentração final de biomassa de 2,24 g·L-1 e 3,19 g·L-1, respetivamente, com uma e duas etapas de reciclagem das células. Esta concentração máxima foi 3 vezes superior à obtida em cultura descontínua. Além disto, a capacidade de degradação da OTA pela P. parvulus não foi afetada pelas diferentes condições e modos de operação. Tendo em consideração os resultados obtidos, a avaliação do desempenho de um sistema de cultura semi-contínua com uma membrana de microfiltração para reciclagem contínua das células seria uma hipótese a ser futuramente testada

Medidas de interdição de acesso a recintos desportivos: uma perspetiva de análise, fiscalização e controlo

O desporto em geral e o desporto de competição em particular, assumem um papel preponderante na sociedade do século XXI. Infelizmente por vezes, o espírito de competição toma proporções excessivas, muito para além do saudável e expetável para o que deveria ser um espetáculo desportivo. Não são raras as vezes em que, se relatam incidentes antes, durante e/ou após um evento desportivo. Esse facto tem vindo a preocupar os governos, as organizações ligadas aos espetáculos desportivos e as autoridades policiais. Para combater esse problema, foram desenvolvidas uma série de medidas para fazer face à violência a que assistimos, que passaram pela criação de mecanismos a serem introduzidos nos diversos regimes jurídicos internos, recomendações e resoluções que estabelecem normas e indicam boas práticas a seguir. Apesar do esforço que foi feito ao longo dos anos, acreditamos que ainda estamos longe de ver este fenómeno extinto; e por isso, desenvolvemos um estudo acerca de um dos mecanismos que o regime jurídico português dispõe; as medidas de interdição de acesso a recintos desportivos. Com o objetivo de criar conhecimento que possa contribuir para a criação de novas propostas para o modelo de gestão de segurança de eventos desportivos da Polícia de Segurança Pública. Este estudo consiste num campo teórico, numa análise quantitativa das medidas de interdição e numa análise qualitativa de entrevistas a figuras de relevo no âmbito desportivo. Assim concluímos que, as medidas de interdição na sua génese são um mecanismo eficaz para a prevenção e repressão da violência no desporto, mas que dependem de três fatores: a sua aplicação, contexto de aplicação e a fiscalização do seu cumprimento. Foi também possível determinar que a prática de atos ou incitamento à violência, ao racismo, à xenofobia e à intolerância nos espetáculos desportivos e a introdução ou utilização de engenhos explosivos, artigos de pirotecnia ou fumígenos, ou objetos que produzam efeitos similares são os ilícitos que mais resultam em medida de interdição. Quanto aos adeptos, foi possível determinar algumas características comuns, que resultam com mais frequência em aplicação de medidas de interdição. No que concerne ao modelo de gestão de eventos adotado pela Polícia de Segurança Pública, consideramos que nem sempre tem em conta esta realidade por apresentar algumas lacunas de uniformidade no policiamento.The sport in general and competitive sport, takes on a leading role in 21st century society. Unfortunately, sometimes the spirit of competition takes on excessive proportions, far beyond the healthy and expectable for what should be a sport event. It is not uncommon for times when incidents are reported before, during and / or after a sport event. This has been a concern for governments, sports organizations and police authorities. To combat this problem, a series of measures were developed to deal with the violence we witnessed, which included the creation of mechanisms to be introduced in the various internal legal regimes, recommendations and resolutions that establish norms and indicate good practices to be followed. Despite the effort that has been made over the years, we believe that we are still far from seeing this phenomenon extinct; and for that reason, we developed a study about one of the mechanisms that the Portuguese legal regime has; measures to ban access to sports venues. With the objective of creating knowledge that can contribute to the creation of new proposals for the security management model of sport events of the Polícia de Segurança Pública. This study consists of a theoretical field, a quantitative analysis of the interdiction measures and a qualitative analysis of interviews with important figures in the sports field. Thus, we conclude that interdiction measures in their genesis are an effective mechanism for the prevention and repression of violence in sport, but that they depend on three factors: its application, context of application and the monitoring of its compliance. It was also possible to determine that the practice of acts or incitement to violence, racism, xenophobia and intolerance in sports shows and the introduction or use of explosive devices, pyrotechnic or smoking articles, or objects that produce similar effects are the illicit acts that more result in an interdiction measure. As for the supporters, it was possible to determine some common characteristics, which result more often in the application of interdiction measures. Regarding the event management model adopted by the Polícia de Segurança Pública, we consider that this reality is not always considered because it presents some gaps in uniformity in policing

High-quality biodiesel production from Yarrowia lipolytica NCYC 2904 bio-oil

Due to the global increase in energy demands, the depletion of fossil fuel reserves, and the increase in environmental pollution, upsurges the need to create renewable and environmentally friendly energy. Biodiesel, one of the most attractive alternatives for the replacement of conventional fossil fuels, can be produced from bio-oil accumulated by oleaginous yeast. The use of low-cost feedstocks for bio-oil production contributes to reducing global costs and enables the development of more sustainable processes. Thus, bio-oil production by Yarrowia lipolytica NCYC 2904 from crude glycerol (a by-product of the biodiesel industry) and volatile fatty acids (intermediates in the anaerobic fermentation of food wastes) was studied in a lab-scale stirred tank bioreactor using fed-batch and two-stage batch operation modes. The fed-batch culture with a crude glycerol feeding rate of 3.12 mL·h-1, followed by the addition of 18 g·L-1 VFAs mixture, was the best strategy to obtain the highest bio-oil production (6.1 g·L-1). Bio-oil of Y. lipolytica, rich in oleic acid, was successfully converted into biodiesel, which meets the criteria of the international biodiesel standards EN 14214 and is similar to biodiesel produced from vegetable oils. This demonstrates the potential of Y. lipolytica to convert low-cost substrates into feedstocks for high-quality biodiesel production, according to the biorefinery and bioeconomy circular guidelines.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Enhancing microbial lipids synthesis for biodiesel production by Y. lipolytica W29 from volatile fatty acids: two-stage batch strategies

Microbial lipids produced by Y. lipolytica have the potential to be used as feedstock for the biodiesel industry, but the high costs of pure substrates used for its production are limiting the potential of this application. Volatile fatty acids (VFAs), obtained in anaerobic fermentation of organic wastes, are inexpensive carbon sources for the cost-effective production of microbial lipids. In this work, two-stage batch cultures were tested as a strategy to improve lipids production by Y. lipolytica W29. The process consists of a first growth phase in glucose or glycerol, followed by a lipogenic phase in VFAs medium composed of a mixture of acetate, propionate, and butyrate. The addition of three pulses of 6 g·L−1 VFAs mixture, or a single pulse of 18 g·L−1 VFAs mixture, in the lipogenic phase boosted microbial lipids production (23–25%, w/w) and prevented lipids mobilization. Microbial lipids synthesized in such conditions are mainly composed of oleic acid (54%) with an unsaturated/saturated fraction above 78%. The main properties of biodiesel produced from Y. lipolytica W29 lipids are within the ranges of the EU biodiesel standard EN 14214.This study was supported by the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) under the scope of the strategic funding of UIDB/04469/2020 unit and Doctoral grant (SFRH/BD/129592/2017).info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Implementação da Metodologia 5S numa Empresa

Num mercado cada vez mais competitivo, produtividade é a palavra chave que as empresas procuram. Em períodos em que as condições económicas não são favoráveis, lidar com a crescente exigência dos clientes na qualidade e diversidade de produtos, juntamente com os prazos de entrega exigidos faz com que as empresas adotem novas estratégias para assegurar a sua competitividade e sustentabilidade no mercado. A introdução da metodologia 5S nas empresas é um passo à frente que todas as organizações devem dar, independentemente de serem grandes, médias ou microempresas. A procura de formas de trabalho mais eficientes, reduzindo custos e desperdícios é uma constante em qualquer organização. O projeto desenvolvido, em contexto empresarial na empresa Laborial – Laboratory Solutions, teve como principal objetivo a implementação da metodologia 5S criando standards para os postos de trabalho na produção. Sendo a metodologia 5S uma das ferramentas da produção Lean - visa a triagem, organização e limpeza do posto de trabalho, mas principalmente, a autodisciplina e a criação de hábitos diários relativamente a esta temática no local de trabalho. Foi decidido pela empresa que este seria um tópico pertinente a abordar na reorganização da empresa. Após estudar o tema na integra, foi realizado um diagnóstico da situação em que se encontrava a fábrica no que diz respeito aos 5S. Com uma realidade muito longínqua da metodologia, foi necessário começar tudo de raiz. Realizou-se então um plano de auditoria de forma a analisar com mais pormenor quais os principais problemas encontrados, para à posterior encontrarmos soluções viáveis. Foram então feitas diversas sugestões de melhoria como a revisão do material existente nos postos de trabalho, eliminar tudo o que fosse obsoleto ou lixo, reorganizar o layout e a disposição das coisas na fábrica, criação de novas áreas devidamente identificadas, limpeza completa, identificação dos materiais consumíveis e ainda dos standards para cada posto de trabalho. Após a implementação de todas as sugestões de melhoria, foram verificadas reduções de tempo na procura de material, bem como das matérias primas, espaços mais eficientemente utilizados, melhoria visual do aspeto do local de trabalho, conservação da limpeza e da organização e um melhor ambiente de trabalho. Quando comparado a primeira auditoria interna de 5S com a auditoria após a implementação, percebe-se que houve um aumento significativo dos parâmetros analisados de 45% para 84%.In an increasingly competitive market, productivity is the key word that companies are looking for. In periods when economic conditions are not favorable, dealing with the growing demand from customers for the quality and diversity of products and the required delivery times, makes companies adopt new strategies to ensure their competitiveness and sustainability in the market. The introduction of the 5S methodology in companies is a step forward that all organizations must take, regardless if they are large, medium or micro companies. The search for more efficient ways of working, reducing costs and waste is a constant in any organization. The developed project, in a business context in the company Laborial - Laboratory Solutions, had as main objective the implementation of the 5S methodology creating standards in production´s workplaces. The 5S methodology is one of the tools of Lean production - it aims at sorting, organizing and cleaning the workplace, but mainly, self-discipline and the creation of daily habits with this theme in workplace. It was decided by the company that this would be a relevant topic to address in the reorganization of the company. After studying it in its entirety, a diagnosis about 5s conditions in the factory was made. With a very distant reality of the methodology, it was necessary to start from the beginning. An audit plan was made in order to analyze in detail the main problems encountered, so that we can find viable solutions later. Various suggestions for improvement were made. Review the material in the work stations, eliminate anything that was obsolete or garbage, reorganize the layout and arrangement of things in the factory, create new areas properly identified, complete cleaning, identification of consumable materials, as well as the standards for each workstation. After all the suggestions for improvement were implemented, we easily see the time reductions for search for material, as well as raw materials, more efficiently used spaces, visual workplace improvement appearance, conservation of cleanliness and the organization and a better working environment. When we compare the first 5S internal audit with the audit after the implementation, it is clear that there was a significant increase in the analyzed parameters from 45% to 84%

Flexibilidade Laboral como Acelerador da Criatividade nas Organizações

Com a implementação de novas políticas de trabalho em muitas organizações, em resposta ao novo paradigma pós-COVID-19, a flexibilidade laboral tornou-se um tema amplamente discutido em relação ao seu futuro no ambiente organizacional. Neste contexto, torna-se cada vez mais importante avaliar como a criatividade reage a estas mudanças no paradigma de trabalho. Acontece que o rápido desenvolvimento da globalização e do crescimento económico tem impulsionado mudanças significativas na forma de trabalhar das organizações. A flexibilidade laboral tem ganho destaque como uma abordagem que visa dar aos funcionários maior autonomia em relação à quantidade, tempo e local de trabalho. Paralelamente, a criatividade tem sido cada vez mais valorizada no ambiente de trabalho, visto que funcionários criativos são capazes de trazer novas perspetivas, ideias e soluções inovadoras aos desafios organizacionais. Deste modo, o principal objetivo desta pesquisa consiste em explorar a relação entre flexibilidade laboral e criatividade. Mais especificamente, pretende-se investigar a possível associação entre a capacidade de adaptação no ambiente de trabalho e o potencial criativo dos profissionais. Assim, neste estudo, a metodologia empregue envolveu um estudo quantitativo, utilizando um inquérito por questionário que possibilitou a obtenção de 216 respostas válidas de profissionais pertencentes a organizações, tanto do setor privado como do público. Do total de respostas, 112 foram de indivíduos do sexo feminino e 104 do sexo masculino. Através do instrumento de medição estatístico do Modelo de Regressão Linear, apurou-se que a flexibilidade laboral tem um impacto positivo na criatividade. A presente investigação contribui para o aumento da literatura sobre as novas tendências emergentes no modo de trabalhar em organizações que procuram aumentar a criatividade nos seus funcionários como forma de alcançar novas estratégias organizacionais. Além disso, sugere-se às organizações que a implementação de práticas flexíveis de trabalho pode aprimorar a criatividade dos seus funcionários

Mechanisms of osteoblast reprogramming and differentiation during zebrafish caudal fin regeneration

Regeneration is an impressive biological process that allows the replacement of lost body parts due to damage or injury, restoring both tissue architecture and function. It is well documented that while mammals have a limited capacity to regenerate lost tissues, other vertebrates, such as amphibians and teleost fish, exhibit a remarkable capacity to regenerate organs, like the heart and the retina, and large sections of the body, such as the limb and the fin. Zebrafish has become an important model system to study vertebrate regeneration and the adult caudal fin is one of the most used tissues to comprehend how tissues are restored. This structure is easily accessible to surgery, amenable to live imaging, its amputation does not compromise survival and regeneration is particularly fast, occurring over the course of two weeks. Fin regeneration is an epimorphic process since it relies on a specialized structure called blastema, which is composed of a proliferative heterogeneous population of dedifferentiated cells with restrictive lineage potential. After caudal fin amputation, a regenerative program is activated and occurs in three sequential phases: wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth. These events comprise a tight coordination between proliferation, patterning and differentiation to reconstitute the architecture and the size of the original tissue. The adult caudal fin is composed of multiple tissues, including blood vessels, nerves, mesenchyme and the structural support, the bony-rays (skeletal elements). Each bony-ray is surrounded and maintained by an outer and inner monolayer of bone secreting cells, the osteoblasts. Many studies have focused on bone regeneration since the zebrafish caudal fin provides a unique model to understand bone formation and osteoblast dynamics upon tissue damage and regeneration. After caudal fin amputation, formation of the new bone elements depends greatly on tissue plasticity (changes in cellular identity). This is achieved through the activation of two complementary processes that enable the assembly of an osteoblast progenitor pool during blastema formation: dedifferentiation of resident mature osteoblasts and commitment of joint-associated osteoblast progenitors. Complex regulatory mechanisms subsequently maintain and expand the osteoblast progenitor pool and promote their redifferentiation into mature osteoblasts to restore the skeletal tissue. Therefore, both osteoblast progenitor assembly and redifferentiation are critical aspects of caudal fin bony-ray regeneration. Interestingly, ablation of mature osteoblasts prior to caudal fin amputation does not affect normal bone regeneration, suggesting that de novo bone formation can rely solely on the commitment of joint-associated osteoblast precursors or on new osteoblast progenitors arising from alternative sources.In this PhD thesis, I aimed to unravel key aspects of caudal fin bone regeneration, focusing on new regulators of osteoblast dedifferentiation and redifferentiation and alternative sources for de novo osteoblast formation in osteoblast-depleted fins. To investigate novel regulators of osteoblast dedifferentiation, we performed a genome-wide gene expression analysis of osteoblasts undergoing dedifferentiation. With this analysis, we concluded that this process occurs much earlier in the regenerative process than what was previously thought. Furthermore, we characterized the molecular basis of osteoblast dedifferentiation regarding epigenetic modulation, signal transduction, cell adhesion reorganization, epithelial to mesenchymal transition and acquisition of migratory behaviour and proliferation. Particularly, we observed that osteoblasts change their metabolic signature upon injury. This was predicted based on the upregulation of several glycolytic and lactate producing enzymes, which is followed by an increase in the expression of oxidative phosphorylation electron transport chain components. We hypothesize that osteoblast dedifferentiation relies on a bivalent metabolism that uses both glycolysis and oxidative phosphorylation, which may reflect an adaption to the energetic demands of regeneration. Since the link between metabolic adaptation and regeneration remains poorly understood, we decided to address it by inhibiting the glycolytic influx. We observed major defects in the regenerative process, including impaired assembly of the wound epidermis, a major signalling centre during regeneration, and fewer cells re-entering the cell cycle. In addition, we showed that several osteoblast markers were downregulated and that osteoblast populations became disorganized. This suggests that metabolic adaptation plays an important role in regeneration, in particular during osteoblast dedifferentiation. In addition to the transcriptional analysis, we followed a targeted approach. We examined the role of the Hippo signalling pathway as a potential regulator of osteoblast dedifferentiation, by inhibiting Yap (Hippo pathway effector). This prevented mature osteoblasts to migrate, re-enter the cell cycle and to assemble the osteoblast progenitor pool. In parallel, we evaluated the role of this pathway in mediating osteoblast redifferentiation during regenerative outgrowth. We noticed that Yap inhibition leads to a decrease in the number of differentiating osteoblasts and to the misregulation of key signalling pathways, such as Bmp and Wnt signalling. We provide evidence that Yap not only promotes osteoblast differentiation through activation of Bmp signalling via bmp2a expression but also restricts the osteoblast progenitor pool by inhibiting Wnt signalling to the differentiation front by regulating dkk1a. Altogether, these results lead us to propose that the Hippo/Yap signalling pathway regulates osteoblast dedifferentiation as well as redifferentiation. This reveals a previously unknown duality if the Hippo/Yap pathway in controlling two different aspects of osteoblast biology during caudal fin regeneration. Lastly, we provide evidence into the cellular and molecular mechanisms that regulate de novo osteoblast formation in osteoblast-depleted caudal fins. We identified an additional osteoblast progenitor population that arises at the outer and inner bone surfaces adjacent to the epidermal and mesenchymal compartments, respectively. These cells are not part of a uniform population but seem to form two distinct osteoblast progenitor populations with different origins or expression profiles. Lineage tracing experiments revealed that mesenchymal cells within the intraray compartment, but not epidermal cells, contribute to generate new osteoblasts in osteoblast-depleted caudal fins. This provides new evidence of an additional source of osteoblasts for regeneration. Moreover, we showed that both Retinoic Acid and Bmp signalling pathways are activated in this osteoblast progenitor population and are important to induce their commitment and recruitment during caudal fin regeneration. Thus, we elucidate potentially dormant regenerative mechanisms that emerge to ensure correct bone formation in caudal fins lacking mature osteoblasts. Taken together, this PhD thesis provides novel insights into new regulators of bone formation and alternative cells that can contribute to correct bone regeneration upon injury. We expect that defining the mechanisms regulating tissue plasticity, reprogramming and fate specification during bone reconstitution have major implications not only to understand the basic mechanisms that regulate tissue regeneration but also to the field of regenerative medicine and bone cancer biology.A regeneração é um processo biológico notável que permite a restituição de tecidos após lesão ou amputação, que incluí a recuperação da função, forma e tamanho do tecido original. Enquanto que os mamíferos possuem uma capacidade limitada de regenerar tecidos, outros vertebrados, como anfíbios e alguns peixes teleósteos, são dotados de uma capacidade extraordinária de regenerar órgãos, como o coração e a retina, e grandes superfícies corporais, como membros e barbatanas. O peixe-zebra (Danio rerio) é utilizado como modelo para o estudo de processos regenerativos em vertebrados. A barbatana caudal do peixe-zebra surgiu como uma das estruturas mais utilizadas para estudar regeneração. Esta estrutura é de fácil acesso à cirurgia de amputação, passível ao uso de técnicas de microscopia, não comprometendo a sobrevivência do animal, sendo que o seu processo regenerativo é consideravelmente rápido. A regeneração da cauda é um processo epimórfico, uma vez que depende da formação de uma estrutura especializada designada blastema. Esta estrutura é composta por uma população heterogénea de células com capacidade proliferativa. Após amputação da cauda, o programa regenerativo é caracterizado por três fases sequenciais: fecho da ferida, formação do blastema e, por fim, crescimento e diferenciação. Durante o processo regenerativo, a coordenação entre proliferação e diferenciação é de grande importância para assegurar e alcançar a estrutura e tamanho iniciais. A barbatana caudal é constituída por vários tecidos, incluindo vasos sanguíneos, nervos, tecido mesenquimal e tecido ósseo, este último sendo constituído por raios ósseos que providenciam estabilidade à cauda. Cada um destes raios ósseos é revestido externa e internamente por uma monocamada de células produtoras de osso, os osteoblastos. Muitos estudos têm-se focado na regeneração destes elementos ósseos presentes na barbatana caudal, uma vez que este sistema possibilita a compreensão do processo regenerativo do osso e a dinâmica dos osteoblastos neste contexto. Após amputação da cauda, a formação do novo tecido ósseo depende consideravelmente da plasticidade celular (alterações na identidade celular). Isto é alcançado durante a formação do blastema, através da ativação de dois processos complementares que permitem a formação de um conjunto de progenitores de osteoblastos: desdiferenciação de osteoblastos maduros presentes no tecido não danificado e diferenciação de progenitores presentes na zona da articulação. Posteriormente, mecanismos regulatórios mantêm e expandem o grupo de progenitores e promovem a sua diferenciação em osteoblastos completamente diferenciados, capazes de produzir matriz óssea e de reconstituir o tecido ósseo. Desta forma, a formação dos progenitores de osteoblastos assim como a sua correta diferenciação são essenciais para promover a regeneração dos raios ósseos da barbatana caudal. Curiosamente, a ablação de osteoblastos maduros antes do início do processo regenerativo não afeta a regeneração dos elementos ósseos, o que sugere que, neste contexto, que a sua formação depende unicamente de progenitores associados à articulação ou de fontes celulares alternativas ainda por descobrir. Durante esta tese de doutoramento, procurei elucidar aspetos chave da regeneração do osso da barbatana caudal do peixe-zebra, nomeadamente os processos regulatórios que controlam o programa de desdiferenciação dos osteoblastos maduros bem como a sua posterior diferenciação, e as fontes alternativas de progenitores de osteoblastos em caudas desprovidas de osteoblastos maduros. Com o intuito de investigar novos mecanismos regulatórios do processo de desdiferenciação, recorremos a uma análise global do transcriptoma dos osteoblastos nesta fase da regeneração. Esta análise revelou que o processo de desdiferenciação ocorre muito cedo durante o processo regenerativo. Para além disso, caracterizámos a base molecular do programa de desdiferenciação, no que diz respeito a mecanismos epigenéticos, metabolismo, vias de transdução de sinal, adesão celular, transição epitélio-mesênquima, migração e proliferação. Em particular, observámos que várias enzimas glicolíticas e produtoras de lactato exibem a sua expressão aumentada no início da desdiferenciação, seguidas de um aumento na expressão de componentes da cadeia transportadora de eletrões. Estes resultados demonstram que os osteoblastos alteram significativamente o seu metabolismo em resposta à amputação. Desta forma, propomos a hipótese de que a desdiferenciação dos osteoblastos depende da aquisição de um metabolismo bivalente no qual as vias glicolíticas e de fosforilação oxidativa são usadas para melhor adaptar os osteoblastos aos novos requisitos do processo regenerativo. Uma vez que a ligação entre adaptação metabólica e regeneração ainda está pouco explorada, decidimos investigar como é que o processo regenerativo é influenciado pela glicólise. Ao inibirmos o fluxo glicolítico, verificámos que o crescimento do tecido regenerativo é significativamente reduzido. Neste contexto, vários fenótipos foram observados: inibição da proliferação; desorganização da população de osteoblastos dentro do blastema; alterações na expressão de vários marcadores de osteoblastos; e deformação da epiderme especializada que se forma durante a regeneração, cuja função secretora de moléculas sinalizadoras é essencial para a desdiferenciação. Estes resultados sugerem que esta adaptação metabólica tem um papel importante durante a regeneração, em particular no processo de desdiferenciação. Para além da análise de transcriptoma, estudámos também uma via de sinalização em particular, a via Hippo, através da manipulação genética do seu efetor Yap. Descobrimos que a inibição de Yap durante a fase de desdiferenciação impede a migração e proliferação de osteoblastos maduros e a formação de novos progenitores. Para além disso, a inibição desta via durante a fase de rediferenciação leva a uma diminuição substancial dos osteoblastos em diferenciação e a uma alteração na expressão de componentes de vias de sinalização cruciais, bmp2 (via BMP) e dkk1 (via Wnt). Estes dados evidenciam que Yap promove a diferenciação dos osteoblastos através da ativação da via BMP e restringe o grupo de progenitores através da inibição da via Wnt. Estes resultados permitem-nos propor que a via de sinalização Hippo/Yap regula quer a desdiferenciação dos osteoblastos quer a sua subsequente rediferenciação, o que revela a dualidade do mecanismo de ação desta via em fases diferentes do processo regenerativo da barbatana caudal. Por último, revelamos a existência de mecanismos celulares e moleculares que regulam a formação de novos progenitores de osteoblastos em caudas desprovidas de osteoblastos maduros. Identificámos assim uma fonte adicional de progenitores que emerge na interface da matriz óssea com os tecidos adjacentes, nomeadamente a epiderme e o mesênquima. Estes progenitores não parecem formar uma população homogénea, mas sim duas populações distintas com diferentes origens ou com diferentes padrões de expressão. Recorrendo a técnicas de seguimento de linhagem, conseguimos identificar o mesênquima, mas não a epiderme, como uma fonte de novos osteoblastos em caudas desprovidas de osteoblastos maduros. Estes resultados põem em evidência uma origem adicional de osteoblastos que contribui para o processo regenerativo. Para além disso, demonstramos que as vias de sinalização do Ácido retinóico e Bmp estão ativas nesta população de progenitores e têm um papel crucial na formação e recrutamento desta fonte adicional de osteoblastos durante o processo regenerativo. Assim, este trabalho permite revelar que, em barbatanas caudais desprovidas de osteoblastos maduros, mecanismos regenerativos que se encontram normalmente inativos, são estimulados e asseguram a formação correta dos elementos ósseos neste contexto. De uma forma geral, esta tese de doutoramento identifica novos mecanismos de regulação da formação do tecido ósseo e fontes celulares alternativas que contribuem e garantem a correta regeneração do osso após lesão. Antevemos que o conhecimento dos mecanismos que regulam a plasticidade celular, reprogramação e especificação de linhagem durante a regeneração do osso possam ter implicações fulcrais não só para o conhecimento dos processos básicos que promovem regeneração, mas também no campo da medicina regenerativa e neoplasias