Super-resolution imaging of the structural maintenance of chromosome (SMC) complexes cohesin and condensin

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013Os complexos proteicos “Structural Maintenance of Chromosomes” (SMC) têm papéis importantes na estrutura cromossómica. Destes, destacam-se a coesina e as condensinas. A coesina mantém os cromatídeos irmãos unidos de modo a permitir a sua fiel segregação enquanto que as condensinas são principalmente responsáveis pela condensação dos cromossomas em preparação para a divisão celular1. A distribuição destes complexos no cromossoma e a sua interacção com outras proteínas associadas ao ADN é actualmente alvo de intensa investigação. Quando os cromossomas estão condensados sabe-se que a condensina aparece num eixo restrito ao longo dos cromatídeos. Sabe-se também que neste período as coesinas estão localizadas maioritariamente na região pericentromérica. Mas não é ainda conhecido se a sua distribuição abrange toda a largura da do centrómero ou, para os dois complexos, se têm uma distribuição restrita centralmente, se pontual ou difusa (figura 3). O limite para perceber a sua distribuição é resultado do limite de resolução das técnicas tradicionais de microscopia óptica. Estas estão limitadas pela difracção da luz a uma resolução de cerca de 200 nm. Embora a microscopia electrónica consiga maior resolução, esta não permite discriminar os complexos de forma selectiva do restante contexto celular2. Como tal, o desenvolvimento de ferramentas que consigam determinar a sua distribuição com maior fiabilidade permitirá novas avenidas de investigação. Com este trabalho monstramos o desenvolvimento de um sistema de microscopia de super-resolução e conjunto de protocolos capazes de obter imagens de super-resolução dos complexos SMC em células de Drosophila melanogaster. Das técnicas que permitem maior resolução desenvolvidas actualmente, as que se baseiam na localização de moléculas individuais (SML, sigla inglesa) são as mais simples de implementar a nível de hardware2. Estas são baseadas no princípio de que a posição de uma molécula pode ser identificada com maior precisão do que a resolução do microscópio. Isto é apenas possível se a molécula estiver individualizada, permitindo que se faça um ajuste a uma curva gaussiana bidimensional a cada fluoróforo individual. Numa amostra fluorescente normal, todos os fluoróforos emitem simultaneamente o que impede a sua discriminação. As diferenças nas variadas técnicas de SML residem na forma de conseguir que apenas uma fracção reduzida dos fluoróforos emita em determinado período de tempo. A técnica de dSTORM baseia-se no facto de que a maioria dos fluoróforos, após excitação com um laser suficientemente forte, entra num estado em que não emitem luz com duração de alguns milissegundos a várias dezenas de segundos. Se for obtido um filme da amostra enquanto esta é exposta à luz de um laser suficientemente intensa, iremos obter um filme dos fluoróforos a piscar. Poderemos então analisar com um algoritmo de localização o filme e identificar todos os fluoróforos presentes na amostra. No final, uma imagem de super-resolução pode ser obtida pela reconstrução dos pontos que foram localizados, pois a sua localização é feita com maior precisão do que a resolução teórica do microscópio3. Um sistema dSTORM, no geral, apenas precisa de um microscópio convencional e um laser suficientemente forte, o que simplifica a sua implementação. Dada a simplicidade dos requerimentos, optou-se por montar um sistema dSTORM para obter imagens dos complexos SMC. Foi obtido um microscópio Nikon com uma objectiva de 100x e 1.45 de abertura numérica (permitindo a melhor colecção de sinal da amostra possível), dado que a precisão da localização depende da quantidade de fotões capturados. A este microscópio foi adaptado um laser de 639nm de comprimento de onda KVANT com 166 mW de potência, permitindo a indução dos estados não-emissores nos fluoróforos presentes na amostra. Simultaneamente foram estabelecidas formas de preparação de amostra que permitam a melhor imagem possível para dSTORM. Principalmente, visto que a espessura da amostra também afecta a qualidade da colecção, foi estabelecido um protocolo para obter preparações de cromossomas em lamelas utilizando o sistema Cytospin. Este consiste numa centrífuga com suportes para lâminas e funis que aceitam as células; quando começa a centrifugar, as células são projectadas na lâmina de modo a obter amostras tão planas quanto possível. Quando as células são tratadas com uma solução hipotónica, o núcleo é rompido e os cromossomas separados. Outra alteração importante ao protocolo normal de imunofluorescência foi a adição de um segundo passo de fixação, no final do protocolo. Isto porque com a exposição a uma fonte de luz de elevada potência (p.ex. um laser) alguns dos fluoróforos destacam-se dos anticorpos a que estão ligados (Ricardo Henriques, comunicação pessoal). Finalmente, em todos os microscópios existe a chamada deriva térmica. Qualquer amostra observada ao microscópio, irá estar a uma temperatura ligeiramente diferente e a sua diferença será equilibrada pela platina que a segura. Dado que a platina e a objectiva costumam ser peças independentes e de materiais diferentes, a amostra irá ser deslocada muito ligeiramente pela deriva térmica da platina ao longo do tempo. Esta deriva é de um valor muito pequeno, mas no decurso de uma aquisição de uma sequência de imagens para subsequente localização, afecta significativamente a reconstrução, a menos que seja corrigida. Para resolver este problema podem incluir-se marcadores na amostra que são depois usados como referência para o algoritmo de reconstrução; este mede a deriva dos marcadores e corrige na tabela de localizações dos pontos. No nosso caso, incluímos sempre microesferas fluorescentes Tetraspeck de 100 nanómetros de diâmetro, que é abaixo da resolução do microscópio. Esta correcção apenas corrige deriva no plano lateral do microscópio, mas o microscópio obtido possui um sistema de correcção de hardware da deriva axial que consegue manter a amostra em foco durante a aquisição. Com este sistema e a nova preparação de amostra, obtivemos imagens de super-resolução da proteína Rad21, uma subunidade da coesina (Figura 10). As reconstruções de Rad21 obtidas mostraram que a proteína se localiza numa zona axialmente restrita com uma largura de sensivelmente 85 nm, consideravelmente abaixo da resolução do microscópio. Vários modelos têm sido descritos para o modo como as coesinas promovem a coesão entre os cromatídios (Figura 2). Destes, o nosso resultado favorece o modelo em que um único anel aprisiona os dois cromatídeos irmãos. Por oposição, este resultado vai contra um modelo alternativo que propõe que dois anéis de coesina estão envolvidos na coesão, cada um rodeando um dos cromatídeos irmãos (Figura 2d). Com este modelo, seria de esperar distribuições de 100 ou mais nanómetros dado que cada anél tem 50 nm de comprimento e estas localizações têm ainda a contribuição do comprimento dos dois anticorpos usados para fazer a marcação (10 a 15 nm cada). Estes resultados, embora promissores, carecem de futura optimização e confirmação uma vez que encontrámos estruturas não-específicas fora dos cromossomas e dos núcleos. Provavelmente estas estruturas devem-se a aglomeração do anticorpo secundário ou a ligação não-específica a proteínas presentes na preparação. De futuro será benéfico efectuar as marcações com fragmentos de anticorpos marcados com fluoróforos orgânicos. Estes são mais específicos e produzem marcações com menos ruído-de-fundo que os anticorpos policlonais tradicionais4. Também são moleculas menores, o que permite diminuir o erro de localização associado à introdução de vários anticorpos de ~10 nanómetros de tamanho na amostra5. Efectivamente, existem fragmentos de anticorpos contra GFP e, o laboratório consegue obter células com marcação GFP em cultura. Também será viável a criação de culturas primárias de cérebros de larvas de drosophila que têm uma percentagem elevada de células em divisão. Estas culturas primárias permitiria aproveitar a diversidade de linhas com marcação GFP existentes no laboratório. Também era objectivo deste trabalho abordar as Condensinas, mas não foi possível dentro do tempo disponível devido a limitações técnicas. Em resumo, descrevemos aqui um sistema e conjunto de protocolos que consegue obter imagens de super-resolução de pelo menos um dos complexos SMC. Imediatamente foi feita uma observação que permite começar a descartar um dos modelos prevalentes propostos para a organização das coesinas e acreditamos que estes são os primeiros passos para um sistema que consiga no futuro obter mais respostas sobre a função e organização dos complexos SMC.The protein complexes of the “Structural Maintenance of Chromosomes” family have important roles on chromosome structure: cohesin binds sister-chromatids together in order to allow their faithful segregation, and the condensins are responsible for chromosome condensation ahead of cell division, amongst other functions. Their structural distribution along DNA and their interaction with other DNA-bound proteins is currently the subject of intense investigations. This means that the development of tools which are able to determine the distribution of these complexes with greater reliability will allow new avenues of research. We have developed a super-resolution microscopy system and protocols capable of obtaining super-resolution images of the SMC complexes in Drosophila melanogaster cells. With this system we have successfully obtained images of the Rad21 subunit of cohesin and could demonstrate that it is restricted to a small axially defined region demarcating both sisterchromatids. In short, we present a system and protocols which can start to provide answers on the localization and function of the SMC complexes

Developing Highly Multiplexed Technology for High-throughput Super-resolution Fluorescence Microscopy

High-Throughput imaging can reconstruct complex signalling networks, reveal unknown interactions and capture rare cellular events. Simultaneously, the development of Single Molecule Localization Super Resolution Microscopy has enabled molecular-level structural information to be obtained in a single cell. But the increase in resolution comes at a trade-off for the amount of molecular species that can be imaged and the time it takes to acquire data, all of which limit the applicability of super-resolution to high-throughput work-flows. The present work details a framework to address this. It combines three independent approaches: a microscope hardware design approach to increase the amount of data that can be obtained in a Super-Resolution experiment; an optofluidics platform that can be wholly synchronized with most microscopes; and a sequential labelling framework to increase the number of species that can be imaged in Super-Resolution in a single cell. The hardware design is validated by performing Single Molecule Localization of cytoskeleton components and its throughput is shown to be up to an order of magnitude larger than a corresponding commercial system. We demonstrate a complete optofluidics platform to integrate microfluidics with a microscope, enabling live imaging, drug application, fixation, and staining in single cells synchronized with imaging protocols. Finally, we show an efficient sequential labelling protocol that is compatible with the optofluidics platform, enabling several molecular species to be imaged in the same cells. Overall, our approach increases the speed and amount of data that can be acquired in a single of Super-Resolution experiment, as well as, by performing on-line fixation, considerably improves our capacity for High-Throughput experiments in Super-Resolution imaging

Industrial insights into lot sizing and schedulingmodeling

© 2015 Brazilian Operations Research Society. Lot sizing and scheduling by mixed integer programming has been a hot research topic inthe last 20 years. Researchers have been trying to develop stronger formulations, as well as to incorporatereal-world requirements from different applications. This paper illustrates some of these requirements anddemonstrates how small- and big-bucket models have been adapted and extended. Motivation comes fromdifferent industries, especially from process and fast-moving consumer goods industries

O Poder de Agendamento: Imprensa e Ação Política na XII Legislatura em Portugal

Tese especialmente elaborada para obtenção do grau de Doutor em Ciência PolíticaOs media emergiram como o principal disseminador de mensagens políticas. A possibilidade de a cobertura mediática influenciar a ação política é, porem, algo distinto. Propomo-nos estudar a relação entre os media e a política em Portugal, recorrendo a um enquadramento conceptual que articula um processo de mudança social que eleva a importância dos media na prática política (mediatização da política) com o agendasetting político por parte dos media. Para isso analisámos o impacto da agenda da imprensa na agenda política, ou o efeito oposto - em que a agenda política influencia a agenda dos media impressos, a fim de determinar se, em Portugal, a imprensa teve poderes de definição da agenda política durante a XII legislatura. Por forma a responder a esta questão agimos duplamente: através de uma análise de conteúdo quantitativa, acompanhando dois temas específicos (Crime e Desemprego) na cobertura da imprensa diária (Diário de Notícias, Público e Jornal de Notícias) e na agenda política parlamentar (através da análise do Diário da Assembleia da República) durante a XII Legislatura; e estudando a perceção dos parlamentares portugueses sobre a influência de diferentes atores mediáticos e políticos no processo de definição da agenda política. Encontrámos evidências modestas de que os media condicionaram o agendamento político em apenas um dos temas selecionados, e que, quando tal aconteceu, foi de acordo com critérios de instrumentalização política. Adicionalmente, verificámos que, apesar de os deputados atribuírem grande influência aos media, continuam a reservar para os políticos o papel principal na determinação da agenda política e a demonstrar vontade de cooptar os media.The media have emerged as the main disseminator of political messages. The possibility that news coverage influences political action is, however, something different. We have proposed studying the relationship between media and politics in Portugal by resorting to a conceptual framework that articulates a social change process that elevates the importance of the media in regards to political practices (mediatization of politics) with the media’s political agenda-setting power. Therefore, we have analysed the impact of the press’ agenda on the political agenda, or the opposite effect – one, where the political agenda influences the printed press’ agenda -, in order to determine if the printed press had demonstrated any political agenda-setting abilities, throughout the XII Legislature in Portugal. To tackle this matter we used a double pronged approach: through a quantitative content analysis that accompanied two issues (Crime and Unemployment) in the daily national press (Diário de Notícias, Público e Jornal de Notícias) and in the parliamentary political agenda (measured in the Series I of Diário da Assembleia da República) throughout the XII Legislature; and by studying the perception of Portuguese parliamentarians regarding the influence of different media and political actors on the process of political agenda definition. We found modest evidence that the media conditioned the political agenda in only one of the two issues selected, and that, when it took place, it occurred in accordance with political instrumentalisation criterion. Additionally, we found that, even though the parliamentarians attributed great influence to the media, they still reserved the main role of political agenda determination to politicians and that they demonstrated a willingness to coopt the media.N/

A campanha presidêncial portuguesa de 2011: cobertura na imprensa

A comunicação política é parte fundamental do processo democrático, especialmente durante os momentos eleitorais. As campanhas eleitorais desenvolvem-se num sistema de comunicação política que tem sido sujeito ao longo dos tempos a diversas novas dinâmicas que alteraram profundamente o modo de atuação dos atores políticos, mediáticos e dos próprios cidadãos. Consequentemente, as práticas comunicativas eleitorais têm vindo a adaptar-se de forma a acompanhar estas mudanças. Procedeu-se à análise de conteúdo nos jornais Diário de Notícias, Público, Expresso e Sol de forma a perceber como a cobertura mediática aos vários candidatos às eleições presidenciais portuguesas em questão foi exposta, nomeadamente como seria enquadrada e se se recorreria maioritariamente ao jornalismo interpretativo, e se este refletiria alguma discussão acerca da expansão dos poderes presidenciais numa época que fazia prever uma agudizada crise económica e política. Não se tendo verificado um apelo à expansão dos poderes presidenciais, pôde-se, por outro lado, observar elevados níveis de enquadramentos estratégicos e o recurso a jornalismo não puramente descritivo

Consulta de enfermagem à pessoa com demência e cuidador familiar

Mestrado, Enfermagem Médico-Cirurgica - Pessoa Idosa, 2012, Escola Superior de Enfermagem de LisboaIntrodução Como consequência do envelhecimento da população, o número de pessoas com Doença de Alzheimer e outras demências tem aumentado de forma exponencial. A Demência é uma síndrome caraterizada por um declínio cognitivo e funcional global adquirido, que provoca um elevado grau de angústia, não só no próprio doente, como também, em todos os que com ele convivem no quotidiano. Ao nível do Centro Hospitalar de Setúbal, os doentes com demência e seus cuidadores familiares são acompanhados em consulta de Neurologia. Todavia, não existe uma consulta de enfermagem que permita um acompanhamento especializado, tendo sido evidenciada a necessidade da criação da mesma. De forma a adquirir competências, na prestação de cuidados especializados de enfermagem à pessoa com demência e cuidador familiar, para criar a referida consulta, considerámos fundamental realizar um percurso académico que nos permitisse atingir este objetivo. Metodologia De modo a atingir o objetivo principal, que é a aquisição de competências para a prestação de cuidados de enfermagem especializados à pessoa com demência e cuidador familiar, realizámos estágios de ensino clínico nos seguintes locais: Hospital do Mar- Serviço de Internamento de Longa Duração - Unidade de Demências; Centro Hospitalar de Lisboa Norte - Serviço de Consultas Externas do Hospital de S. Maria – Consulta de Demências; Associação Alzheimer Portugal – Lisboa - Centro de Dia, Apoio Domiciliário e Grupo de Suporte aos Cuidadores e Centro Hospitalar de Setúbal – Serviço de Consultas Externas do Hospital de S. Bernardo – Consulta de Neurologia. Nestes locais, são acompanhados doentes com patologia do foro demencial e seus familiares, por técnicos de saúde com formação altamente especializada. Ao longo do período de ensino clínico alicerçamos os conhecimentos práticos adquiridos para servirem de base à experiência clínica realizada. Resultados Tendo em conta os objetivos delineados, consideramos que no final deste trajeto académico, os mesmos foram atingidos de uma forma positiva. 4 Adquirimos competências na prestação de cuidados de enfermagem especializados à pessoa com demência e cuidador familiar. Conseguimos apresentar os pilares estruturantes para a realização de uma consulta de enfermagem dirigida à pessoa com demência e cuidador familiar. Conclusão Pelo percurso académico realizado, concluímos que para melhoria da prestação de cuidados de enfermagem à pessoa com demência e cuidador familiar é fundamental a aquisição de competências especializadas. Para atingirmos ganhos significativos na melhoria da qualidade de vida da pessoa com demência e cuidador familiar, reforçamos a importância da criação da consulta de enfermagem, ao nível do Centro Hospitalar de Setú

An adaptive large neighbourhood search for the operational integrated production and distribution problem of perishable products

Production and distribution problems with perishable goods are common in many industries. For the sake of the competitiveness of the companies, the supply chain planningof products with restricted lifespan should be addressed with an integrated approach. Particularly at the operational level, the sizing and scheduling of production lots have to bedecided together with vehicle routing decisions to satisfy the customers. However, such joint decisions make the problems hard to solve for industries with a large product portfolio. Thispaper proposes an adaptive large neighbourhood search (ALNS) framework to tackle the problem. This metaheuristic is well-known to be effective for vehicle routing problems. Theproposed approach relies on mixed-integer linear programming models and tools. The adaptive large neighbourhood search outperforms traditional procedures of the literature, namelyexact methods and x-and-optimize, in terms of quality of the solution and computational time of the algorithms. Nine in ten runs of ALNS yielded better solutions than traditional procedures and the best solution value found by the latter methods 12:7% greater than the former, on average.Production and distribution problems with perishable goods are common in many industries. For the sake of the competitiveness of the companies, the supply chain planning of products with restricted lifespan should be addressed with an integrated approach. Particularly, at the operational level, the sizing and scheduling of production lots have to be decided together with vehicle routing decisions to satisfy the customers. However, such joint decisions make the problems hard to solve for industries with a large product portfolio. This paper proposes an adaptive large neighbourhood search (ALNS) framework to tackle the problem. This metaheuristic is well known to be effective for vehicle routing problems. The proposed approach relies on mixed-integer linear programming models and tools. The ALNS outperforms traditional procedures of the literature, namely, exact methods and fix-and-optimize, in terms of quality of the solution and computational time of the algorithms. Nine in ten runs of ALNS yielded better solutions than traditional procedures, outperforming on average 12.7% over the best solutions provided by the latter methods

AKAP350 enables p150glued /EB1 interaction at the spindle poles

A-kinase anchoring protein 350 (AKAP350) is a centrosomal/Golgi scaffold protein, critical for the regulation of microtubule dynamics. AKAP350 recruits end-binding protein 1 (EB1) to the centrosome in mitotic cells, ensuring proper spindle orientation in epithelial cells. AKAP350 also interacts with p150glued, the main component of the dynactin complex. In the present work, we found that AKAP350 localized p150glued to the spindle poles, facilitating p150glued/EB1 interaction at these structures. Our results further showed that the decrease in AKAP350 expression reduced p150glued localization at astral microtubules and impaired the elongation of astral microtubules during anaphase. Overall, this study provides mechanistic data on how microtubule regulatory proteins gather to define microtubule dynamics in mitotic cells.Fil: Almada, Evangelina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; ArgentinaFil: Pariani, Alejandro Pedro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; ArgentinaFil: Rivabella Maknis, Tomás. Universidad Nacional de Rosario; ArgentinaFil: Hidalgo, Florencia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; ArgentinaFil: Vena, Rodrigo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Favre, Cristian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; ArgentinaFil: Larocca, Maria Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; Argentin

Planar Airy beam light-sheet for two-photon microscopy

We demonstrate the first planar Airy light-sheet microscope. Fluorescence light-sheet microscopy has become the method of choice to study large biological samples with cellular or sub-cellular resolution. The propagation-invariant Airy beam enables a ten-fold increase in field-of-view with single-photon excitation; however, the characteristic asymmetry of the light-sheet limits its potential for multi-photon excitation. Here we show how a planar light-sheet can be formed from the curved propagation-invariant Airy beam. The resulting symmetric light sheet excites two-photon fluorescence uniformly across an extended field-of-view without the need for deconvolution. We demonstrate the method for rapid two-photon imaging of large volumes of neuronal tissue.Comment: 7 pages, 4 figure