Applicability of the real-time PCR assay in the amplification of cyanobacterial DNA from preserved samples

Publicaciones del III Congreso Ibérico de Cianotoxinas (Blanes, 2013)The study and monitoring of cyanobacterial blooms often involves the use of preserved samples to avoid cellular degradation. However, preserved samples may not be suitable for molecular biology studies because preservation methods can interfere with DNA quality/quantity. Real-time quantitative PCR analysis (qPCR) has been widely applied in molecular analysis and is considered a promising method for monitoring purposes. This study intended to evaluate the applicability of the real-time qPCR technique in samples that were subjected to different methods of preservation: (1) 15% Lugol’s iodine solution (2) 4% formaldehyde and (3) 25% glutaraldehyde. The ability to amplify and quantify DNA extracted from Planktothrix agardhii was assessed using the rpoC1 gene as the target fragment in both raw water samples and in vitro cultures. No reliable DNA amplification was obtained from glutaraldehyde-preserved samples. Successful amplification was obtained from Lugol’s and formaldehyde-preserved samples. In this case, however, the quantification that was achieved by real-time PCR cannot be used to infer cell numbers, because the Ct values that were obtained from the Lugol’s and formaldehydepreserved samples were significantly higher than the Ct values that were obtained from the unpreserved samples. Therefore real-time PCR can be used for the detection and identification of cyanobacteria in preserved samples but no reliable cell quantification can be performed using this method.This research was supported by the Fundação para Ciência e Tecnologia, Portugal (FCT) through the project PPCDT/AMB/67075/2006. The authors also acknowledge the PhD research grant SFRH/BD65706/2009 to C. Churro and the Post-Doc research grant SFRH/BPD/75922/2011 to E. Valério

Evaluation of phylogenetic markers suitable for Planktothrix spp. discrimination

In Portugal, potentially toxic cyanobacteria from Planktothrix genus have become frequently observed in freshwater reservoirs. Identification of Planktothrix species through optical microscopy is complicated due to limited morphological differences among them. The aim of this work was to determine the most suitable phylogenetic markers that could be used for the molecular identification of Planktothrix species. In order to do so, several genes of interest were selected: rpoB, rpoC1, cpcA, cpcB, rbcX, 16S rRNA genes and 16S rRNA–tRNAIle–tRNAAla-23S rRNA internal transcribed spacer (ITS), and their sequences retrieved from public databases. Phylogenetic analysis showed that 16S rRNA, cpcA, rbcX genes and ITS region trees do not allow a clear discrimination of Planktothrix species, however cpcB and rpoB seemed putative suitable phylogenetic markers for Planktothrix species identification. The applicability of these markers was then evaluated in 20 Planktothrix isolates, isolated over the years from several Portuguese freshwater reservoirs and maintained in the Estela Sousa e Silva Algae Culture Collection (ESSACC). The selected genes, cpcB and rpoB, were amplified by PCR and sequenced and the resulting trees compared with the phylogenetic clustering obtained with our previously characterized rpoC1 phylogenies. The phylogenetic analyses, based on the three gene regions, revealed that Planktothrix isolates analyzed in this study could be phylogenetically resolved into their corresponding species. This work contributes for the discussion of the appropriate genes that can be used in phylogenetic identification of Planktothrix species.The authors would like to thank the Ph.D research grant SFRH/BD65706/2009 to Catarina Churro and the financial support through project PPCDT/AMB/60675/2006 both given by Fundação para a Ciência e Tecnologia (Portugal)

Avaliação do efeito da microcistina-LR no crescimento, sistema antioxidante e indução de apoptose em Saccharomyces cerevisiae

Neste trabalho pretendeu-se usar a levedura Saccharomyces cerevisiae como modelo para compreender melhor os mecanismos de toxicidade induzidos pela microcistina-LR. Este é o organismo eucariótico mais simples e estudado que tem sido amplamente utilizado como modelo no estudo de mecanismos de toxicidade, devido à facilidade de acesso à informação sobre o seu genoma (totalmente sequenciado e anotado), proteoma e processos bioquímicos correspondentes.Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Programa Operacional Potencial Humano, pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia através da Bolsa de pós-doc SFRH/BPD/75922/2011 e o Projeto PEst-C/MAR/LA0015/2013

Metodologia para diagnóstico rápido de áreas de recarga de aquíferos

The environmental tools of local appliance, such as surveillance and permits of deforestations and water use, environmental impact assessments of local scale, and delimitation of preservation areas, demand customized methodologies to deal with hydrogeological issues. In this study, a structured one for rapid environmental assessment aiming at recharge of aquifers safety was presented. This comprises qualitative and quantitative evaluations by means of textual and cartographical descriptions, complemented by weighted spreadsheets for rapid assessment. Applications in case studies took place in sites selected in the Paracatu River Basin. The results showed a positive potential for knowledge and protection of aquifers in micro-watersheds.Os instrumentos ambientais de aplicação local, tais como fiscalização, autorizações de desmate e de uso da água, estudos de impacto ambiental, de impacto local e averbações de reserva legal, demandam metodologias customizadas para o tratamento de questões hidrogeológicas. Neste estudo, apresentou-se um método estruturado para o diagnóstico ambiental expedito visando à segurança da recarga de aquíferos. Este constitui-se de avaliações qualitativas e quantitativas por meio de descrições textuais e cartográficas, complementadas por planilhas ponderadas para análise rápida. Aplicações em estudos de caso foram realizadas em locais selecionados na Bacia do Rio Paracatu. Os resultados mostraram potencial positivo para o conhecimento e a proteção de aquíferos em microbacias

Temporal variability of microcystin (mcyA) genotypes in a toxic cyanobacterial bloom

In this work a perennial bloom was monitored during two years (2012-2014) in order to characterize the genotype structure and succession.FCT-Ph.D research grant SFRH/BD65706/2009info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Quantificação dos componentes de vazão por meio de filtros recursivos: estudo de caso da Bacia do Rio Paracatu (SF-7), Brasil

A quantificação dos componentes de vazão é importante para a gestão de recursos hídricos. Empregaram-se, neste estudo, filtros recursivos de sinais para delimitação dos fluxos de base, interfluxo e rápido de sub-bacias aninhadas na Bacia do Rio Paracatu (SF-7). Preliminarmente, os dados de vazão tiveram sua consistência avaliada por meio de análises de estacionalidade e preenchimento multivariado das lacunas de dados. Apresenta-se uma metodologia em que os filtros são calibrados pela influência do escoamento superficial e pela inflexão na curva de recessão do período sazonal de seca. Os filtros foram aprimorados por uma restrição lógica, que limita a sobre-estimação da vazão à cada iteração do algoritmo. Os resultados foram condizentes com estudos prévios e com mapeamentos hidrogeológicos e climatológicos.The quantification of flow components is important for water resource management. The base, interflow, and runoff flows of nested basins of the Paracatu River (SF-7) were estimated with recursive signal filters in this study. At first, stationary analysis and multivariate gap filling were applied to the flow data. A methodology is presented, proposing filter calibration with the runoff influence and inflection of the recession curve for dry season. Filters are improved with a logic constraint that limits water flow overestimation within algorithm iteration. The results were coherent with previous studies and with hydrogeological and climatological maps

Uso da levedura Saccharomyces cerevisiae para elucidar mecanismos de toxicidade da microcistina-LR

Até à data, foram já efetuados diversos estudos com vários organismos e linhas celulares para desvendar os mecanismos moleculares de toxicidade da microcistina, uma das mais frequentes hepatotoxinas produzida por cianobactérias. Em células de mamíferos, o mecanismo de toxicidade da microcistina é atribuída a um processo que envolve várias vias, um deles relacionado com a inibição das fosfatases proteicas PP1 / PP2A e outro com a produção de espécies reativas de oxigénio (ROS). Contudo, existem ainda algumas lacunas na identificação destes mecanismos, que impede a total caracterização do modo de ação desta toxina. Por forma a contribuir para a elucidação dos mecanismos de toxicidade da variante química microcistina-LR (MCLR), neste estudo foram avaliados os efeitos de várias concentrações de MCLR nos níveis de ROS, resposta do sistema antioxidante, indução de apoptose, expressão diferencial de proteínas e alteração da expressão génica na levedura Saccharomyces cerevisiae. Verificou-se que após coloração das células com fluorocromos, a exposição das células à toxina induziu um aumento dos níveis intracelulares dos ROS. Este aumento provocou uma ativação do sistema antioxidante, especialmente na resposta da catalase. Além disso, observou-se uma inibição da superóxido dismutase citosólica, o que em conjunto com o tipo de espécies reativas de oxigénio passíveis de estarem presentes, sugere que a ROS maioritariamente induzida é peróxido de hidrogénio (H2O2). Observaram-se ainda sinais de apoptose após avaliação por citometria de fluxo, usando um kit de Anexina V-FITC. Da análise proteómica, verificou-se que 14 proteínas foram diferencialmente expressas nas células expostas a diferentes concentrações de MCLR, quando comparada com o controlo. A análise da expressão relativa dos genes homólogos das PP1/PP2A e de genes BER envolvidos na reparação de DNA revelou que alguns destes apresentaram respostas diferenciais, dependentes da concentração de toxina usada. Os resultados obtidos neste estudo demonstram que a levedura Saccharomyces cerevisiae VL3 apresenta alguns dos principais efeitos tóxicos induzidos pela microcistina-LR em eucariotas superiores e o seu uso revelou que existem proteínas e genes alterados pela exposição à MCLR que são transversais a vários modelos eucarióticos

PROTÓTIPO DE SISTEMA ESPECIALISTA PARA AUXÍLIO À DECISÃO EM DIREITO AMBIENTAL - SITUAÇÕES DE DESMATAMENTOS RURAIS

The paper presents the process of development of an artificial intelligence, AI, software prototype for environmental management developed in CETEC within the scope of Project CRHA (2003-2006). This software is a tool for helping the user in his/her way of dealing with the rural environment, and offers geo-environmental and juridical education for dealing with common situations in this context. This paper is useful for bringing into evidence the viability of computational applications of AI in respect to Agrarian and Environmental Geosciences and Juridical sciences. It is also a demonstration of the potentials of logical analysis to scientific and technical knowledge.Este artigo visa a apresentar o processo de desenvolvimento de um protótipo de programa de inteligência artificial voltado para a gestão ambiental, desenvolvido ao longo do projeto CRHA (2003-2006). Este programa se propõe a auxiliar o usuário em sua conduta para com o meio ambiente rural, fornecendo educação ambiental e jurídica para melhor lidar com situações comuns neste contexto. Este trabalho é útil para demonstrar a viabilidade de aplicações computacionais futuras, envolvendo as Geociências Agrárias e Ambientais e Ciências Jurídicas, demonstrando também as potencialidades da análise lógica aplicada aos conhecimentos técnicos e científicos