Neste trabalho pretendeu-se usar a levedura Saccharomyces cerevisiae
como modelo para compreender melhor os mecanismos
de toxicidade induzidos pela microcistina-LR. Este é o organismo
eucariótico mais simples e estudado que tem sido amplamente
utilizado como modelo no estudo de mecanismos de toxicidade,
devido à facilidade de acesso à informação sobre o seu genoma
(totalmente sequenciado e anotado), proteoma e processos bioquímicos
correspondentes.Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Programa
Operacional Potencial Humano, pela Fundação para a Ciência e a
Tecnologia através da Bolsa de pós-doc SFRH/BPD/75922/2011 e o
Projeto PEst-C/MAR/LA0015/2013

Campos, Alexandre

Pereira, Paulo

Valério, Elisabete

Vasconcelos, Vitor

Vilares, Arminda

Repositório Científico do Instituto Nacional de Saúde

23artigos breves_   n. 7 _Saúde Ambiental_Avaliação do efeito da microcistina-LR no crescimento, sistema antioxidante e indução de apoptose em Saccharomyces cerevisiae  Elisabete Valério1, 2, Arminda Vilares1, Alexandre Campos 2, Paulo Pereira1, Vitor Vasconcelos 2,3 elisabete.valerio@insa.min-saude.pt (1) Unidade de Água e Solo. Departamento de Saúde Ambiental, INSA.(2) Centro Interdisciplinar de Investigação Marinha e Ambiental, Universidade  do Porto.(3) Departamento de Biologia. Faculdade de Ciências, Universidade do Porto._IntroduçãoAlgumas das toxinas mais comuns presentes na água doce são produzidas por cianobactérias, em particular as microcistinas (MC) Estas toxinas são conhecidas por causar hepatotoxicidade aguda em humanos e animais e por atuarem como promotores tumorais sendo reconhecidas pela International Agency for Research on Cancer (IARC), como agentes potencialmente carcinogénicos para o ser humano (1). Em células de mamíferos, o mecanismo de to-xicidade das microcistinas é atribuída a um processo que envol-ve várias vias, um deles relacionado com a inibição das fosfatases proteicas PP1 / PP2A e a produção de espécies reativas de oxigé-nio (ROS) (2). Porém, a informação toxicológica e epidemiológica disponível não permite ainda estabelecer inequivocamente uma re-lação causa-efeito entre a exposição humana às MC e efeitos ad-versos na saúde.Neste trabalho pretendeu-se usar a levedura Saccharomyces ce-revisiae como modelo para compreender melhor os mecanismos de toxicidade induzidos pela microcistina-LR. Este é o organismo eucariótico mais simples e estudado que tem sido amplamente utilizado como modelo no estudo de mecanismos de toxicidade, devido à facilidade de acesso à informação sobre o seu genoma (totalmente sequenciado e anotado), proteoma e processos bio-químicos correspondentes. Acresce que cerca de 31% das proteí-nas codificadas no genoma da levedura têm um ortólogo humano e aproximadamente 50% dos genes de doenças humanas têm um ortólogo na levedura. Existe ainda uma elevada conservação das estruturas celulares e enzimáticas e resposta ao stress oxidativo como nos eucariotas superiores (3)._ObjetivosNeste estudo pretendeu-se avaliar os efeitos de várias concentra-ções de microcistina-LR (MCLR) no crescimento, níveis de ROS, resposta do sistema antioxidante e indução de apoptose na leve-dura Saccharomyces cerevisiae._MetodologiaNa figura 1 está representada a abordagem metodológica empre-gue para avaliar os efeitos da MCLR nas células da levedura comercial Saccharomyces cerevisiae VL3 (Zymaflore).Figura 1:      Abordagem metodológica empregue para avaliar os efeitos da MCLR nas células da levedura comercial Saccharomyces cerevisiae VL3 (Zymaflore).Efeito de cinco concentrações de MCLRVerificar impacto no crescimentoNíveis de ROSTipos de ROS induzidosVerificar os ROSResposta do sistema antioxidanteStress oxidativoIndução de apoptoseApoptoseInstituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológicowww.insa.pt2ª sérienúmero1124artigos breves_   n. 7_Resultados e discussãoVerificou-se que o crescimento microbiano não foi inibido na presen-ça das várias concentrações de toxina testadas (1 nM, 10 nM, 1 µM, 10 µM e 100 µM), relativamente ao controlo. Contudo, após coloração das células com fluorocromos, verificou-se que a exposição das células à toxina induziu um aumento dos níveis intracelulares dos ROS totais, como se pode verificar no gráfico 1. A presença de 1 nM de MCLR provocou um aumento de 11% enquanto a concentração de 1 µM de MCLR levou a um aumento de 14% dos níveis de fluorescência. A presença de H2O2 foi usada como contro-lo positivo, em que a concentração de 3 mM causou um aumento de 11% vs. 57% de aumento induzido pela presença de 25 mM de H2O2. Este aumento provocou uma ativação do sistema antioxidante, es-pecialmente na resposta da catalase, em que se observou o dobro da atividade relativa com 1 nM de MCLR e um aumento de 60% com 1 µM de MCLR. Além disso, observou-se uma inibição da SOD1,com uma diminuição de 40% com 1 nM de MCLR e menos 20% com 1 µM MCLR. Este resultado, em conjunto com os tipos de ROS possivelmente presentes, sugere que a espécie reativa de oxigénio maioritariamente induzida seja o peróxido de hidrogénio (H2O2) (4). Podemos supor que o aumento da atividade relativa da catalase foi a forma das células superarem o aumento dos níveis de ROS, levando à eliminação dos mesmos, o que pode explicar a ausência de impacto da presença da toxina no crescimento da levedura.Observaram-se ainda sinais de apoptose após coloração das célu-las in vivo com DAPI e também após avaliação das células coradas com um kit de Anexina V-FITC / iodeto de propídeo por citometria de fluxo (gráfico 2). _ConclusõesOs resultados obtidos neste estudo demonstram que a levedura Saccharomyces cerevisiae VL3 apresenta alguns dos principais efeitos tóxicos induzidos pela microcistina-LR em eucariotas su-periores. Esta levedura, comprovou assim ser um simples e bom modelo eucariótico para futuramente estudar em mais detalhe os mecanismos moleculares de toxicidade induzidos pela microcis-tina-LR.Gráfico 1:      Fluorescência mediana (± desvio padrão) das células coradas com Dihidrorodamina 123 (DHR123) para avaliar os níveis intracelulares globais de ROS (n=200). 8007060504030201007006005004003002001000* * **Fluorescência mediana% de célulasCélulascontrolo1 nMMCLR1 µMMCLR1 µMMCLR1 nMMCLR10 µMMCLRControlopositivo3 mMH2O225 mMH2O2* Diferenças signif icativas entre as células tratadas e as células controlo (p < 0,05).Determinação por citometria de f luxo após coloração das células com um   kit de Anexina V / Iodeto de propídioGráfico 2:      Percentagem de células (média ± σ) em início de apoptose (azul), apoptose tardia (amarelo) e necrose (laranja) após exposição a MCLR (n = 3).Anexina V+/PI- Anexina V+/PI+ Anexina V-/PI+Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológicowww.insa.pt2ª sérienúmero1125artigos breves_   n. 7AgradecimentosOs autores agradecem ao prof. Rui Malhó pelo apoio nos ensaios de f luorescência. Este trabalho foi parcialmente f inanciado pelo Programa Operacional Potencial Humano, pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia através da Bolsa de pós-doc SFRH/BPD/75922/2011 e o Projeto PEst-C/MAR/LA0015/2013.Referências bibliográficas:(1) IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Ingested nitrate and nitr ite and cyanobacterial peptide toxins. Lyon: International Agency for Research on Cancer, 2006. p. 326-412. (IARC monographs on the evaluation of carcinogenic r isks to humans; 94). (2) Campos A, Vasconcelos V. Molecular mechanisms of microcystin toxicity in animal cells. Int J Mol Sci. 2010;11(1):268-87.(3) Menacho-Márquez M, Murguía JR. Yeast on drugs: Saccharomyces cerevisiae as a tool for anticancer drug research. Clin Transl Oncol. 2007;9(4):221-8.(4) Bowler C, Van Camp W, Van Montagu M, et al. Superoxide dismutase in plants. Crit Rev Plant Sci. 1994;13(3):199–218Artigo adaptado de: Valério E, Vilares A, Campos A, et al. Ef fects of microcystin-LR on Saccharomyces cerevisiae growth, oxidative stress and apoptosis. Toxicon. 2014;90:191-8.Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológicowww.insa.pt2ª sérienúmero11LINKLINK

Avaliação do efeito da microcistina-LR no crescimento, sistema antioxidante e indução de apoptose em Saccharomyces cerevisiae

As hepatotoxinas microcistinas são mundialmente frequentemente encontradas em corpos de água doce. Estas são conhecidas por causar hepatotoxicidade aguda em humanos / animais, promoção de tumores em animais e ao seu potencial carcinogénico. Em células de mamíferos, o mecanismo de toxicidade das microcistinas é atribuída a um processo que envolve várias vias, um deles relacionado com a inibição das fosfatases proteicas PP1 / PP2A e a produção de espécies reativas de oxigénio (ROS). No entanto, uma vez que ainda não estão completamente caracterizados os mecanismos moleculares de ação das microcistinas e os efeitos correspondentes, não é possível ainda fazer a identificação completa destes compostos tóxicos. Neste estudo foram avaliados os efeitos de várias concentrações de microcistina-LR no crescimento, níveis de ROS, resposta do sistema antioxidante e indução de apoptose da levedura Saccharomyces cerevisiae. Verificou-se que o crescimento microbiano não foi inibido na presença das várias concentrações de toxina. Contudo, após coloração das células com fluorocromos, verificou-se que a exposição das células à toxina induziu um aumento dos níveis intracelulares dos ROS. Este aumento provocou uma ativação do sistema antioxidante, especialmente na resposta da catalase. Além disso, observou-se uma inibição da SOD1, o que em conjunto com o tipo de ROS possivelmente presente, sugere que a espécie reativa de oxigénio maioritariamente induzida é peróxido de hidrogénio (H2O2). Observaram-se ainda sinais de apoptose após coloração das células com DAPI e após avaliação por citometria de fluxo, usando um kit de Anexina V-FITC. Os resultados obtidos neste estudo demonstram que a levedura Saccharomyces cerevisiae VL3 apresenta alguns dos principais efeitos tóxicos induzidos pela microcistina-LR em eucariotas superiores. Esta levedura, comprovou assim ser um simples e bom modelo eucariótico para estudar em mais detalhe os mecanismos moleculares de toxicidade induzidos pela microcistina-LR

Avaliação do efeito da microcistina-LR no crescimento, sistema antioxidante e indução de apoptose em Saccharomyces cerevisiae

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Scientific Repository of the National Health Institute Doutor Ricardo Jorge

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