Lyophilized human cells stored at room temperature preserve multiple RNA species at excellent quality for RNA sequencing

K

Extensive epigenetic and transcriptomic variability between genetically identical human B-lymphoblastoid cells with implications in pharmacogenomics research

L

STAT2/IRF9 directs a prolonged ISGF3-like transcriptional response and antiviral activity in the absence of STAT1

L

Funkcionális genomikai vizsgálatok során alkalmazható kísérletes eszközök fejlesztése és jellemzése

A funkcionális genomikai módszerek, amelyek lehetővé teszik a génszabályozás különböző aspektusainak genomszintű vizsgálatát, az elmúlt évtizedben látványos fejlődésen és érésen mentek keresztül. Emellett a meglévő források hatékonyabb felhasználásának érdekében új tudományos együttműködési platformok jelentek meg. A doktori értekezés három fő témakör keretében tárgyalja a funkcionális genomika tudományterülethez kapcsolódó fejlesztési és vizsgálati eredményeinket. Munkánk során kifejlesztettünk egy új, bakteriofág-alapú spike-in folyamatkontroll rendszert kromatin immunprecipitációs (ChIP) kísérletekhez; továbbá vizsgáltuk a sejtliofilezés alkalmasságát mint potenciálisan költséghatékony RNS-archiválási módszer; valamint elsőként vizsgáltuk a széles körben alkalmazott humán B-limfoblasztoid sejtvonal (LCL) modell DNS-szekvenciától független funkcionális genomikai variabilitásának kvalitatív és kvantitatív sajátságait. Mivel a ChIP módszer nem rendelkezik széles körben elfogadott folyamatkontrollokkal, munkánk során in vitro evolúciós módszerrel kifejlesztettünk olyan, felszínükön különböző peptideket bemutató bakteriofágokat, amelyek erősen kötődnek különböző ChIP-minőségű, transzkripciós faktor-ellenes antitestekhez. Ezen reagensek egyszerűen sokszorozhatóak, és heterológ külső kontrollként használhatóak a kísérletes mintaveszteség normalizálására. A ChIP mellett az RNS szekvenálás is széles körben elterjedt funkcionális genomikai módszer, amely alkalmas biológialag releváns sejtállapotok transzkriptomikai jellemzésére. Az RNS-alapú vizsgálatokra szánt szövetek fagyasztott állapotban történő tárolása jelentős működtetési költségekkel és környezeti terheléssel jár. Munkánk során megvizsgáltuk a potenciálisan költséghatékony sejtliofilezés és az azt követő szobahőmérsékleten történő mintatárolás hatását az izolált celluláris RNS minőségére. Míg az epigallokatekin-gallát nem bizonyult alkalmas lioprotektánsnak RNS-alapú vizsgálatokhoz, a D-trehalóz megfelelő védelmet nyújtott liofilezés és többhetes szobahőmérsékleten történő tárolás során, magas kitermelést és kiváló RNS-minőséget eredményezve mind alacsony-, mind magas áteresztőképességű vizsgálatokhoz. A humán LCL sejtvonal modellrendszert széles körben alkalmazzák a génexpressziós szabályozás általános szabályszerűségeinek és genetikai hátterének vizsgálatára. Ennek tükrében nagy jelentőséggel bírhat az egyes LCL sejtvonalak közötti genotípus-független funkcionális genomikai variabilitás jellegének és mértékének ismerete. Öt, azonos személyből származó LCL sejtonal vizsgálata során kimutattuk, hogy az aktív (H3K27ac-jelölt) génszabályozó elemek közel negyede mutat variábilis acetilációt, amely enyhébb transzkriptóm-variabilitással párosult. Továbbá a génexpressziós eltérések kemoterápiás szerekkel szembeni eltérő sejtválaszt okozhatnak, így javasolt az RNS-szintek beépítése az LCL-alapú QTL-vizsgálati tervekbe. Összegezve, eredményeink kiindulási pontként szolgálhatnak a költséghatékonyabb és racionálisabb kísérlettervezéshez a funkcionális genomika keretein belül.The past decade has witnessed the rapid development and maturation of functional genomics methods, which provide genome-wide view on various aspects of gene regulation, as well as the emergence of novel approaches to sharing scientific resources. We aimed at contributing to the field of functional genomics in three ways: first, by developing a novel, bacteriophage-based spike-in procedural control system for chromatin immunoprecipitation (ChIP); second, by evaluating the utility of cell lyophilization as a potentially cost-effective means to preserve RNA as an analyte; and third, by uncovering, for the first time, the extent and nature of non-DNA-driven functional genomic variability of the widely used human B-lymphoblastoid cell line model. In our efforts to address the long-standing need for ChIP procedural controls, we developed peptide-displaying bacteriophages which strongly bind various ChIP-grade anti-transcription factor antibodies using in vitro evolution. These reagents are renewable, and may be used as heterologous external controls (normalizers) to account for experimental sample loss. RNA sequencing, another widespread functional genomics method, is used to uncover transcriptomic signatures of biologically relevant cellular states. The frozen storage of tissues intended for RNA-based experimental use is associated with high operational costs and environmental burden. We assessed the utility of lyophilization as a potentially cost-effective cell preservation and storage method for cellular samples. While epigallocatechin-gallate was found not to be suitable as a cellular lyoprotectant for RNA-based studies, D-trehalose provided sufficient RNA protection during lyophilization and weeks of room temperature storage, resulting in high yields and excellent RNA quality for both low-throughput methods and RNA sequencing. As the human B-lymphoblastoid cell line model system is widely used for uncovering general rules and genomic context of gene regulation. we investigated the extent and nature of LCL-to-LCL functional genomic variability in the same genotype context. Using five LCLs from the same individual we showed that almost one-fourth of active (H3K27ac-marked) gene regulatory elements were variably acetylated, coupled to a modest transcriptomic variability. Additionally, isogenic gene expression variability may affect chemotherapeutic drug response, as shown in the example of the DPYD gene and 5-fluorouracil. Therefore it is suggested to consider baseline RNA levels during LCL-based quantitative trait locus mapping study design. In summary, our results provide a baseline for more cost-effective and rational experimental design in the framework of functional genomics

Labelled regulatory elements are pervasive features of the macrophage genome and are dynamically utilized by classical and alternative polarization signals

The concept of tissue-specific gene expression posits that lineage-determining transcription factors (LDTFs) determine the open chromatin profile of a cell via collaborative binding, providing molecular beacons to signal-dependent transcription factors (SDTFs). However, the guiding principles of LDTF binding, chromatin accessibility and enhancer activity have not yet been systematically evaluated. We sought to study these features of the macrophage genome by the combination of experimental (ChIP-seq, ATAC-seq and GRO-seq) and computational approaches. We show that Random Forest and Support Vector Regression machine learning methods can accurately predict chromatin accessibility using the binding patterns of the LDTF PU.1 and four other key TFs of macrophages (IRF8, JUNB, CEBPA and RUNX1). Any of these TFs alone were not sufficient to predict open chromatin, indicating that TF binding is widespread at closed or weakly opened chromatin regions. Analysis of the PU.1 cistrome revealed that two-thirds of PU.1 binding occurs at low accessible chromatin. We termed these sites labelled regulatory elements (LREs), which may represent a dormant state of a future enhancer and contribute to macrophage cellular plasticity. Collectively, our work demonstrates the existence of LREs occupied by various key TFs, regulating specific gene expression programs triggered by divergent macrophage polarizing stimuli.This work has been supported by Hungarian Scientific Research Fund [NKFIH K116855, K124298, KH126885 to L.N.]; GINOP-2.3.2-15-2016-0006; GINOP-2.1.7-15-2016-01487; NIH [R01DK115924]; Campus Hungary Scholarship at Centro Nacional de Análisis Genómico (to A.H.); American Heart Association (AHA) [17POST33660450 to B.D.]. Funding for open access charge: Hungarian Scientific Research Fund [NKFIH K116855, K124298, KH126885]; NIH [R01DK115924]; GINOP 2.1.7-15-2016-01487; GINOP 2.3.2-15-2016-000

Labelled regulatory elements are pervasive features of the macrophage genome and are dynamically utilized by classical and alternative polarization signals

The concept of tissue-specific gene expression posits that lineage-determining transcription factors (LDTFs) determine the open chromatin profile of a cell via collaborative binding, providing molecular beacons to signal-dependent transcription factors (SDTFs). However, the guiding principles of LDTF binding, chromatin accessibility and enhancer activity have not yet been systematically evaluated. We sought to study these features of the macrophage genome by the combination of experimental (ChIP-seq, ATAC-seq and GRO-seq) and computational approaches. We show that Random Forest and Support Vector Regression machine learning methods can accurately predict chromatin accessibility using the binding patterns of the LDTF PU.1 and four other key TFs of macrophages (IRF8, JUNB, CEBPA and RUNX1). Any of these TFs alone were not sufficient to predict open chromatin, indicating that TF binding is widespread at closed or weakly opened chromatin regions. Analysis of the PU.1 cistrome revealed that two-thirds of PU.1 binding occurs at low accessible chromatin. We termed these sites labelled regulatory elements (LREs), which may represent a dormant state of a future enhancer and contribute to macrophage cellular plasticity. Collectively, our work demonstrates the existence of LREs occupied by various key TFs, regulating specific gene expression programs triggered by divergent macrophage polarizing stimuli.This work has been supported by Hungarian Scientific Research Fund [NKFIH K116855, K124298, KH126885 to L.N.]; GINOP-2.3.2-15-2016-0006; GINOP-2.1.7-15-2016-01487; NIH [R01DK115924]; Campus Hungary Scholarship at Centro Nacional de Análisis Genómico (to A.H.); American Heart Association (AHA) [17POST33660450 to B.D.]. Funding for open access charge: Hungarian Scientific Research Fund [NKFIH K116855, K124298, KH126885]; NIH [R01DK115924]; GINOP 2.1.7-15-2016-01487; GINOP 2.3.2-15-2016-000