Semen quality and the excretion of lumpy skin disease virus in semen following vaccination and experimental challenge of vaccinated bulls

The aim of this study was to determine the efficacy of vaccination in preventing LSDV excretion in semen and negative effects on semen quality. Lumpy skin disease (LSD) is caused by a virus in the genus Capripoxvirus of the family Poxviridae. The virus has been reported to be excreted in the semen of experimental infected nonvaccinated bulls. Nevertheless, vaccination has been the most widely used method to reduce and prevent the spread of the disease. This work was done to determine the efficacy of lumpy skin disease vaccination in preventing the excretion of lumpy skin disease virus (LSDV) in semen of experimentally infected vaccinated bulls. It also determined further the effect of vaccination and experimental infection on semen quality. Six serologically negative bulls 11-16 months of age were vaccinated with an attenuated Neethling strain of LSD vaccine, and a repeated dose of vaccine was given twenty one days later. These bulls were then experimentally infected by intravenous injection with a virulent field strain of LSDV (V248/93). Six unvaccinated bulls were similarly infected to act as controls. All animals were observed for clinical signs, blood and semen was collected and evaluated twice a week until day 40 post vaccination and every two days until day 28 post-infection when the trial was terminated. Serology was done using the serum neutralization test and viraemia was determined by virus isolation. Semen was examined by polymerase chain reaction (PCR) for the presence of virus. Semen evaluation was done visually and microscopically. Two of the unvaccinated controls developed severe LSD, two showed mild symptoms and two were asymptomatic. No clinical abnormalities were detected following vaccination, and clinical signs were limited to mild lymph node enlargement in four bulls following challenge of the vaccinated bulls. There was a significant difference (P0.05) following vaccination and challenge. Three of the vaccinated bulls were serologically positive at the time of experimental infection and four at the end of the trial. Five unvaccinated bulls were found to be viraemic during the course of the trial. No vaccinated bulls were found to be viraemic at any stage. Four unvaccinated bulls excreted the virus in their semen during the course of the trial. Viral nucleic acid was not detected in any semen samples following vaccination or challenge in vaccinated bulls. This study provides evidence that vaccination against LSD prevented the excretion of viral particles in semen. It also illustrated that LSD vaccination prevented any effect on semen quality after experimental infection with virulent virus.Dissertation (MSc (Production Animal Studies))--University of Pretoria, 2006.Production Animal Studiesunrestricte

A protein-coding gene expression atlas from the brain of pregnant and non-pregnant goats

Background: The brain is an extraordinarily complex organ with multiple anatomical structures involved in highly specialized functions related with behavior and physiological homeostasis. Our goal was to build an atlas of protein-coding gene expression in the goat brain by sequencing the transcriptomes of 12 brain regions in seven female Murciano-Granadina goats, from which three of them were 1-month pregnant. Results: Between 14,889 (cerebellar hemisphere) and 15,592 (pineal gland) protein-coding genes were expressed in goat brain regions, and most of them displayed ubiquitous or broad patterns of expression across tissues. Principal component analysis and hierarchical clustering based on the patterns of mRNA expression revealed that samples from certain brain regions tend to group according to their position in the anterior-posterior axis of the neural tube, i.e., hindbrain (pons and medulla oblongata), midbrain (rostral colliculus) and forebrain (frontal neocortex, olfactory bulb, hypothalamus, and hippocampus). Exceptions to this observation were cerebellum and glandular tissues (pineal gland and hypophysis), which showed highly divergent mRNA expression profiles. Differential expression analysis between pregnant and non-pregnant goats revealed moderate changes of mRNA expression in the frontal neocortex, hippocampus, adenohypophysis and pons, and very dramatic changes in the olfactory bulb. Many genes showing differential expression in this organ are related to olfactory function and behavior in humans. Conclusion: With the exception of cerebellum and glandular tissues, there is a relationship between the cellular origin of sampled regions along the anterior-posterior axis of the neural tube and their mRNA expression patterns in the goat adult brain. Gestation induces substantial changes in the mRNA expression of the olfactory bulb, a finding consistent with the key role of this anatomical structure on the development of maternal behavior

A protein-coding gene expression atlas from the brain of pregnant and non-pregnant goats

[Background] The brain is an extraordinarily complex organ with multiple anatomical structures involved in highly specialized functions related with behavior and physiological homeostasis. Our goal was to build an atlas of protein-coding gene expression in the goat brain by sequencing the transcriptomes of 12 brain regions in seven female Murciano-Granadina goats, from which three of them were 1-month pregnant.[Results] Between 14,889 (cerebellar hemisphere) and 15,592 (pineal gland) protein-coding genes were expressed in goat brain regions, and most of them displayed ubiquitous or broad patterns of expression across tissues. Principal component analysis and hierarchical clustering based on the patterns of mRNA expression revealed that samples from certain brain regions tend to group according to their position in the anterior-posterior axis of the neural tube, i.e., hindbrain (pons and medulla oblongata), midbrain (rostral colliculus) and forebrain (frontal neocortex, olfactory bulb, hypothalamus, and hippocampus). Exceptions to this observation were cerebellum and glandular tissues (pineal gland and hypophysis), which showed highly divergent mRNA expression profiles. Differential expression analysis between pregnant and non-pregnant goats revealed moderate changes of mRNA expression in the frontal neocortex, hippocampus, adenohypophysis and pons, and very dramatic changes in the olfactory bulb. Many genes showing differential expression in this organ are related to olfactory function and behavior in humans.[Conclusion] With the exception of cerebellum and glandular tissues, there is a relationship between the cellular origin of sampled regions along the anterior-posterior axis of the neural tube and their mRNA expression patterns in the goat adult brain. Gestation induces substantial changes in the mRNA expression of the olfactory bulb, a finding consistent with the key role of this anatomical structure on the development of maternal behavior.This research was funded by the European Regional Development Fund (FEDER)/Ministerio de Ciencia e Innovación—Agencia Estatal de Investigación/Project Reference grants: AGL2016-76108-R and also by project PID2019-105805RB-I00 funded by MCIN/AEI/10.13039/501100011033. We also acknowledge the support of the CERCA Programme/Generalitat de Catalunya and of the Spanish Ministry of Economy and Competitivity for the Center of Excellence Severo Ochoa 2020-2023 (CEX2019-000902-S) grant awarded to the Centre for Research in Agricultural Genomics (CRAG, Bellaterra, Spain). Maria Luigi-Sierra was funded with a PhD fellowship “Formación de Personal Investigador” (BES-2017-079709) awarded by the Spanish Ministry of Economy and Competitivity and by “ESF Investing in your future”. Dailu Guan was funded by a PhD fellowship from the China Scholarship Council (CSC). Emilio Mármol-Sánchez was funded with a FPU Ph.D. grant from the Spanish Ministry of Education (FPU15/01733).With funding from the Spanish government through the ‘Severo Ochoa Centre of Excellence’ accreditation (CEX2019-000902-S)Peer reviewe

Pregnancy in goats induces a strong transcriptomic change in the olfactory bulb

Resumen del póster presentado a la 38th International Conference on Animal Genetics (ISAG), celebrada virtualmente del 26 al 30 de julio de 2021.The brain is an organ involved in essential processes such as the maintenance of body homeostasis, memory, learning, and behavior. Pregnancy induces physiological changes to allow the development of the embryo as well as the preparation of the female for motherhood, and the majority of these processes are tightly regulated in a brain-dependent manner. For instance, the establishment of offspring bonding and nurturing after parturition are regulated by behavioral changes at the central nervous system, which experiences substantial anatomical and transcriptomic changes. Studies performed in humans and mice have demonstrated that the brain of pregnant females experiences substantial anatomical and transcriptomic changes. In this work, we aimed to understand the transcriptomic changes induced by pregnancy in goats by bulk sequencing of total RNA from 12 brain regions in 3 pregnant (second month of gestation) and 4 nonpregnant Murciano-Granadina females. Subsequently, we extracted total mRNA from each tissue and performed sequencing. Quality control and removal of the adapters were carried out with FastQC and TrimGalore. Reads were aligned to the goat reference genome ARS1 with HISAT2 software, and mRNA expression profiles were estimated with StringTie tool. Differential expression analyses were performed with DESeq2. We observed that pregnancy does not significantly affect the transcriptomic profiles of the medulla oblongata, cerebellar trunk, cerebellar hemisphere, rostral collicle, hypothalamus, and neurohypophysis. In contrast, the olfactory bulb, adenohypophysis, pons, frontal neocortex, hippocampus, and pineal gland displayed significant changes in mRNA expression, with a total of 1,234, 203, 197, 85, 71, and 66 differentially expressed genes (DEGs), respectively. Among the 12 brain regions under analysis, the olfactory bulb transcriptome was the most heavily affected by pregnancy. These findings agree well with studies performed in mice during the 70s that demonstrated that bulbectomized mice during pregnancy neglected their litters and were unable to build well-constructed nests.Peer reviewe

A protein-coding gene expression atlas from the brain of pregnant and non-pregnant goats

Background: The brain is an extraordinarily complex organ with multiple anatomical structures involved in highly specialized functions related with behavior and physiological homeostasis. Our goal was to build an atlas of protein-coding gene expression in the goat brain by sequencing the transcriptomes of 12 brain regions in seven female Murciano-Granadina goats, from which three of them were 1-month pregnant.Results: Between 14,889 (cerebellar hemisphere) and 15,592 (pineal gland) protein-coding genes were expressed in goat brain regions, and most of them displayed ubiquitous or broad patterns of expression across tissues. Principal component analysis and hierarchical clustering based on the patterns of mRNA expression revealed that samples from certain brain regions tend to group according to their position in the anterior-posterior axis of the neural tube, i.e., hindbrain (pons and medulla oblongata), midbrain (rostral colliculus) and forebrain (frontal neocortex, olfactory bulb, hypothalamus, and hippocampus). Exceptions to this observation were cerebellum and glandular tissues (pineal gland and hypophysis), which showed highly divergent mRNA expression profiles. Differential expression analysis between pregnant and non-pregnant goats revealed moderate changes of mRNA expression in the frontal neocortex, hippocampus, adenohypophysis and pons, and very dramatic changes in the olfactory bulb. Many genes showing differential expression in this organ are related to olfactory function and behavior in humans.Conclusion: With the exception of cerebellum and glandular tissues, there is a relationship between the cellular origin of sampled regions along the anterior-posterior axis of the neural tube and their mRNA expression patterns in the goat adult brain. Gestation induces substantial changes in the mRNA expression of the olfactory bulb, a finding consistent with the key role of this anatomical structure on the development of maternal behavior

Further approaches on sperm cryopreservation protocol towards the establishment of the sperm bank from endangered native Catalan ram breeds (Xisqueta and Aranesa)

En esta tesis doctoral, el objetivo principal fue proporcionar más información sobre los procesos de crioconservación de espermatozoides de Aranesa y Xisqueta así como explorara estrategias para loa mejora de su calidad tras la descongelación previo a su aplicación. Para ello, se evaluó el efecto estacional y la implantación de melatonina en sus características reproductivas. Además, la calidad del semen conservado a 50C durante 24h en un medio de congelación obtenido de diferentes machos fuera y dentro de la época reproductiva fue analizado. El objetivo fue proporcionar información útil sobre el efecto de la refrigeración en la calidad de los espermatozoides mantenidos durante cierto tiempo antes de su crioconservación o como alternativa al semen congelado para su uso en IA. Este estudio demostró que los implantes de melatonina en los machos fuera de la época reproductiva mejoraron casi todos los parámetros espermáticos estudiados durante su conservación mediante refrigeración. Asimismo, en esta tesis, la eficacia de 2 métodos de recogida de semen, electroeyaculación (EE) vs. Vagina Artificial (AV)) sobre la calidad del semen fresco y descongelado de Aranesa ha sido analizada, con el objetivo de conocer la posibilidad de crear de forma rápida un banco de semen, especialmente a partir de un elevado número de machos no entrenados, aportando información esencial acerca de estos métodos de recogida de semen sobre la calidad de los espermatozoides pre- y post-descongelación. Nuestros resultados demuestran la inclusión del método de EE como alternativa viable y más rápida para la recogida de semen dentro del desarrollo del programa de conservación y establecimiento de criobanco de semen de Aranesa. Otro estudio de la presente tesis evaluó la calidad seminal de los espermatozoides ovinos criopreservados con o sin plasma seminal bajo condiciones controladas y sujetos a un test de evaluación termal durante 4h tras la descongelación, siendo el objetivo de este test resistencia el proporcionar un mayor conocimiento sobre su capacidad de supervivencia en el tracto genital femenino y de fecundar al óvulo. Este estudio demostró que la presencia de plasma seminal plasma previa a la congelación fue beneficiosa para el mantenimiento de la motilidad espermática tras la descongelación y muy útil para la creación del banco de semen. Por último, se evaluó también el efecto del lavado por centrifugación de los espermatozoides descongelados y la subsiguiente suplementación con plasma seminal (20%) recogido por EE fuera y dentro de la época reproductiva y por VA durante la estación reproductiva, seguido de un periodo de incubación de 90 min. El objetivo era conocer si la suplementación de las dosis seminales con plasma seminal de distinto origen tras un test de Resistencia térmica a 37oC podría mejorar la calidad y supervivencia de los espermatozoides descongelados durante su paso a lo largo del tracto genital femenino. Este estudio demostró que la adición de plasma seminal, independientemente de su origen, mantiene las funciones espermáticas y características de motilidad durante el periodo de incubación tras la descongelación. De la misma manera, se observó que el lavado por centrifugación o la eliminación del diluyente tras la descongelación no es necesario. Podemos concluir que la aplicación de implantes de melatonina a los sementales durante la época no reproductiva proporcionó un efecto beneficioso en los espermatozoides de morueco durante la refrigeración, la inclusión de la electoeyaculación como método de recogida de semen de la raza Aranesa para el establecimiento de un banco de semen es recomendable, y finalmente, la presencia de plasma seminal previo a la criopreservación o su adición tras la descongelación de los espermatozoides es importante para el mantenimiento de la motilidad y demás funciones espermáticas.The new interest towards the characterization and conservation of Aranesa and Xisqueta ram breeds was constituted by ex situ programs using techniques such as semen cryopreservation following its ultimate use for artificial insemination. However, there are still concerns due to issues regarding frozen-thawed sperm quality. Therefore, with the present technological advances made on sperm evaluating techniques, a wealth of information on their sperm characteristics may be achieved, improving the application of refrigerated and frozen-thawed semen technology. In this doctoral thesis, the general aim was to provide some more information on Aranesa and Xisqueta sperm processes for cryopreservation as well as exploring some strategies towards improving their post-thawed sperm quality prior to testing for further application. To this regard, we evaluated the seasonal effect and melatonin implantation on their reproductive characteristics. In addition, the quality of sperm stored at 50C for 24h in a cryopreservation media from the various ram donors during a non-breeding and breeding season was determined. The goal was to provide some useful information on the effect of chilled liquid storage on sperm quality held for a period of time prior to cryopreservation or as an alternative to frozen-thawed semen for AI. This study demonstrated that melatonin implantation to rams during the non-breeding season improved almost all sperm parameters studied during chilled liquid semen storage. Furthermore, in this thesis, the efficacy of two collection methods electroejaculation (EE) vs. artificial vagina (AV)) on fresh and post-thawed sperm quality of Aranesa ram sperm. The objective being that for rapid constitution of the sperm bank especially from a large number of untrained males within a short period of time, information on semen recovery methods on pre- and post-thawed sperm quality is essential. Our finding supports the inclusion of EE method as a viable alternative and quicker method for semen collection towards the ongoing conservation program and establishment of Aranesa sperm cryobank. Another study in this thesis evaluated the sperm motility and qualitative characteristics of ram spermatozoa cryopreserved with or without seminal plasma under a controlled condition and subjected to a 4 h post-thawing thermal evaluation test. The goal being that exposing these frozen-thawed sperm to thermal resistance test will provide some knowledge on their survivability in the female genital tract towards fertilizing the ovum. This study demonstrated that the presence of seminal plasma prior to cryopreservation was beneficial in maintaining post thawed sperm motility, and as such, may be useful for ex situ ram sperm cryopreservation towards its use for artificial insemination. The last study in this thesis evaluated the effect of washing frozen-thawed sperm by centrifugation and subsequently supplementing with whole seminal plasma (20%) collected by EE from a non-breeding and breeding season or by AV from a breeding season, following a 90 min incubation period. The aim being that supplementing these sperm samples with different seminal plasma source following a thermal resistance test at 37oC will provide some insight as regards their quality and survivability in the female genital tract. This study demonstrates that supplementing frozen-thawed sperm with seminal plasma irrespective of its source maintained sperm functions and motility characteristics during a post-thawing incubation period. Furthermore, washing by centrifugation or removal of freezing component after thawing was not necessary. We can therefore conclude that melatonin implants on male during a non-breeding season provided a beneficial effect on ram sperm during chilled liquid storage, the inclusion of EE as method for semen collection towards the establishment of a sperm bank is recommendable, and finally, the presence of seminal plasma prior to cryopreservation or its addition to post-thawed sperm was important in maintaining sperm motility and functions

Age of first breeding and incidence of dystocia and losses at parturition and post-partum in indigenous Nigerian pig

Studies were carried out on the prevalence of dystocia and losses at parturition and post-partum following early mating and first breeding in 15 Nigerian indigenous pigs six were 8 months old at the time of there first farrowing, while nine were 11 or 12 months at the time of their first farrowing. Forty-six piglets were born, of which 11 or 12 months at the time of there first farrowing. Forty-six piglets were born, of which 11 died at birth (24%) and a further 18 during the next 7 days (total loss 63.0%). The six pigs that farrowed at 8 months of age had smaller mean litters and births weights, a higher incidence of dystocia and higher piglet mortality at birth than those that farrowed later (32 with 91 % survival). However, increased age at first farrowing did not reduce the high death rate during the first week (50% of Piglets which survived at birth in both groups). This was attributed to starvation due to poor mothering ability following first farrowing since there was no agalactia or mastitis

Advances in post-thawing protocol of cryopreserved endangered Catalonian breed (Cabra Blanca de Rasquera) sperm doses towards improving their post-thawed fertility potential

La Cabra Blanca de Rasquera és una raça autòctona catalana en perill d’extinció de la zona sud de Catalunya. Per a mantenir la seva existència, l’Organització de les Nacions Unides per a l’Alimentació i la Agricultura (FAO) recomana per a la conservació de les races catalogades en risc d’extinció establir programes de conservació tant in situ com ex situ (FAO, 2010). Els programes de conservació ex situ com és la crioconservació espermàtica i la creació de bancs de germoplasma permeten l’emmagatzematge del semen indefinidament a través de varis processos com la recollida de semen i la seva congelació per a la seva posterior utilització en les diferents Tecnologies de Reproducció Assistida (ART), les quals són de gran importància en la conservació de la diversitat genètica en aquestes races. No obstant, millorar la qualitat dels espermatozoides descongelats en aquesta espècie és encara una gran preocupació. Diferents estratègies tecnològiques han estat proposades per assolir una millor qualitat seminal després de la descongelació, utilitzant varies tècniques com l’anàlisi informatitzat de la motilitat espermàtica (Computer Assisted Sperm Analysis, CASA), assajos sobre l’estructura de la cromatina espermàtica (Sperm Chromatin Structural Assay, SCSA), així com altres anàlisis realitzats a través de la utilització del citòmetre de flux per a valorar les distintes característiques espermàtiques. Per tant, la principal meta d’aquesta tesi doctoral ha estat establir nous enfocs en els protocols post-descongelació de les dosis espermàtiques crioconservades del banc de la raça autòctona Cabra Blanca de Rasquera en perill d’extinció amb l’objectiu de millorar la seva viabilitat i fertilitat després de la descongelació. En la present tesi, s’ha avaluat l’efecte de la tècnica de centrifugació en capa única (Single Layer Centrifugation, SLC) usant la solució de col·loide comercial Bovipure®, sobre la qualitat espermàtica després la descongelació en relació a varis factors com la edat del donant, l’estació de la recollida del semen i l’administració d’implants de melatonina en els mascles en la època no reproductiva. L’objectiu va ser determinar si la centrifugació a través del col·loide Bovipure® pot seleccionar espermatozoides viables amb bones habilitats cinètiques, ADN intacte, mitocòndries actives i integritat de membranes plasmàtica i acrosomal, dels espermatozoides de mala qualitat, morts o moribunds després de la descongelació amb la finalitat de mimetitzar el mateix procés observat en la selecció natural que passa en el tracte reproductor femení. Per això, en aquest estudi, es recolliren 2 ejaculats/mascle/dia (n = 6 dies) via vagina artificial de 6-8 mascles durant 2 anys consecutius en el període reproductiu i no reproductiu a l’edat de 12 i 24 mesos a la tardor i de 18 y 30 mesos d’edat en primavera. Prèvia a la recollida de semen en el període no reproductiu, els mascles van ser repartits al atzar en 2 grups (4 mascles/grup): a un grup se’ls administrà implants subcutanis de melatonina mentre que a l’altre grup romandrà sense tractar. Després des descongelar, els resultats de viabilitat espermàtica total i el percentatge d’espermatozoides amb acrosoma intacte i mitocòndries actives mostraren valors significativament superiors en les mostres recollides a la tardor comparat amb les mostres de primavera. No obstant, aquestes diferències no es van reflectir després de realitzar la tècnica SLC. Respecte a la integritat de l’ADN, no es varen observar diferències significatives post-descongelació, encara que la proporció d’espermatozoides amb HDS (Alta estabilitat de l’ADN) fou superior en les mostres seminals recollides durant la tardor. Referent als paràmetres cinètics, la motilitat progressiva fou significativament superior també durant la tardor comparat amb les mostres recollides en primavera una vegada descongelades. No obstant, aquestes diferències desaparegueren després de portar a terme la centrifugació (SLC) de les distintes mostres. Finalment, no s’observaren grans diferències significatives entre les mostres seminals no seleccionades i les que foren sotmeses a la tècnica SLC respecte a la motilitat total i progressiva, viabilitat, activitat mitocondrial y la integritat acrosomal i de l’ADN, el que demostra que la centrifugació simple a través del col·loide Bovipure® dels espermatozoides descongelats no millora la seva qualitat, independientement de l’edat del mascle, l’estació durant la que se realitzà la recollida del semen o l’administració de implants de melatonina als mascles. A més, aquest treball ha avaluat l’efecte d’incubar les distintes mostres seminals descongelades sota condicions capacitants durant 3 hores per a intentar simular la supervivència dels espermatozoides descongelats durant la migració activa en el tracte reproductor femení, en relació a la edat del donant, estació de l’any de la recollida del semen o l’aplicació d’implants de melatonina en l’època no reproductiva. Per altra banda, el paper del plasma seminal ha estat extensament estudiat per diferents grups, el qual proporciona una font de nutrients per als espermatozoides, millora la motilitat espermàtica i prevé l’activació prematura de l’espermatozoide durant la seva migració pel tracte femení. Pel que l’adició de plasma seminal als espermatozoides descongelats podria ser implementada com una alternativa per a millorar la qualitat seminal. Així, en la present tesi, també s’ha avaluat l’adició d’un 20% de plasma seminal en el medi durant la incubació de 3h sota condicions capacitants amb la finalitat de millorar la qualitat espermàtica post-descongelació. No obstant, els resultats obtinguts mostraren una significativa reducció de la motilitat i viabilitat espermàtica i l’activitat mitocondrial, així com també de la integritat de l’acrosoma després 3 h d’incubació sota condiciones in vitro de capacitació, independentment de la presencia de plasma seminal en el medi, mentre que la integritat de l’ADN no es va veure afectada. Aquests resultats semblen indicar que l’adició de plasma seminal no és útil com estratègia per a millorar la qualitat dels espermatozoides descongelats de boc, independentment dels factors estudiats anteriorment citats. Així mateix, l’efecte del factor individual del donant sobre la qualitat seminal post-descongelació i sobre l’eficàcia de la tècnica de selecció SLC fou avaluat, ja que la habilitat de l’espermatozoide a sobreviure en el tracte genital femení pot variar en funció del mascle. Amb aquest objectiu, es recolliren a principis de l’hivern 2 ejaculats/mascle/dia (n = 6 dies) via vagina artificial de 6 mascles de la raça Cabra Blanca de Rasquera de aproximadament 2 anys d’edat. Després de realitzar els diferents anàlisis, poques diferències significatives foren observades després de la descongelació de les dosis individuals en la viabilitat espermàtica, activitat mitocondrial i integritat acrosomal entre els diferents mascles, mentre que, respecte a la integritat de l’ADN, motilitat total i progressiva, cap diferencia fou detectada entre donants. A més, després de realitzar la tècnica de la SLC, poques diferències individuals relacionades amb l’efectivitat d’aquest mètode foren observades, únicament 2 mascles dels 6 testats mostraren una reducció en el dany acrosomal de les dosis, mentre que en la resta de paràmetres seminals analitzats no se observaren diferències significatives entre individus després SLC. Finalment, les possibles variacions entre mascles poden també produir diferències en la congelabilitat del semen amb respecte a la seva supervivència en el tracte reproductiu femení. Alguns ejaculats poden contenir subpoblacions d’espermatozoides que difereixin en la seva capacitat fecundant i amb característiques peculiars a cada mascle (Gomes et al., 2020). Per aquest motiu, el darrer estudi de la present tesi se centrà en l’avaluació del factor individual-mascle sobre la qualitat espermàtica post-descongelació després de 3 hores d’incubació sota condicions in vitro de capacitació amb l’objectiu de determinar si la variabilitat individual pot veure’s reflectida en la seva resposta a aquestes condicions en presencia o no de plasma seminal, intentant simular la supervivència en condicions in vivo. Els resultats indicaren molt poques diferències individuals en la motilitat, viabilitat, integritat acrosomal i funció mitocondrial darrera la incubació i que la presencia de plasma seminal va reduir significativament aquests paràmetres en tots els mascles, mentre que respecte a la integritat de l’ADN, diferències individuals foren menys evidents després de 3 hores d’incubació en els diferents medis, sent inexistents en presencia de plasma seminal. Així, a partir dels resultats obtinguts en la present tesi, podem concloure que les dosis seminals descongelades de la raça Blanca de Rasquera a partir d’ejaculats obtinguts a la tardor presenten millors qualitats que les obtingudes en primavera o hivern. A pesar d’això, altres factors com l’edat del donant o l’aplicació d’implants de melatonina durant l’estació no reproductiva no milloraren la qualitat seminal post-descongelació, així com tampoc el fet de sotmetre les mostres descongelades a un suposat procés de selecció espermàtica mitjançant la tècnica de SLC a través del col·loide Bovipure®. Aquesta absència de millora de la qualitat dels espermatozoides descongelats suggereix que aquesta tècnica de selecció espermàtica no és útil per a la seva aplicació en tecnologies de reproducció assistida en aquesta raça. Per últim, l’adició de plasma seminal en el medi durant la incubació de las dosis descongelades en condicions in vitro de capacitació tampoc millorà la qualitat espermàtica, pel que no sembla ser una alternativa efectiva para ser usada amb l’objectiu d’incrementar la viabilitat i fertilitat de les dosis crioconservades del banc de semen de la raça Cabra Blanca de Rasquera en programes d’inseminació artificial o en altres tecnologies de reproducció assistida.La Cabra Blanca de Rasquera es una raza autóctona catalana en peligro de extinción de la zona sur de Cataluña. Para mantener su existencia, la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) recomienda para la conservación de las razas catalogadas en riesgo de extinción establecer programas de conservación tanto in situ como and ex situ (FAO, 2010). Los programas de conservación ex situ como es la crioconservación espermática y la creación de bancos de germoplasma permiten el almacenamiento del semen indefinidamente a través de varios procesos como la recogida de semen y su congelación para su posterior utilización en las diferentes Tecnologías de Reproducción Asistida (ART), las cuales son de gran importancia en la conservación de la diversidad genética en estas razas. Sin embargo, mejorar la calidad de los espermatozoides descongelados en esta especie es todavía una gran preocupación. Diferentes estrategias tecnológicas han sido propuestos para lograr una mejor calidad seminal tras la descongelación, usando varias técnicas como el análisis informatizado de la motilidad espermática (Computer Assisted Sperm Analysis, CASA), ensayos sobre la estructura de la cromatina espermática (Sperm Chromatin Structural Assay, SCSA), así como otros análisis realizados a través de la utilización del citómetro de flujo para valorar las distintas características espermáticas. Por lo tanto, la principal meta de esta tesis doctoral ha sido establecer nuevos enfoques en los protocolos tras descongelación de las dosis espermáticas crioconservadas del banco de la raza autóctona Cabra Blanca de Rasquera en peligro de extinción con el objetivo de mejorar su viabilidad y fertilidad tras la descongelación. En la presente tesis, se ha evaluado el efecto de la técnica de centrifugación en capa única (Single Layer Centrifugation, SLC) usando la solución de coloide comercial Bovipure®, sobre la calidad espermática tras la descongelación en relación a varios factores como la edad del donante, la estación de la recogida del semen y la administración de implantes de melatonina en los machos en la época no reproductiva. El objetivo fue determinar si la centrifugación a través del coloide Bovipure® puede seleccionar espermatozoides viables con buenas habilidades cinéticas, ADN intacto, mitocondrias activas e integridad de membranas plasmática y acrosomal, de los espermatozoides de mala calidad, muertos o moribundos tras la descongelación con la finalidad de mimetizar el mismo proceso observado en la selección natural que ocurre en el tracto reproductor femenino. Para ello, en este estudio, se recogieron 2 eyaculados/macho/día (n = 6 días) vía vagina artificial de 6-8 machos durante 2 años consecutivos en el periodo reproductivo y no reproductivo a la edad de 12 y 24 meses en otoño y de 18 y 30 meses de edad en primavera. Previa a la recogida de semen en el periodo no reproductivo, los machos fueron repartidos al azar en 2 grupos (4 machos/grupo): a un grupo se les administró implantes subcutáneos de melatonina mientras que el otro grupo permaneció sin tratar. Tras descongelar, los resultados de viabilidad espermática total y el porcentaje de espermatozoides con acrosoma intacto y mitocondrias activas mostraron valores significativamente superiores en las muestras recogidas en otoño comparado con las muestras de primavera. Sin embargo, estas diferencias no se reflejaron tras realizar la técnica SLC. Respecto a la integridad del ADN, no se observaron diferencias significativas tras la descongelación, aunque la proporción de espermatozoides con HDS (Alta estabilidad del ADN) fue superior en las muestras seminales recogidas durante otoño. Referente a los parámetros cinéticos, la motilidad progresiva fue significativamente superior también durante otoño comparado con las muestras recogidas en primavera una vez descongeladas. No obstante, estas diferencias desaparecieron tras llevar a cabo la centrifugación (SLC) de las distintas muestras. Finalmente, no se observaron grandes diferencias significativas entre las muestras seminales no seleccionadas y las que fueron sometidas a la técnica SLC respecto a la motilidad total y progresiva, viabilidad, actividad mitocondrial el integridad acrosomal y de ADN, lo que demuestra que la centrifugación simple a través del coloide Bovipure® de los espermatozoides descongelados no mejoró su calidad, independientemente de la edad del macho, la estación durante la que se realizó la recogida del semen o la administración de implantes de melatonina a los machos. Además, este trabajo ha evaluado el efecto de incubar las distintas muestras seminales descongeladas bajo condiciones capacitantes durante 3 horas para intentar simular la supervivencia de los espermatozoides descongelados durante la migración activa en el tracto reproductor femenino, en relación a la edad del donante, estación del año de la recogida del semen o la aplicación de implantes de melatonina en la época no reproductiva. Por otra parte, el papel del plasma seminal ha sido extensamente estudiado por diferentes grupos, el cual proporciona una fuente de nutrientes para los espermatozoides, mejora la motilidad espermática y previene la activación prematura del espermatozoide durante su migración por el tracto femenino (Desnoyers & Manjunath, 1992; Rozeboom et al., 2000a). Por lo que la adición de plasma seminal a los espermatozoides descongelados podría ser implementada como una alternativa para mejorar la calidad seminal (Maxwell et al., 2007). Así, en la presente tesis, también se ha evaluado la adición de un 20% de plasma seminal en el medio durante la incubación de 3h bajo condiciones capacitantes con la finalidad de mejorar la calidad espermática tras la descongelación. Sin embargo, los resultados obtenidos mostraron una significativa reducción de la motilidad y viabilidad espermática y la actividad mitocondrial, así como también de la integridad del acrosoma tras 3 h de incubación bajo condiciones in vitro de capacitación, independientemente de la presencia de plasma seminal en el medio, mientras que la integridad del ADN no se vio afectada. Estos resultados parecen indicar que la adición de plasma seminal no es útil como estrategia para mejorar la calidad de los espermatozoides descongelados de macho cabrío, independientemente de los factores estudiados anteriormente citados. Asimismo, el efecto del factor individual del donante sobre la calidad seminal post-descongelación y sobre la eficacia de la técnica de selección SLC fue evaluado, ya que la habilidad del espermatozoide a sobrevivir en el tracto genital femenino puede variar en función del macho. Con este objetivo, se recogieron a principios de invierno 2 eyaculados/macho/día (n = 6 días) vía vagina artificial de 6 machos de la raza Cabra Blanca de Rasquera de aproximadamente 2 años de edad. Tras llevar a cabo los diferentes análisis, pocas diferencias significativas fueron observadas tras la descongelación de las dosis individuales en la viabilidad espermática, actividad mitocondrial e integridad acrosomal entre los distintos machos, mientras que, respecto a la integridad del ADN, motilidad total y progresiva, ninguna diferencia fue detectada entre donantes. Además, tras realizar la técnica de la SLC, pocas diferencias individuales relacionadas con la efectividad de este método fueron observadas, únicamente 2 machos de los 6 testados mostraron una reducción en el daño acrosomal de las dosis, mientras que en el resto de parámetros seminales analizados no se observaron diferencias significativas entre individuos tras SLC. Finalmente, las posibles variaciones entre machos pueden también producir diferencias en la congelabilidad del semen con respecto a su supervivencia en el tracto reproductivo femenino (Shannon, 1978). Algunos eyaculados pueden contener subpoblaciones de espermatozoides que difieran en su capacidad fecundante y cuyas características son peculiares a cada macho (Gomes et al., 2020). Por este motivo, el último estudio de la presente tesis se centró en la evaluación del factor individual-macho sobre la calidad espermática post-descongelación tras 3 horas de incubación bajo condiciones in vitro de capacitación con el objetivo de determinar si la variabilidad individual puede verse reflejada en su respuesta a estas condiciones en presencia o no de plasma seminal, intentando simular la supervivencia en condiciones in vivo. Los resultados indicaron escasas diferencias individuales en la motilidad, viabilidad, integridad acrosomal y función mitocondrial tras la incubación y que la presencia de plasma seminal redujo significativamente estos parámetros en todos los machos, mientras que respecto a la integridad del ADN, diferencias individuales fueron menos evidentes tras 3 horas de incubación en los diferentes medios, siendo inexistentes en presencia de plasma seminal. Así, a partir de los resultados obtenidos en la presente tesis, podemos concluir que las dosis seminales descongeladas de la raza Blanca de Rasquera a partir de eyaculados obtenidos en otoño presentan mejores cualidades que las obtenidas en primavera o invierno. A pesar de ello, otros factores como la edad del donante o la aplicación de implantes de melatonina durante la estación no reproductiva no mejoraron la calidad seminal post-descongelación, así como tampoco el hecho de someter las muestras descongeladas a un supuesto proceso de selección espermática mediante la técnica de SLC a través del coloide Bovipure®. Esta ausencia de mejora de la calidad de los espermatozoides descongelados sugiere que esta técnica de selección espermática no es útil para su aplicación en tecnologías de reproducción asistida en esta raza. Por último, la adición de plasma seminal en el medio durante la incubación de las dosis descongeladas en condiciones in vitro de capacitación tampoco mejoró la calidad espermática, por lo que no parece ser una alternativa efectiva para ser usada con el objetivo de incrementar la viabilidad y fertilidad de las dosis crioconservadas del banco de semen de la raza Cabra Blanca de Rasquera en programas de inseminación artificial o en otras tecnologías de reproducción asistida.The Cabra Blanca de Rasquera is a native Catalonian breed of goats from the southern region of Catalonia enlisted as an endangered breed at the verge of extinction. To maintain the existence of this breed, the Food and Agricultural Organization of the United Nation (FAO) endorsed the preservation of breeds in danger of extinction by establishing in situ and ex situ conservation programmes (FAO, 2010). Ex situ programmes such as semen cryopreservation and the development of a genetic sperm bank enables the storage of semen indefinitely through various processes such as semen collection, processing, and freezing. Furthermore, the utilization of this process towards Assisted Reproductive Technologies (ART) is of major importance in preserving the genetic diversity of this breed. However, improving the post thaw sperm quality of this species is still a major concern. Several technological strategies have been proposed in order to achieve a better post thaw sperm quality, using various techniques such as the computer assisted sperm analysis (CASA), Sperm Chromatin Structural Assay (SCSA) and other different analyses through flow cytometer to assess sperm quality. Therefore, the major goal of this doctoral thesis was to establish new approaches in the protocols after thawing of cryopreserved sperm bank doses of this local breed, Cabra Blanca de Rasquera in danger of extinction with the aim of improving their post thaw viability and fertility. In this thesis, we evaluated the effect of Single Layer Centrifugation (SLC) technique using Bovipure® colloid on the quality of sperm after thawing in r