Dysrégulations de la production et de la clairance des lipoprotéines riches en triglycérides

Hypertriglyceridemia (HTG) correspond to an increase of triglyceride-rich lipoproteins (TGRL) circulating concentration, as a consequence of an increase in the synthesis of or a decrease in their catabolism, most classically described. In nearly 50% of patients with severe hypertriglyceridemia (HTG), no genetic cause is identified, either in familial chylomicronemia syndrome (FCS) or in multifactorial chylomicronemia syndrome (MCS). To gain new insights and to improve patient’s characterization, it remains important to conduct accurate phenotype-genotype association studies through close collaboration with referent lipidologists, and to develop high-performance tools for molecular diagnosis. Firstly, the assessment of pre-heparin LPL concentration as well as LPL activity 60 minutes after heparin injection, enabled the identification of two subgroups within 62 genotyped MCS patients Secondly, the development of a new sequencing generation workflow exploring simultaneously the 9 most prevalent genes in dyslipidemia, allowed the detection of single nucleotide variations with sensitivity equivalent to Sanger sequencing, but also allowed the detection of copy number variations. Collective consideration of the results underlines the complexity of the regulation mechanisms of TGRL metabolism and the interest of gene-gene interactions study. Thus, the studies presented herein bring new hypothesis to explore for understanding the pathophysiological mechanisms of severe HTG and to improve molecular diagnosis tools available for phenotype-genotype association studiesL’hypertriglycéridémie (HTG) correspond à une accumulation des lipoprotéines riches en triglycérides (LRTG) dans la circulation plasmatique, conséquence d’une augmentation de leur synthèse ou plus classiquement décrit, d’une diminution de leur catabolisme. Dans près de 50% des cas, aucune cause génétique n’est identifiée chez les patients présentant une présentant une HTG sévère, aussi bien dans le cadre du syndrome de chylomicronémie familiale (FCS) que dans celui du syndrome de chylomicronémie multifactorielle (MCS). Pour améliorer nos connaissances et la caractérisation de ces patients, la conduction de corrélations phénotypes-génotypes précises grâce à une collaboration clinico-biologique étroite, ainsi que le développement d’outils de diagnostic moléculaire performants, demeurent un enjeu majeur. Premièrement, l’évaluation de la concentration pré-héparinique en LPL et l’activité post-héparinique 60 minutes après l’injection d’héparine chez 62 patients MCS caractérises génétiquement a permis la mise en évidence deux sous-groupes chez ces patients. Deuxièmement, le développement d’une stratégie séquençage de nouvelle génération permettant d’explorer simultanément les 9 gènes les plus prévalents dans les hypercholestérolémies, les hypocholestérolémies et les hypertriglycéridémies, a permis de détecter les variants nucléotidiques avec une sensibilité équivalente au séquençage Sanger mais aussi de détecter des grands réarrangements. L’ensemble des résultats souligne la complexité des mécanismes de régulation du métabolisme des LRTG et l’intérêt de l’étude des interactions gène-gène. Ainsi, ces travaux ont permis de mettre en évidence de nouvelles hypothèses à explorer pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques des HTG sévères et d’améliorer les outils disponibles pour les études de corrélation génotype-phénotyp

Dysregulations of production and clearance of triglyceride-rich lipoproteins

L’hypertriglycéridémie (HTG) correspond à une accumulation des lipoprotéines riches en triglycérides (LRTG) dans la circulation plasmatique, conséquence d’une augmentation de leur synthèse ou plus classiquement décrit, d’une diminution de leur catabolisme. Dans près de 50% des cas, aucune cause génétique n’est identifiée chez les patients présentant une présentant une HTG sévère, aussi bien dans le cadre du syndrome de chylomicronémie familiale (FCS) que dans celui du syndrome de chylomicronémie multifactorielle (MCS). Pour améliorer nos connaissances et la caractérisation de ces patients, la conduction de corrélations phénotypes-génotypes précises grâce à une collaboration clinico-biologique étroite, ainsi que le développement d’outils de diagnostic moléculaire performants, demeurent un enjeu majeur. Premièrement, l’évaluation de la concentration pré-héparinique en LPL et l’activité post-héparinique 60 minutes après l’injection d’héparine chez 62 patients MCS caractérises génétiquement a permis la mise en évidence deux sous-groupes chez ces patients. Deuxièmement, le développement d’une stratégie séquençage de nouvelle génération permettant d’explorer simultanément les 9 gènes les plus prévalents dans les hypercholestérolémies, les hypocholestérolémies et les hypertriglycéridémies, a permis de détecter les variants nucléotidiques avec une sensibilité équivalente au séquençage Sanger mais aussi de détecter des grands réarrangements. L’ensemble des résultats souligne la complexité des mécanismes de régulation du métabolisme des LRTG et l’intérêt de l’étude des interactions gène-gène. Ainsi, ces travaux ont permis de mettre en évidence de nouvelles hypothèses à explorer pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques des HTG sévères et d’améliorer les outils disponibles pour les études de corrélation génotype-phénotypeHypertriglyceridemia (HTG) correspond to an increase of triglyceride-rich lipoproteins (TGRL) circulating concentration, as a consequence of an increase in the synthesis of or a decrease in their catabolism, most classically described. In nearly 50% of patients with severe hypertriglyceridemia (HTG), no genetic cause is identified, either in familial chylomicronemia syndrome (FCS) or in multifactorial chylomicronemia syndrome (MCS). To gain new insights and to improve patient’s characterization, it remains important to conduct accurate phenotype-genotype association studies through close collaboration with referent lipidologists, and to develop high-performance tools for molecular diagnosis. Firstly, the assessment of pre-heparin LPL concentration as well as LPL activity 60 minutes after heparin injection, enabled the identification of two subgroups within 62 genotyped MCS patients Secondly, the development of a new sequencing generation workflow exploring simultaneously the 9 most prevalent genes in dyslipidemia, allowed the detection of single nucleotide variations with sensitivity equivalent to Sanger sequencing, but also allowed the detection of copy number variations. Collective consideration of the results underlines the complexity of the regulation mechanisms of TGRL metabolism and the interest of gene-gene interactions study. Thus, the studies presented herein bring new hypothesis to explore for understanding the pathophysiological mechanisms of severe HTG and to improve molecular diagnosis tools available for phenotype-genotype association studie

Activité lipoprotéine lipase post-héparinique (intérêt de la mesure de l'activité à différents temps de prélèvement)

L'hypertriglycéridémie est un état clinique fréquent, définit classiquement par une élévation de la concentration en triglycérides à jeûne (TG) au-delà de 3,37 mmol/L (95ème percentile). Malgré les progrès réalisés dans l'étude des hypertriglycéridémies, notamment par l'identification de gènes impliqués dans le métabolisme des lipoprotéines, notre compréhension de ces pathologies reste imparfaite et une étude phénotypique, comme la détermination de l'activité LPL post-héparinique, reste nécessaire. L'étude présentée ici a été menée afin de mieux comprendre la lipolyse in-vivo, l'implication de la LPL dans cette lipolyse ainsi que leurs modifications chez les patients hypertriglycéridémiques. 17 patients présentant une hypertriglycéridémie majeure et ayant bénéficié d'une injection d'héparine à la dose de 50 UI/kg, ont été séparés en deux groupes selon le profil électrophorétique de leurs lipoprotéines aux différents temps de prélèvement. Nous avons déterminé l'activité de la LPL aux différents temps de prélèvement et recensés des données biologiques, génétiques et cliniques afin de caractériser nos deux groupes. L'étude de la décroissance des triglycérides montre une meilleure décroissance chez les patients du groupe, et ce jusqu'au temps T60. L'étude de l'activité LPL posthéparinique à tous les temps de prélèvement a montré une décroissance plus rapide chez les patients du groupe 2. L'arrêt du remaniement des lipoprotéines visualisable sur le lipidogramme (système d'évaluation de la lipolyse in vivo) correspond à une modification de l'activité LPL, détectable par notre système de détermination in vitro. L'étude des polymorphismes et mutations n'a pas permis d'identifier un facteur génétique prédisposant à l'appartenance d'un des deux groupes. Enfin, les patients du groupe 2 présentent une tendance non significative à avoir des antécédents plus fréquents de pancréatites aigues. Notre étude a permis de montrer que le retour des lipoprotéines à un profil électrophorétique identique au T0 correspond à une baisse de l'activité de la LPL. L'absence de facteurs de prédisposition génétique connus souligne l'importance de la réalisation d'une étude phénotypique. Cependant, le(s) mécanisme(s) physiopathologique(s) mis en jeu dans chacun des groupes restent non identifiés, rendant nécessaire la poursuite de nos investigationsLYON1-BU Santé (693882101) / SudocSudocFranceF

Coding variants identified in LMF1 gene in a cohort of hyperchylomicronemic patients

International audienc

Strong heterogeneity in plasma triglyceride lipolysis in multifactorial chylomicronemia

International audienc

Alterations in plasma triglycerides lipolysis in patients with history of multifactorial chylomicronemia

International audienceBackground and aims: The heterogeneity and mechanisms of multifactorial chylomicronemia (MCM) remain poorly understood. To gain new insights, post heparin lipolysis measured at 60 min (PHLA60), in addition to the more commonly used 10 min (PHLA10), was assessed in patients with history of MCM. Methods: 62 consecutive MCM patients were studied. The evaluation included LPL, APOC2, APOA5, GPIHBP1, LMF1 and APOE gene sequencing, as well as pre- and post-heparin injection biochemical analysis, including lipid profiles, determination of apolipoprotein B, B-48, CII, CIII, lipoprotein lipase (LPL) concentrations (LPLC0, LPLC10 and LPLC60) and post-heparin LPL activity (PHLA10 and PHLA60). Results: In controls, PHLA60 did not differ from PHLA10, while in MCM patients, PHLA60 was significantly lower than PHLA10 (p< 0.001). PHLA60 showed a bimodal distribution in MCM patients (p = 0.03). One subgroup exhibited PHLA60 similar to controls, with persistent lipoprotein remodeling and, paradoxically, the highest basal plasma TG concentration. APOE epsilon 4 was over-represented compared to the European population (p< 0.05) and Apo CIII/Apo B ratio was increased (p< 0.01). The other subgroup exhibited low PHLA60 (p< 0.001) compared to both controls and the other MCM subgroup with a lipoprotein profile consistent with fast and transient remodeling. LMF1 p. Arg364Gln was over-represented compared to the European population (p< 0.05). Conclusions: The study showed that PHLA60 identifies a subgroup of MCM with a defect in lipolysability and/or hepatic clearance of triglycerides-rich lipoproteins, and a larger one with a defect in LPL availability. These findings provide new insights into the heterogeneity of MCM and might contribute to adjust treatment targeting

Post-heparin LPL activity measurement using VLDL as a substrate: a new robust method for routine assessment of plasma triglyceride lipolysis defects.

Determination of lipoprotein lipase (LPL) activity is important for hyperchylomicronemia diagnosis, but remains both unreliable and cumbersome with current methods. Consequently by using human VLDL as substrate we developed a new LPL assay which does not require sonication, radioactive or fluorescent particles.Post-heparin plasma was added to the VLDL substrate prepared by ultracentrifugation of heat inactivated normolipidemic human serums, diluted in buffer, pH 8.15. Following incubation at 37°c, the NEFA (non esterified fatty acids) produced were assayed hourly for 4 hours. LPL activity was expressed as µmol/l/min after subtraction of hepatic lipase (HL) activity, obtained following LPL inhibition with NaCl 1.5 mmol/l. Molecular analysis of LPL, GPIHBP1, APOA5, APOC2, APOE genes was available for 62 patients.Our method was reproducible (coefficient of variation (CV): intra-assay 5.6%, inter-assay 7.1%), and tightly correlated with the conventional radiolabelled triolein emulsion method (n = 26, r = 0.88). Normal values were established at 34.8 ± 12.8 µmol/l/min (mean ± SD) from 20 control subjects. LPL activities obtained from 71 patients with documented history of major hypertriglyceridemia showed a trimodal distribution. Among the 11 patients with a very low LPL activity (< 10 µmol/l/min), 5 were homozygous or compound heterozygous for LPL or GPIHBP1 deleterious mutations, 3 were compound heterozygous for APOA5 deleterious mutations and the p.S19W APOA5 susceptibility variant, and 2 were free of any mutations in the usual candidate genes. No homozygous gene alteration in LPL, GPIHBP1 and APOC2 genes was found in any of the patients with LPL activity > 10 µmol/l/min.This new reproducible method is a valuable tool for routine diagnosis and reliably identifies LPL activity defects

Multiple microRNA regulation of lipoprotein lipase gene abolished by 3'UTR polymorphisms in a triglyceride-lowering haplotype harboring p.Ser474Ter

International audienceBACKGROUND: Lipoprotein lipase (LPL) is a key enzyme in triglyceride (TG) metabolism. LPL gene single nucleotide polymorphisms (SNPs) are associated with TG concentrations however the functionality of many of these SNPs remains poorly understood. MicroRNAs (miR) exert post-transcriptional down-regulation and their target sequence on the 3'UTR may be altered by SNPs. We therefore investigated whether LPL 3'UTR SNPs could modulate plasma TG concentration through the alteration of miR binding-sites. METHODS AND RESULTS: We performed genetic association studies of LPL 3'UTR SNPs with TG concentrations in 271 type 2 diabetic patients and in general population samples (2997 individuals). A specific LPL haplotype (Hap4) was associated with lower plasma TG concentration (TG-0.18, IC95% [-0.30, -0.07] mmol/L or logTG-0.13, IC95% [-0.18, -0.08], p = 4.77.10(-8)) in the meta-analysis. Hap4 comprises seven 3'UTR SNP minor alleles and p.Ser474Ter (rs328) a well-documented nonsense mutation associated with low TG concentration although by an unknown mechanism so far. Bio-informatic studies identified several putative miRNA binding-sites on the wild-type Hap1 haplotype, lost on Hap4. Functional validation performed in HEK-293T cells using luciferase expression constructs with various LPL 3'UTR allele combinations demonstrated a binding of miR-29, miR-1277 and miR-410 on Hap1, lost on Hap4. This loss of specific miR binding-site in presence of Hap4 was independent of the allelic variation of p.Ser474Ter (rs328). CONCLUSIONS: We report the regulation of LPL by the miR-29, miR-1277 and miR-410 that is lost in presence of Hap4, a specific LPL TG-lowering haplotype. Consequently p.Ser474Ter association with TG concentration could be at least partially explained by its strong linkage disequilibrium with these functional 3'UTR SNPs

New rare genetic variants of LMF1 gene identified in severe hypertriglyceridemia

IF 3.58 (2017)International audienceBACKGROUND:The LMF1 (lipase maturation factor 1) gene encodes a protein involved in lipoprotein lipase and hepatic lipase maturation. Homozygous mutations in LMF1 leading to severe hypertriglyceridemia (SHTG) are rare in the literature. A few additional rare LMF1 variants have been described with poor functional studies.OBJECTIVE:The aim of this study was to assess the frequency of LMF1 variants in a cohort of 385 patients with SHTG, without homozygous or compound heterozygous deleterious mutations identified in lipoprotein lipase (LPL), apolipoprotein A5 (APOA5), apolipoprotein C2 (APOC2), glycosylphosphatidylinositol-anchored high-density lipoprotein binding protein 1 (GPIHBP1) genes, and to determine their functionality.METHODS:LMF1 coding variants were screened using denaturing high-performance liquid chromatography followed by direct sequencing. In silico studies of LMF1 variants were performed, followed by in vitro functional studies using human embryonic kidney 293T (HEK-293T) cells cotransfected with vectors encoding human LPL and LMF1 cDNA. LPL activity was measured in cell culture medium after heparin addition using human VLDL-TG as substrate.RESULTS:Nineteen nonsynonymous coding LMF1 variants were identified in 65 patients; 10 variants were newly described in SHTG. In vitro, p.Gly172Arg, p.Arg354Trp, p.Arg364Gln, and p.Arg537Trp LMF1 variants decreased LPL activity, and the p.Trp464Ter variant completely abolished LPL activity. We identified a young girl heterozygote for the p.Trp464Ter variant and a homozygote carrier of the p.Gly172Arg variant with a near 50% decreased LPL activity in vitro and in vivo.CONCLUSION:The study confirms the rarity of LMF1 variants in a large cohort of patients with SHTG. LMF1 variants are likely to be involved in multifactorial hyperchylomicronemia. Partial LMF1 defects could be associated with intermittent phenotype as described for p.Gly172Arg homozygous and p.Trp464Ter heterozygous carriers