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Investigation of the regulation of prostaglandin synthesis in the bovine oviduct
Deckblatt-Impressum
Inhaltsverzeichnis
AbkĂĽrzungsverzeichnis
Einleitung und Aufgabenstellung
LiteraturĂĽbersicht
Material und Methoden
Ergebnisse
Diskussion
Zusammenfassung
Summary
Literaturverzeichnis
Danksagung
SelbständigkeitserklärungDas Ovidukt spielt eine entscheidende Rolle im Reproduktionsgeschehen. Es
stellt die optimalen Umweltbedingungen fĂĽr die Eizellreifung, die
Spermienkapazitation, den Gametentransport, die Befruchtung und die frĂĽhe
Embryonalentwicklung zur VerfĂĽgung. Hierbei handelt es sich um
Schlüsselprozesse bei der Entstehung der Trächtigkeit. Viele dieser Prozesse
werden durch Hormone wie beispielsweise Sexualsteroide oder Prostaglandine
reguliert oder beeinflusst. Insbesondere die Prostaglandine werden als
zentrale Mediatoren im Verlauf der Ovulation, der Befruchtung und der
Entstehung und Aufrechterhaltung der Trächtigkeit vermutet und wurden bereits
im bovinen Ovidukt nachgewiesen. Um einen genaueren Einblick in die Regulation
der Prostaglandinsynthese des bovinen Ovidukt zu erhalten, sollten die
zyklusabhängigen Veränderungen und lokalen Verteilungen der Enzyme der
Prostaglandinsynthesekaskade sowohl auf mRNA- als auch zum Teil auf
Proteinebene untersucht werden. Das bovine Untersuchungsmaterial stammte aus
dem Schlachthof und wurde in die vier folgenden Zyklusphasen eingeteilt: prä-
(Tag 19-21) und postovulatorische Phase (Tag 1-5) sowie frĂĽhe (Tag 6-12) und
späte Lutealphase (Tag 13-18). Zusätzlich wurde in ipsi- und kontralaterales
Ovidukt unterschieden und das einzelne Ovidukt weiter in Ampulle und Isthmus
geteilt. In den durch SpĂĽlen der Oviduktabschnitte gewonnenen Oviduktzellen
wurde die mRNA Expression der folgenden an der Prostaglandinsynthese
beteiligten Enzyme mittels quantitativer RT-PCR gemessen: sPLA2, cPLA2α,
cPLA2β, COX-1, COX-2, cPGES, mPGES-1, mPGES-2, PGFS, HSD, H-PGDS, L-PGDS und
PGIS. Die Transkripte aller untersuchten Enzyme konnten im bovinen Ovidukt
nachgewiesen werden. In der postovulatorischen Phase, in der die meisten der
oben genannten Prozesse stattfinden, zeigten COX-1, mPGES-1, HSD, PGFS und
H-PGDS ihre höchsten Expressionen während des Zyklus. Die höchste Expression
von cPLA2β und PGIS wurde in der präovulatorischen Phase und die von L-PGDS in
der späten Lutealphase detektiert. Eine zyklusunabhängige Expression zeigten
dagegen sPLA2, cPLA2α, COX-2, cPGES und mPGES-2. Auffällig waren lokale
Expressionsunterschiede innerhalb der Ovidukte: sPLA2, L-PGDS und PGIS wurden
in der Ampulle höher als im Isthmus und mPGES-1 und HSD im Isthmus höher als
in der Ampulle exprimiert. Unterschiede zwischen den Oviduktabschnitten der
ipsi- und kontralateralen Ovidukte wurden nicht gefunden. In Western Blot
Analysen wurde der Proteingehalt der Cyclooxygenasen ebenfalls in Abhängigkeit
von Zyklusphase und Ort im Ovidukt bestimmt. Es zeigte sich, dass COX-1 in der
frühen Lutealphase in größeren Mengen vorkam als in den anderen Zyklusphasen,
COX-2 zeigte dagegen eine einheitliche Expression ohne erkennbare Regulation
im Zyklusverlauf. Die Durchführung eines Cyclooxygenase-Aktivitätstests
zeigte, dass COX-1 den Hauptanteil zur Cyclooxygenaseaktivität im bovinen
Ovidukt beiträgt. Zur Lokalisierung ausgewählter Proteine innerhalb des
Ovidukts wurden immunhistologische Färbungen für COX-1, COX-2 und mPGES-1
durchgefĂĽhrt. COX-1 und mPGES-1 wurden sowohl in Epithelzellen als auch
glatten Muskelzellen des Ovidukts exprimiert, COX-2 wurde ausschlieĂźlich in
den Epithelzellen gefunden. Während COX-1 innerhalb der Epithelzellen sowohl
in Zytoplasma als auch Kern angefärbt war, wurde für mPGES-1 nur eine
Kernfärbung gefunden. COX-2 war ausschließlich im Zytoplasma lokalisiert. In
den glatten Muskelzellen wurden COX-1 und mPGES-1 im Zytoplasma detektiert. Um
eine potentielle Regulation der mRNA Expression dieser Enzyme zu erkennen,
wurden kultivierte bovine Oviduktzellen mit Ă–stradiol, Progesteron,
Arachidonsäure oder PGE2 über einen Zeitraum von 6 Stunden behandelt. Dabei
wurde festgestellt, dass die mRNA Expression von cPLA2α, COX-2 und mPGES-1
durch alle Behandlungen stimuliert wurde. Die mRNA Expression von PGIS wurde
nur durch die Zugabe von PGE2 stimuliert. Die anderen Enzyme zeigten keine
Veränderung ihrer mRNA Expression durch die Behandlung mit Östradiol,
Progesteron, Arachidonsäure oder PGE2. Aus den Ergebnissen der vorliegenden
Arbeit lässt sich folgern, dass im bovinen Ovidukt ein feinabgestimmtes und
zyklusabhängig reguliertes Prostaglandinsynthesesystem existiert. Das lässt
vermuten, dass Prostaglandine im bovinen Ovidukt direkten Einfluss nehmen
könnten auf das Überleben, die Reifung und den Transport der Oozyte sowie auf
den Befruchtungsvorgang und die Entwicklung des Embryos. Es ist folglich
anzunehmen, dass die Prostaglandine, wie in anderen Tierarten bereits gezeigt,
auch im Genitaltrakt der Kuh eine essentielle Rolle bei der Entstehung eines
neuen Organismus spielen.The oviduct plays a decisive role in reproduction as it provides a beneficial
environment for oocyte maturation, capacitation, gamete transport,
fertilization, and the early embryonic development. The latter are key
processes in the origin of pregnancy which are regulated by hormones, e.g.
sexual steroids and prostaglandins. For instance, prostaglandins are
considered to be central mediators concerning ovulation, fertilization, as
well as establishment and maintenance of pregnancy. Several prostaglandins
were already detected in the bovine oviduct. To get a better insight into the
regulation of prostaglandin synthesis within the bovine oviduct, estrous
cycle-dependent changes and local distributions of the enzymes were examined
on mRNA and partly on the protein level. Bovine oviducts were collected at the
local slaughterhouse and classified into one of the following four phases:
pre- (days 19-21) and postovulatory phase (days 1-5), early luteal phase (days
6-12), and late luteal phase (days 13-18). Moreover, the oviducts of each cow
were separated into the ipsilateral (to ovulation site/corpus luteum) and the
contralateral oviduct and further divided into ampulla and isthmus. The mRNA
expression of sPLA2, cPLA2α, cPLA2β, COX-1, COX-2, cPGES, mPGES-1, mPGES-2,
PGFS, HSD, H-PGDS, L-PGDS and PGIS was investigated in flushed oviductal cells
by quantitative RT-PCR. Specific mRNA transcripts of the listed enzymes were
detected in the bovine oviduct. COX-1, mPGES-1, HSD, PGFS and H-PGDS were
significantly higher expressed during the post-ovulatory phase at the time of
early reproductive events. The highest expression of cPLA2β and PGIS was
detected in the pre-ovulatory phase while L-PGDS showed the highest expression
in the late luteal phase. In contrast, sPLA2, cPLA2α, COX-2, cPGES and mPGES-2
were expressed estrous cycle-independently. Concerning the different regions
in the oviduct, sPLA2, L-PGDS and PGIS were higher expressed in the ampullary
parts in contrast to mPGES-1 and HSD which showed a higher expression in the
isthmic parts. No differences were observed between ipsi- and contralateral
oviducts. The protein amount of cyclooxygenases was quantified via western
blot analysis in relation to the estrous cycle-phase and the region of the
oviduct. COX-1 showed the highest protein expression in the early luteal phase
compared with the other phases. COX-2 showed a constant expression without an
evident regulation during estrous cycle. The examination of cyclooxygenase
activity revealed, that COX-1 contributed the majority of the cyclooxygenase
activity within the bovine oviduct. Immunohistological stainings for COX-1,
COX-2 and mPGES-1 revealed their exact localization within the oviduct. COX-1
and mPGES-1 were located in epithelial and smooth muscle cells in contrast to
COX-2 which was exclusively localized in epithelial cells. Inside epithelial
cells, mPGES-1 showed a nuclear staining while COX-1 was found in the
cytoplasm and nucleus. COX-2 was exclusively located in the cytoplasm. In the
smooth muscle cells COX-1 and mPGES-1 showed a cytoplasmic staining.
Additionally, a potential regulation of the mRNA expression of these enzymes
was investigated in cultured primary oviductal cells after treatment with 17β-
estradiol, progesterone, arachidonic acid or PGE2 in a time-dependent
experiment over a period of 6 hours. Cell culture experiments revealed that
cPLA2α, COX-2 and mPGES-1 mRNA expression was stimulated by all treatments
while PGIS mRNA was higher expressed after PGE2 application. The other enzymes
did not show any changes in their mRNA expression after treatment with 17β-
estradiol, progesterone, arachidonic acid or PGE2. All the results of this
study support the hypothesis that a fine-tuned and estrous cycle-dependent
regulated system for prostaglandin synthethis exists in the bovine oviduct.
That suggests that prostaglandins may directly influence survival, maturation
and transport of the oocyte as well as fertilization and embryonic
development. Therefore, it is likely that prostaglandins play an essential
role in the genital tract of the cow concerning the origin of a new organism
A transcriptomal analysis of bovine oviductal epithelial cells collected during the follicular phase versus the luteal phase of the estrous cycle
BACKGROUND: Reproductive success depends on a functional oviduct for gamete storage, maturation, fertilization, and early embryonic development. The ovarian-derived steroids estrogen and progesterone are key regulators of oviductal function. The objective of this study was to investigate luteal and follicular phase-specific oviductal epithelial cell function by using microarray-based transcriptional profiling, to increase our understanding of mRNAs regulating epithelial cell processes, and to identify novel genes and biochemical pathways that may be found to affect fertility in the future. METHODS: Six normally cycling Angus heifers were assigned to either luteal phase (LP, n = 3) or follicular phase (FP, n = 3) treatment groups. Heifers in the LP group were killed between day 11 and 12 after estrus. Heifers in the FP group were treated with 25 mg PGF(2α) (Lutalyse, Pfizer, NY) at 8 pm on day 6 after estrus and killed 36 h later. Transcriptional profiling by microarray and confirmation of selected mRNAs by real-time RT-PCR analyses was performed using total RNA from epithelial cells isolated from sections of the ampulla and isthmus collected from LP and FP treatment groups. Differentially expressed genes were subjected to gene ontology classification and bioinformatic pathway analyses. RESULTS: Statistical one-way ANOVA using Benjamini-hochberg multiple testing correction for false discovery rate (FDR) and pairwise comparison of epithelial cells in the ampulla of FP versus LP groups revealed 972 and 597 transcripts up- and down-regulated, respectively (P < 0.05). Within epithelial cells of the isthmus in FP versus LP groups, 946 and 817 transcripts were up- and down-regulated, respectively (P < 0.05). Up-regulated genes from both ampulla and isthmus were found to be largely involved in cholesterol biosynthesis and cell cycle pathways, while down-regulated genes were found in numerous inflammatory response pathways. CONCLUSIONS: Microarray-based transcriptional profiling revealed phase of the cycle-dependent changes in the expression of mRNA within the epithelium of the oviducts’ ampulla and isthmus. ELECTRONIC SUPPLEMENTARY MATERIAL: The online version of this article (doi:10.1186/s12958-015-0077-1) contains supplementary material, which is available to authorized users