Desenvolvimento de unidade digital de controlo auxiliar para baterias de condensadores

Trabalho final de mestrado para a obtenção de grau de mestre em Engenharia Eletrotécnica – Ramo de Automação e Eletrónica IndustrialA dissertação é uma contribuição no âmbito do estudo, da implementação e do desenvolvimento de um protótipo funcional, destinado ao controlo auxiliar de uma bateria de condensadores. O protótipo é uma solução alternativa à atualmente utilizada pela empresa envolvida no projeto, a NEMOTEK, tendo como função principal implementar na bateria de condensadores os horários provenientes pela Entidade Reguladora dos Serviços Energéticos (ERSE). Não é função do equipamento o cálculo do consumo ou fator de potência. A solução implementada recorre a duas entradas e três saídas, permitindo que as saídas comandem o ligar ou desligar total da bateria de condensadores, sendo esta formada por vários escalões, ou o ligar ou desligar de escalões individuais da bateria. O escalão pode ser de carácter capacitivo ou indutivo. Cada saída pode ser controlada exclusivamente pelo horário estabelecido, ou por uma das entradas, ou até por ambos, horário e entrada. As entradas podem ser configuradas para uma de duas funções, a de controlo ou de alarme, sendo possível escolher ambas as entradas com a mesma função, ou diferenciá-las. Para ser possível o controlo de uma saída a partir de uma entrada, esta entrada terá que ter a função de controlo, uma vez que a função de alarme está destinada apenas a desligar todas as saídas quando esta é acionada, emitindo um sinal sonoro, sobrepondo-se às eventuais entradas configuradas como controlo. A solução é apresentada num protótipo funcional, que utiliza um microcontrolador do tipo Arduino Mega. A complexidade na construção do algoritmo a usar no protótipo, consiste no gerir automaticamente a data e hora; a de atrasar ou adiantar a hora, segundo a hora legal de verão e inverno; a de gerir os feriados, independentemente do país onde for implementado, ou qual o dia da semana, entre outras tarefas ligadas a esta regulação temporal. Para a concretização do protótipo foi necessário planear e conceber a placa eletrónica, desde o Printed Circuit Board (PCB) até à soldagem dos componentes. Para isso foi utilizado o Eagle CAD. Além disso foram feitos testes laboratoriais para testar o comportamento de acordo com os requisitos físicos e de controlo estabelecidos neste projeto.The purpose of this dissertation is a contribution to the study, implementation and development of a functional prototype, for the auxiliary control of a capacitor bank. This is an alternative solution, to the one that is currently used by the company involved in this project, the NEMOTEK. The main function of the prototype is to implement the schedules provide by the Regulator of Energy Services (ERSE). Although the calculation of consumption power or power factor is not a function of this equipment. The implemented solution uses two inputs and three outputs, allowing the outputs to switch on or off the capacitor bank, being this formed by various steps, or to switch on or off only one step. These steps may have a capacitive or inductive character. In addition, the outputs can be controlled only by the schedule, or only by the input, or also by both, schedule and input. The inputs can be configured for one of two functions, control or alarm, and it is possible to choose both inputs with the same function or to differentiate them. To control an output by an input, the input must have the control function, because the alarm function is meant to turn off all the outputs, when the input with this function is activated, triggering a beep, overlapping the eventual inputs configured as control. The solution is established for a functional prototype, which uses the Arduino Mega microcontroller. This automatically manages the date and time. Is capable of checking by itself, when there is the need to delay or advance the hour, according to the summer and winter time. This system can also manage national holidays, regardless the country, or any weekday, among other tasks related to time regulation. For the implementation was necessary to design the all electronic board, from the Printed Circuit Board (PCB) to the soldering of the components. For this was used the Eagle CAD software. To verified the correct operations was performed tests in laboratory.N/

A importância do hedonismo na relação de compromisso entre o consumidor e as marcas através de comunidades online

O objetivo desta tese de Mestrado é o de analisar e identificar a importância do Hedonismo na relação de compromisso entre o consumidor e as marcas, através das Comunidades "Online". Neste sentido, definiu-se como objetivos a análise das variáveis com maior importância na relação de compromisso entre os consumidores e as Comunidades "Online" em que participam, a pesquisa da importância da variável da recompensa hedónica na relação de compromisso entre os consumidores e as Comunidades de Marcas "Online" em que participam, a comparação entre os resultados obtidos no questionário acerca desta relação e os resultados obtidos através de uma análise Netnográfica ao comportamento dos consumidores numa Comunidade de Marca "Online", e, por fim, o estudo de como poderão as marcas potenciar a sua presença junto do consumidor através das Comunidades "Online". Para dar resposta aos presentes objetivos, foram desenvolvidas duas abordagens diferentes, mas sequenciais. Após uma extensa Revisão da Literatura, efetuou-se um primeiro estudo quantitativo através de um questionário online com base em escalas pré- validadas. Seguidamente realizou-se um Estudo Netnográfico, através da técnica de "textmining" e aplicado a uma Comunidade de Marca "Online" específica, a "Beauty Insider" "Community" da "Sephora". Baseado nestes estudos, foi possível concluir que as Comunidades de Marca "Online" permitem que os consumidores tenham uma atualizada e fidedigna informação sobre a marca a que estão associados e que os mesmos entendam este tipo de plataformas como uma excelente forma de se manterem atualizados sobre a marca associada à Comunidade "Online" em que participam. Podemos concluir igualmente que os gestores e Marketers deverão saber proporcionar experiências aos consumidores, baseadas em opiniões reais. Uma marca ou Organização que envolva os seus consumidores será uma marca bemsucedida, uma vez que estes sentirão todos os seus desejos, necessidades e expectativas satisfeitas.The objective of this thesis is to analyze and identify the importance of Hedonism in the engagement between consumers and brands through Online Brand Communities. In this way, we have define as objectives the analysis of the most important constructs in the engagement between consumers and the online brand communities they participate, the research on the importance of hedonic reward construct in the engagement between consumers and the online brand communities where they participate, the results obtained by the questionnaire about the same constructs and the ones obtained through a Netnographic analysis of consumer behavior in an online brand community, and, finally, how brands can enhance their presence with the consumer through Online Brand Communities. In order to respond to these objectives, two different but sequential approaches have been developed. After an extensive Literature Review, a quantitative study was carried out, first, through a questionnaire based on pre-validated scales, followed by a Netnographic Study, using the text-mining technique and applied to a specific Online Brand Community, Beauty Insider Community from Sephora. Based on these studies, it was possible to conclude that Online Brand Communities allow consumers to have an up-to-date and reliable information about the brand they are associated with, and that they understand this type of platform as a great way to keep upto-date on the brand associated with the Online Community they participate. We can also conclude that managers and marketers should be able to provide experiences to consumers, based on real opinions. A brand or Organization that involves its consumers will be a successful brand, and consumers will feel all their desires, needs and expectations satisfied

Learn to Eat and Get a Move On

Healthy dieting and the practice of physical activities are deemed fundamental for the adequate growth, development and maintenance of health in young people. This project takes into account these priority areas and is directed towards the educational community, giving a voice to the students through projects such as "Ambassadors of Health" and "E- P@articipate". With "Learn to Eat and Get a Move On" a transversal involvement between community partners, projects and disciplinary areas were achieved, namely through the projects "Mediterranean Diet", "Geodesic Greenhouse" and physical education, with activities being developed in the areas of diet, health and environment. In the greenhouse, aromatic seeds were planted to highlight their importance in a diet, as well as a way to reduce or replace salt

SARS-CoV-2 decreases malaria severity in co-infected rodent models

Coronavirus disease 2019 (COVID-19) and malaria, caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) and Plasmodium parasites, respectively, share geographical distribution in regions where the latter disease is endemic, leading to the emergence of co-infections between the two pathogens. Thus far, epidemiologic studies and case reports have yielded insufficient data on the reciprocal impact of the two pathogens on either infection and related diseases. We established novel co-infection models to address this issue experimentally, employing either human angiotensin-converting enzyme 2 (hACE2)-expressing or wild-type mice, in combination with human- or mouse-infective variants of SARS-CoV-2, and the P. berghei rodent malaria parasite. We now show that a primary infection by a viral variant that causes a severe disease phenotype partially impairs a subsequent liver infection by the malaria parasite. Additionally, exposure to an attenuated viral variant modulates subsequent immune responses and provides protection from severe malaria-associated outcomes when a blood stage P. berghei infection was established. Our findings unveil a hitherto unknown host-mediated virus-parasite interaction that could have relevant implications for disease management and control in malaria-endemic regions. This work may contribute to the development of other models of concomitant infection between Plasmodium and respiratory viruses, expediting further research on co-infections that lead to complex disease presentations.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Suprascapular nerve block in shoulder dislocation

Background: The suprascapular nerve is the main sensitive nerve of the shoulder. In 1973, the suprascapular nerve block was applied in the reduction of a series of cases of acute shoulder dislocations using mepivacaine. Barber described a method using anatomic landmarks to locate and block the suprascapular nerve. Methods: This study was approved by our Institutional Review Board and all patients signed an informed consent. We performed a prospective longitudinal study, characterized by a consecutive series of first episode of traumatic shoulder dislocation in patients over 18 years old. From July 2020 to April 2022, 50 cases were included in our study. All patients had their pain evaluated before the blockage, during the reduction and after the reduction. We used the Barber method for the blockage and the Spaso maneuver for reduction. Results: From the 50 cases, 29 were males (58%). The mean age was 58,7 years. 47 cases were anterior dislocations, 2 cases posterior dislocations and one case of luxatio erecta. The mean initial VAS was 7.5 points (minimal 4, maximum 10). The main score during the reduction maneuver was 2 points (0-5) and the main score after reduction was 0,4 (0-3). In only one case, reduction was not successful after 3 attempts, and reduction was performed under sedation. Conclusions: The suprascapular nerve block by Barber’s method proves to be a secure, effective and simple procedure to aid the shoulder dislocation reduction in the emergency room, without the need of any imaging resources

Regulatory T-cell development in the human thymus

© 2015 Caramalho, Nunes-Cabaço, Foxall and Sousa. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (CC BY). The use, distribution or reproduction in other forums is permitted, provided the original author(s) or licensor are credited and that the original publication in this journal is cited, in accordance with accepted academic practice. No use, distribution or reproduction is permitted which does not comply with these terms.The thymus generates a lineage-committed subset of regulatory T-cells (Tregs), best identified by the expression of the transcription factor FOXP3. The development of thymus-derived Tregs is known to require high-avidity interaction with MHC-self peptides leading to the generation of self-reactive Tregs fundamental for the maintenance of self-tolerance. Notwithstanding their crucial role in the control of immune responses, human thymic Treg differentiation remains poorly understood. In this mini-review, we will focus on the developmental stages at which Treg lineage commitment occurs, and their spatial localization in the human thymus, reviewing the molecular requirements, including T-cell receptor and cytokine signaling, as well as the cellular interactions involved. An overview of the impact of described thymic defects on the Treg compartment will be provided, illustrating the importance of these in vivo models to investigate human Treg development.IC, HN-C, and RBF received scholarships from Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) cofinanced by Programa Operacional Ciência e Inovação 2010 (POCI2010)

Seroprevalence of anti-SARS-CoV-2 antibodies in COVID-19 patients and healthy volunteers up to 6 months post disease onset

SARS-CoV-2 has emerged as a human pathogen, causing clinical signs, from fever to pneumonia—COVID-19—but may remain mild or asymptomatic. To understand the continuing spread of the virus, to detect those who are and were infected, and to follow the immune response longitudinally, reliable and robust assays for SARS-CoV-2 detection and immunological monitoring are needed. We quantified IgM, IgG, and IgA antibodies recognizing the SARS-CoV-2 receptor-binding domain (RBD) or the Spike (S) protein over a period of 6 months following COVID-19 onset. We report the detailed setup to monitor the humoral immune response from over 300 COVID-19 hospital patients and healthcare workers, 2500 University staff, and 198 post-COVID-19 volunteers. Anti-SARS-CoV-2 antibody responses follow a classic pattern with a rapid increase within the first three weeks after symptoms. Although titres reduce subsequently, the ability to detect anti-SARS-CoV-2 IgG antibodies remained robust with confirmed neutralization activity for up to 6 months in a large proportion of previously virus-positive screened subjects. Our work provides detailed information for the assays used, facilitating further and longitudinal analysis of protective immunity to SARS-CoV-2. Importantly, it highlights a continued level of circulating neutralising antibodies in most people with confirmed SARS-CoV-2.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Epithelial and dendritic cells in the thymic medulla promote CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cell development via the CD27-CD70 pathway

This work was supported by grants NKI 2004-3087 and NKI 2008-2023 from the Dutch Cancer Society to J. Borst, European Molecular Biology Organization long-term fellowships to J.M. Coquet and J.C. Ribot, a Rubicon (The Netherlands Organisation for Scientific Research [NWO]) fellowship to J.M. Coquet, and a Fundação para a Ciência e Tecnologia project grant (PTDC/SAU-MII/104158/2008) and a European Research Council starting grant (StG260352) to B. Silva-Santos. J.F. Neves is funded by the Fundação para a Ciência e Technologia of Portugal; D.J. Pennington is funded by the Wellcome Trust

Development of regulatory T cells in the human thymus : one step beyond =desenvolvimento de células T reguladoras no timo humano

Tese de doutoramento, Medicina (Ciências Biomédicas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2010O timo é um órgão linfóide primário essencial para o desenvolvimento das células T, sendo responsável pela formação de um repertório capaz de combater possíveis patogéneos estranhos ao organismo sem comprometer a tolerância ao próprio. Esta tolerência é maioritariamente garantida pelo timo, quer pela eliminação de linfócitos T potencialmente auto-reactivos, quer pela produção de uma população de células T, denominadas células T regulatoras (Treg), devotada ao controlo da resposta imune, particularmente no contexto de processos autoimunes e inflamatórios. A diferenciação no timo de progenitores provenientes da medula óssea em células T CD4 ou CD8 maduras ocorre através de uma sequência de estadios de desenvolvimento que podem ser definidos com base na expressão das moléculas CD3, CD4 e CD8. Em humanos, células CD4- CD8- CD3- triplamente negativas (TN) adquirem inicialmente CD4 (estadio CD4 monopositivo imaturo, CD4ISP) e posteriormente CD8, tornando-se células CD4+ CD8+ duplamente positivas (DP). Na sequência de rearranjos genéticos do receptor de células T (TCR), este é expresso à superfície e é testada a sua capacidade de reconhecer o complexo de histocompatibilidade major (MHC), fundamental para a apresentação de antigénios. Células cujo TCR não reconheça MHC morrem por apoptose (“morte por negligência”). Apenas células apresentando TCRs que reconhecem MHC do próprio recebem sinais de sobrevivência (“selecção positiva”) e de diferenciação em células T CD4 ou CD8 maturas. Estudos no ratinho mostram que a intensidade e duração da sinalização pelo TCR durante a diferenciação tímica são determinantes na decisão de uma célula se tornar uma célula T CD4 ou CD8. Uma sinalização excessivamente intensa pelo TCR induz “selecção negativa”, resultando na apoptose de linfócitos potencialmente autoreactivos. A sinalização pelo TCR é também essencial para o desenvolvimento tímico de Tregs. Pensa-se que a sua selecção ocorre num intervalo muito restrito de afinidade das ligações TCR-ligando, entre a selecção positiva de células T convencionais e a selecção negativa de linfócitos T autoreactivos com TCR de alta afinidade. Neste sentido, tem sido atribuída às Tregs a característica peculiar de possuírem uma autoreactividade aumentada. Actualmente, o factor de transcrição Foxp3 (forkhead box P3) é considerado o marcador mais adequado para a identificação de Tregs. O seu papel essencial no desenvolvimento e função de Tregs é suportado pela associação de mutações de Foxp3 com o síndrome fatal IPEX (immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome, síndrome auto-imune linfoproliferativo severo) e também pelo síndrome autoimune fatal observado em ratinhos scurfy, “naturalmente” deficientes em Foxp3. Outras moléculas cuja expressão tem também sido associada a Tregs incluem a cadeia α do receptor de interleucina 2 (IL-2Rα, CD25), CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte antigen 4), o ectoapirase CD39 e baixos níveis da cadeia α do receptor de IL-7 (IL-7Rα, CD127). Neste estudo investigámos o desenvolvimento de Tregs, identificadas pela expressão de Foxp3 e de outros marcadores associados, em timos de indivíduos em idade pediátrica. Em particular, perguntámos quando ocorre o comprometimento dos timócitos para a linhagem de Tregs durante o desenvolvimento, uma vez que esta questão é relevante para o repertório das Tregs. Perguntámos ainda como se compara o desenvolvimento das Tregs com o de linfócitos T convencionais. Na primeira parte do trabalho analisámos o padrão de expressão de Foxp3 em timócitos humanos e murinos. Os nossos resultados revelam a expressão de Foxp3 em fases anteriores ao estadio DP, nomeadamente em timócitos no estadio CD4ISP em humanos e no estadio CD4- CD8- duplamente negativo 4 (DN4) em ratinhos. Mostram ainda que, em ratinhos, células Foxp3+ DN4 possuem rearranjos genéticos da cadeia α do TCR (TCRα). Recorrendo ao ratinho deficiente em TCRα como uma ferramenta genética mostramos que, na ausência de TCRα, a expressão de Foxp3 no estadio DN4 é abolida. Colectivamente, os nossos dados revelam a expressão de Foxp3 em fases pré-DP em timócitos humanos e murinos e confirmam que a expressão precoce de Foxp3 é dependente do TCR. Na segunda parte do trabalho estudámos a indução de Foxp3 no estadio DP e a possível diferenciação de timócitos Foxp3+ DP no estadio mais maturo Foxp3+ SP. Usando um ensaio de reexpressão, que consiste na clivagem de moléculas de superfície usando pronase e na síntese e reexpressão em cultura de moléculas transcripcionalmente activas, mostramos que a expressão de Foxp3 na fase DP ocorre em “verdadeiras” células DP. Mostramos ainda que os timócitos Foxp3+ DP apresentam um fenótipo maturo e uma distribuição das famílias TCR Vβ que se assemelha à dos timócitos DP que não expressam Foxp3. Identificamos também uma população de timócitos Foxp3+ DP que apresenta um aumento do programa transcripcional associado com o fenótipo activado/supressor na periferia, expressando elevados níveis de marcadores associados com Tregs, tais como CD25, CTLA-4, CD39 e MHC classe II (HLA-DR). Esta população está também presente em timócitos Foxp3+ CD4SP, nos quais a intensidade de expressão dos marcadores supramencionados parece decair antes da exportação das células do timo para a periferia. Os timócitos Foxp3+ CD8SP não apresentam a referida população, mas expressam a molécula CD103 (αE), constituinte da integrina αEβ7. A expressão de CD103 está associada com a migração para a mucosa, o que pode explicar os níveis reduzidos de Tregs CD8 circulantes. Mostramos ainda que a molécula CD103 está já presente em células Foxp3+ no estadio DP, o que sugere uma possível relação precursorprogenia entre os timócitos Foxp3+ CD103+ DP e CD8SP. A possível diferenciação de timócitos Foxp3+ DP em Foxp3+ SP foi analisada com base num modelo estatístico de análise de regressão múltipla. Este modelo suporta um contributo significativo das células Foxp3+ DP para o pool Foxp3+ SP. Em resumo, os nossos dados indicam que Foxp3 é induzido na fase DP e que uma parte significativa dos timócitos Foxp3+ DP se diferencienciam em células Foxp3+ SP, que irão incorporar o pool de Tregs na periferia. Em contraste com o que é observado na periferia, mostramos que uma fracção significativa dos timócitos Foxp3+ DP expressa níveis consideráveis do receptor de IL-7. A funcionalidade deste receptor à superfície dos timócitos Foxp3+ DP foi confirmada através do estado da fosforilação da molécula STAT5 (signal transducer and activator of transcription 5), associada à acção da IL-7, após estimulação de timócitos com esta citoquina. Mostramos ainda que IL-7 induz o aumento de intensidade de CD25 nos timócitos Foxp3+ DP em cultura. Estes resultados sugerem que a IL-7 poderá ter um papel significativo no desenvolvimento timico de Tregs em humanos. Esta observação pode ser de importância particularmente significativa em situações onde há alterações dos níveis de IL-7, tal como no contexto de situações clínicas de linfopénia como observado, por exemplo, na patologia do HIV. Em conclusão, os nossos dados suportam que a expressão de Foxp3 em timócitos humanos requer sinalização pelo TCR e ocorre antes da decisão CD4 vs. CD8. Mostramos que os timócitos Foxp3+ DP expressam um fenótipo activado semelhante ao apresentado em Tregs activadas na periferia mas associado à expressão de receptor de IL-7 funcional, o que naquela fase possivelmente protege os timócitos de apoptose/selecção negativa. Identificámos ainda uma subpopulação das células Foxp3+ DP que expressa CD103 e que está provavelmente na origem das células Foxp3+ CD8SP, com migração preferencial para a mucosa. Finalmente, modelos de análise de regressão múltipla suportam que um comprometimento significativo para a linhagem Treg ocorre na fase DP, com possíveis implicações para o repertório e função da população de Treg. Estudos humanos, Timo, Desenvolvimento de Células T, Células T reguladoras, Foxp3.The thymus is a primary lymphoid organ crucially involved in the development of T cells. While producing a self-tolerant T cell repertoire that warrants surveillance to foreign pathogenic threats, the thymus also produces a lineage of regulatory T cells (Tregs) that are deeply involved in the control of immune responses, particularly in the context of inflammatory and autoimmune processes. Differentiation of blood-derived T cell progenitors to mature CD4 or CD8 T cells in the thymus is accomplished by sequential development through a series of stages that can be defined by the expression of CD3, CD4 and CD8. In humans, CD4-CD8-CD3- triple negative (TN) cells first acquire CD4 (CD4 immature single positive stage, CD4ISP stage) and then CD8 to become CD4+CD8+ (double positive stage, DP stage) cells. Upon T cell receptor (TCR) gene rearrangements, DP cells “test” their TCR for recognition of the antigen-presenting molecules named major histocompatibility complex (MHC). While cells that are unable to recognize self-MHC undergo “death by neglect”, DP thymocytes bearing TCRαβ complexes that can engage self-MHC molecules are signaled to survive, a process designated as “positive selection”, and to differentiate into functionally mature CD4 single positive (CD4+CD8-CD3high, CD4SP) or CD8 single positive (CD4-CD8+CD3high, CD8SP) T cells. Data from mouse models suggest that the strength and duration of TCR signaling is determinant in CD4 vs. CD8 lineage decision during thymic differentiation. Strong TCR signaling induces “negative selection”, resulting in programmed cell death of potentially auto-reactive cells. TCR signaling has been shown to be essential for Treg differentiation in the thymus. It has been proposed that Treg selection may occur within a very narrow window of affinity of TCR-ligand interactions, between positive selection of conventional CD4 T cells and negative selection of high-affinity self-reactive T cells. In agreement, increased self- reactivity is considered a unique feature of Tregs. At present, the forkhead winged-helix transcription factor Foxp3 is considered the best available marker to identify Tregs. The essential role of Foxp3 in Treg development and function is supported by the association of Foxp3 defects with the fatal condition IPEX (immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome) and also by the lethal autoimmune syndrome observed in scurfy and Foxp3 knock-out mice. Other molecules whose expression has also been associated with Treg function include the interleukin 2 receptor α chain (IL-2Rα, CD25), the cytotoxic Tlymphocyte antigen 4 (CTLA-4), the ectoapyrase CD39 and low levels of the IL-7 receptor α chain (IL-7Rα, CD127). We have investigated the development of human Tregs, as identified by the expression of Foxp3, as well as of other Treg-associated markers, in human pediatric thymuses. Specifically, we asked when commitment to the Treg lineage occurred during T cell development, since this is particularly relevant for the generation of the Treg repertoire. In addition, we assessed the developmental pathway of Tregs in the thymus. In particular, we asked whether Treg development occurred similarly to what is observed in conventional, Foxp3- T cells. In the first part of the work we dissected the early expression pattern of Foxp3 in human and murine thymocytes and showed that Foxp3 expression can be detected in pre-double positive (pre-DP) subsets, particularly in CD4ISP thymocytes in humans and in double negative stage 4 (DN4) cells in mice. We further showed that Foxp3-expressing murine thymocytes at the DN4 stage possess productive TCRα gene rearrangements. In addition, using the TCRα-deficient mouse model as a genetic tool we have found that Foxp3 expression was abolished in TCRα-deficient DN thymocytes. Collectively, our data have identified the pre-DP expression of Foxp3 in human and murine thymocytes and confirmed the TCR-dependency of the early Foxp3 expression in pre-DP thymocytes. In the second part of the work we studied the induction of Foxp3 at the DP stage and the possible differentiation of Foxp3+ DP thymocytes into the SP stages. Using a reexpression assay, where surface molecules were cleaved using pronase and transcriptionally active molecules were allowed to be synthesized and re-expressed, we were able to show that Foxp3 expression at the DP stage occurs in bona fide DP thymocytes. We also showed that Foxp3+ DP thymocytes have a mature phenotype and a TCR Vβ family distribution that closely resembled that of Foxp3 negative DP thymocytes. We further found that a population within Foxp3-expressing DP thymocytes presented an up-regulation of the transcriptional program associated with an activated/suppressor phenotype in the periphery and expressed high levels of the Treg-associated markers CD25, CTLA-4, CD39 and MHC class II (HLA-DR). This population was also found within Foxp3+ CD4SP thymocytes, in which the expression of those markers appeared to decline prior to thymic egress. While Foxp3+ CD8SP thymocytes were devoid of high expression of those markers, they homogeneously expressed CD103 (αE), which is part of the αEβ7 integrin. CD103 expression is associated with migration to the mucosa, which might explain the very low levels of circulating CD8 Tregs. In addition, we found that Foxp3+ cells expressing CD103 were already present at the DP stage, indicating possible precursor-progeny relationship between Foxp3+CD103+ DP and CD8SP thymocytes. In order to further investigate a possible direct precursor-progeny association between Foxp3-expressing DP and SP cells we performed statistical analysis of our data using multiple regression analysis. This model supported the significant weight of Foxp3+ DP cells to the SP pool. Overall, our data thus indicate that considerable Foxp3 induction occurs at the DP stage and that a significant part of Foxp3+ DP thymocytes probably progresses to the SP stages, and will incorporate the Treg pool upon thymus egress. In addition, and in clear contrast to what is observed in the periphery, we found that a large proportion of Foxp3+ DP thymocytes expressed considerable levels of IL-7 receptor (IL-7R). We assessed the functionality of IL-7R at the surface of Foxp3+ DP cells and showed that phosphorylation of STAT5 (“signal transducer and activator of transcription 5”), a downstream target of IL-7, was readily observed upon exposure to that cytokine. Furthermore, short-term culture with IL-7 induced the upregulation of CD25 on Foxp3+ DP thymocytes. Together, these results suggest that IL-7 may play a role in the development of human Tregs. Although requiring further investigation, this finding may be of particular significance in the context of situations where IL-7 levels are altered, such as lymphopenia, as observed in HIV pathology. In conclusion, our data support that the expression of Foxp3 in human thymocytes requires TCR signaling and occurs prior to CD4 or CD8 lineage commitment. Foxp3+ DP thymocytes were shown to express an activated phenotype that is reminiscent of that found in peripheral activated Tregs but is associated with the expression of a functional IL-7 receptor, which may protect them from cell death/negative selection. A subpopulation of Foxp3+ DP expressing CD103 is likely to give rise to a population of Foxp3 CD8 T cells with preferential homing to the mucosa. Finally, multiple regression models support that a significant commitment to the Treg lineage occurs at the DP stage, with possible implications for Treg repertoire and function. Human studies, Thymus, T cell development, Regulatory T cell, Foxp3.O trabalho foi co-financiado pelo POCI 2010 e o FSE. Bolsa de Doutoramento da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (Referência: POCTI/SFRH/BD/12617/2003

Development of regulatory T cells in the human thymus : one step beyond =desenvolvimento de células T reguladoras no timo humano

Tese de doutoramento, Medicina (Ciências Biomédicas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2010O timo é um órgão linfóide primário essencial para o desenvolvimento das células T, sendo responsável pela formação de um repertório capaz de combater possíveis patogéneos estranhos ao organismo sem comprometer a tolerância ao próprio. Esta tolerência é maioritariamente garantida pelo timo, quer pela eliminação de linfócitos T potencialmente auto-reactivos, quer pela produção de uma população de células T, denominadas células T regulatoras (Treg), devotada ao controlo da resposta imune, particularmente no contexto de processos autoimunes e inflamatórios. A diferenciação no timo de progenitores provenientes da medula óssea em células T CD4 ou CD8 maduras ocorre através de uma sequência de estadios de desenvolvimento que podem ser definidos com base na expressão das moléculas CD3, CD4 e CD8. Em humanos, células CD4- CD8- CD3- triplamente negativas (TN) adquirem inicialmente CD4 (estadio CD4 monopositivo imaturo, CD4ISP) e posteriormente CD8, tornando-se células CD4+ CD8+ duplamente positivas (DP). Na sequência de rearranjos genéticos do receptor de células T (TCR), este é expresso à superfície e é testada a sua capacidade de reconhecer o complexo de histocompatibilidade major (MHC), fundamental para a apresentação de antigénios. Células cujo TCR não reconheça MHC morrem por apoptose (“morte por negligência”). Apenas células apresentando TCRs que reconhecem MHC do próprio recebem sinais de sobrevivência (“selecção positiva”) e de diferenciação em células T CD4 ou CD8 maturas. Estudos no ratinho mostram que a intensidade e duração da sinalização pelo TCR durante a diferenciação tímica são determinantes na decisão de uma célula se tornar uma célula T CD4 ou CD8. Uma sinalização excessivamente intensa pelo TCR induz “selecção negativa”, resultando na apoptose de linfócitos potencialmente autoreactivos. A sinalização pelo TCR é também essencial para o desenvolvimento tímico de Tregs. Pensa-se que a sua selecção ocorre num intervalo muito restrito de afinidade das ligações TCR-ligando, entre a selecção positiva de células T convencionais e a selecção negativa de linfócitos T autoreactivos com TCR de alta afinidade. Neste sentido, tem sido atribuída às Tregs a característica peculiar de possuírem uma autoreactividade aumentada. Actualmente, o factor de transcrição Foxp3 (forkhead box P3) é considerado o marcador mais adequado para a identificação de Tregs. O seu papel essencial no desenvolvimento e função de Tregs é suportado pela associação de mutações de Foxp3 com o síndrome fatal IPEX (immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome, síndrome auto-imune linfoproliferativo severo) e também pelo síndrome autoimune fatal observado em ratinhos scurfy, “naturalmente” deficientes em Foxp3. Outras moléculas cuja expressão tem também sido associada a Tregs incluem a cadeia α do receptor de interleucina 2 (IL-2Rα, CD25), CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte antigen 4), o ectoapirase CD39 e baixos níveis da cadeia α do receptor de IL-7 (IL-7Rα, CD127). Neste estudo investigámos o desenvolvimento de Tregs, identificadas pela expressão de Foxp3 e de outros marcadores associados, em timos de indivíduos em idade pediátrica. Em particular, perguntámos quando ocorre o comprometimento dos timócitos para a linhagem de Tregs durante o desenvolvimento, uma vez que esta questão é relevante para o repertório das Tregs. Perguntámos ainda como se compara o desenvolvimento das Tregs com o de linfócitos T convencionais. Na primeira parte do trabalho analisámos o padrão de expressão de Foxp3 em timócitos humanos e murinos. Os nossos resultados revelam a expressão de Foxp3 em fases anteriores ao estadio DP, nomeadamente em timócitos no estadio CD4ISP em humanos e no estadio CD4- CD8- duplamente negativo 4 (DN4) em ratinhos. Mostram ainda que, em ratinhos, células Foxp3+ DN4 possuem rearranjos genéticos da cadeia α do TCR (TCRα). Recorrendo ao ratinho deficiente em TCRα como uma ferramenta genética mostramos que, na ausência de TCRα, a expressão de Foxp3 no estadio DN4 é abolida. Colectivamente, os nossos dados revelam a expressão de Foxp3 em fases pré-DP em timócitos humanos e murinos e confirmam que a expressão precoce de Foxp3 é dependente do TCR. Na segunda parte do trabalho estudámos a indução de Foxp3 no estadio DP e a possível diferenciação de timócitos Foxp3+ DP no estadio mais maturo Foxp3+ SP. Usando um ensaio de reexpressão, que consiste na clivagem de moléculas de superfície usando pronase e na síntese e reexpressão em cultura de moléculas transcripcionalmente activas, mostramos que a expressão de Foxp3 na fase DP ocorre em “verdadeiras” células DP. Mostramos ainda que os timócitos Foxp3+ DP apresentam um fenótipo maturo e uma distribuição das famílias TCR Vβ que se assemelha à dos timócitos DP que não expressam Foxp3. Identificamos também uma população de timócitos Foxp3+ DP que apresenta um aumento do programa transcripcional associado com o fenótipo activado/supressor na periferia, expressando elevados níveis de marcadores associados com Tregs, tais como CD25, CTLA-4, CD39 e MHC classe II (HLA-DR). Esta população está também presente em timócitos Foxp3+ CD4SP, nos quais a intensidade de expressão dos marcadores supramencionados parece decair antes da exportação das células do timo para a periferia. Os timócitos Foxp3+ CD8SP não apresentam a referida população, mas expressam a molécula CD103 (αE), constituinte da integrina αEβ7. A expressão de CD103 está associada com a migração para a mucosa, o que pode explicar os níveis reduzidos de Tregs CD8 circulantes. Mostramos ainda que a molécula CD103 está já presente em células Foxp3+ no estadio DP, o que sugere uma possível relação precursorprogenia entre os timócitos Foxp3+ CD103+ DP e CD8SP. A possível diferenciação de timócitos Foxp3+ DP em Foxp3+ SP foi analisada com base num modelo estatístico de análise de regressão múltipla. Este modelo suporta um contributo significativo das células Foxp3+ DP para o pool Foxp3+ SP. Em resumo, os nossos dados indicam que Foxp3 é induzido na fase DP e que uma parte significativa dos timócitos Foxp3+ DP se diferencienciam em células Foxp3+ SP, que irão incorporar o pool de Tregs na periferia. Em contraste com o que é observado na periferia, mostramos que uma fracção significativa dos timócitos Foxp3+ DP expressa níveis consideráveis do receptor de IL-7. A funcionalidade deste receptor à superfície dos timócitos Foxp3+ DP foi confirmada através do estado da fosforilação da molécula STAT5 (signal transducer and activator of transcription 5), associada à acção da IL-7, após estimulação de timócitos com esta citoquina. Mostramos ainda que IL-7 induz o aumento de intensidade de CD25 nos timócitos Foxp3+ DP em cultura. Estes resultados sugerem que a IL-7 poderá ter um papel significativo no desenvolvimento timico de Tregs em humanos. Esta observação pode ser de importância particularmente significativa em situações onde há alterações dos níveis de IL-7, tal como no contexto de situações clínicas de linfopénia como observado, por exemplo, na patologia do HIV. Em conclusão, os nossos dados suportam que a expressão de Foxp3 em timócitos humanos requer sinalização pelo TCR e ocorre antes da decisão CD4 vs. CD8. Mostramos que os timócitos Foxp3+ DP expressam um fenótipo activado semelhante ao apresentado em Tregs activadas na periferia mas associado à expressão de receptor de IL-7 funcional, o que naquela fase possivelmente protege os timócitos de apoptose/selecção negativa. Identificámos ainda uma subpopulação das células Foxp3+ DP que expressa CD103 e que está provavelmente na origem das células Foxp3+ CD8SP, com migração preferencial para a mucosa. Finalmente, modelos de análise de regressão múltipla suportam que um comprometimento significativo para a linhagem Treg ocorre na fase DP, com possíveis implicações para o repertório e função da população de Treg. Estudos humanos, Timo, Desenvolvimento de Células T, Células T reguladoras, Foxp3.The thymus is a primary lymphoid organ crucially involved in the development of T cells. While producing a self-tolerant T cell repertoire that warrants surveillance to foreign pathogenic threats, the thymus also produces a lineage of regulatory T cells (Tregs) that are deeply involved in the control of immune responses, particularly in the context of inflammatory and autoimmune processes. Differentiation of blood-derived T cell progenitors to mature CD4 or CD8 T cells in the thymus is accomplished by sequential development through a series of stages that can be defined by the expression of CD3, CD4 and CD8. In humans, CD4-CD8-CD3- triple negative (TN) cells first acquire CD4 (CD4 immature single positive stage, CD4ISP stage) and then CD8 to become CD4+CD8+ (double positive stage, DP stage) cells. Upon T cell receptor (TCR) gene rearrangements, DP cells “test” their TCR for recognition of the antigen-presenting molecules named major histocompatibility complex (MHC). While cells that are unable to recognize self-MHC undergo “death by neglect”, DP thymocytes bearing TCRαβ complexes that can engage self-MHC molecules are signaled to survive, a process designated as “positive selection”, and to differentiate into functionally mature CD4 single positive (CD4+CD8-CD3high, CD4SP) or CD8 single positive (CD4-CD8+CD3high, CD8SP) T cells. Data from mouse models suggest that the strength and duration of TCR signaling is determinant in CD4 vs. CD8 lineage decision during thymic differentiation. Strong TCR signaling induces “negative selection”, resulting in programmed cell death of potentially auto-reactive cells. TCR signaling has been shown to be essential for Treg differentiation in the thymus. It has been proposed that Treg selection may occur within a very narrow window of affinity of TCR-ligand interactions, between positive selection of conventional CD4 T cells and negative selection of high-affinity self-reactive T cells. In agreement, increased self- reactivity is considered a unique feature of Tregs. At present, the forkhead winged-helix transcription factor Foxp3 is considered the best available marker to identify Tregs. The essential role of Foxp3 in Treg development and function is supported by the association of Foxp3 defects with the fatal condition IPEX (immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome) and also by the lethal autoimmune syndrome observed in scurfy and Foxp3 knock-out mice. Other molecules whose expression has also been associated with Treg function include the interleukin 2 receptor α chain (IL-2Rα, CD25), the cytotoxic Tlymphocyte antigen 4 (CTLA-4), the ectoapyrase CD39 and low levels of the IL-7 receptor α chain (IL-7Rα, CD127). We have investigated the development of human Tregs, as identified by the expression of Foxp3, as well as of other Treg-associated markers, in human pediatric thymuses. Specifically, we asked when commitment to the Treg lineage occurred during T cell development, since this is particularly relevant for the generation of the Treg repertoire. In addition, we assessed the developmental pathway of Tregs in the thymus. In particular, we asked whether Treg development occurred similarly to what is observed in conventional, Foxp3- T cells. In the first part of the work we dissected the early expression pattern of Foxp3 in human and murine thymocytes and showed that Foxp3 expression can be detected in pre-double positive (pre-DP) subsets, particularly in CD4ISP thymocytes in humans and in double negative stage 4 (DN4) cells in mice. We further showed that Foxp3-expressing murine thymocytes at the DN4 stage possess productive TCRα gene rearrangements. In addition, using the TCRα-deficient mouse model as a genetic tool we have found that Foxp3 expression was abolished in TCRα-deficient DN thymocytes. Collectively, our data have identified the pre-DP expression of Foxp3 in human and murine thymocytes and confirmed the TCR-dependency of the early Foxp3 expression in pre-DP thymocytes. In the second part of the work we studied the induction of Foxp3 at the DP stage and the possible differentiation of Foxp3+ DP thymocytes into the SP stages. Using a reexpression assay, where surface molecules were cleaved using pronase and transcriptionally active molecules were allowed to be synthesized and re-expressed, we were able to show that Foxp3 expression at the DP stage occurs in bona fide DP thymocytes. We also showed that Foxp3+ DP thymocytes have a mature phenotype and a TCR Vβ family distribution that closely resembled that of Foxp3 negative DP thymocytes. We further found that a population within Foxp3-expressing DP thymocytes presented an up-regulation of the transcriptional program associated with an activated/suppressor phenotype in the periphery and expressed high levels of the Treg-associated markers CD25, CTLA-4, CD39 and MHC class II (HLA-DR). This population was also found within Foxp3+ CD4SP thymocytes, in which the expression of those markers appeared to decline prior to thymic egress. While Foxp3+ CD8SP thymocytes were devoid of high expression of those markers, they homogeneously expressed CD103 (αE), which is part of the αEβ7 integrin. CD103 expression is associated with migration to the mucosa, which might explain the very low levels of circulating CD8 Tregs. In addition, we found that Foxp3+ cells expressing CD103 were already present at the DP stage, indicating possible precursor-progeny relationship between Foxp3+CD103+ DP and CD8SP thymocytes. In order to further investigate a possible direct precursor-progeny association between Foxp3-expressing DP and SP cells we performed statistical analysis of our data using multiple regression analysis. This model supported the significant weight of Foxp3+ DP cells to the SP pool. Overall, our data thus indicate that considerable Foxp3 induction occurs at the DP stage and that a significant part of Foxp3+ DP thymocytes probably progresses to the SP stages, and will incorporate the Treg pool upon thymus egress. In addition, and in clear contrast to what is observed in the periphery, we found that a large proportion of Foxp3+ DP thymocytes expressed considerable levels of IL-7 receptor (IL-7R). We assessed the functionality of IL-7R at the surface of Foxp3+ DP cells and showed that phosphorylation of STAT5 (“signal transducer and activator of transcription 5”), a downstream target of IL-7, was readily observed upon exposure to that cytokine. Furthermore, short-term culture with IL-7 induced the upregulation of CD25 on Foxp3+ DP thymocytes. Together, these results suggest that IL-7 may play a role in the development of human Tregs. Although requiring further investigation, this finding may be of particular significance in the context of situations where IL-7 levels are altered, such as lymphopenia, as observed in HIV pathology. In conclusion, our data support that the expression of Foxp3 in human thymocytes requires TCR signaling and occurs prior to CD4 or CD8 lineage commitment. Foxp3+ DP thymocytes were shown to express an activated phenotype that is reminiscent of that found in peripheral activated Tregs but is associated with the expression of a functional IL-7 receptor, which may protect them from cell death/negative selection. A subpopulation of Foxp3+ DP expressing CD103 is likely to give rise to a population of Foxp3 CD8 T cells with preferential homing to the mucosa. Finally, multiple regression models support that a significant commitment to the Treg lineage occurs at the DP stage, with possible implications for Treg repertoire and function. Human studies, Thymus, T cell development, Regulatory T cell, Foxp3.O trabalho foi co-financiado pelo POCI 2010 e o FSE. Bolsa de Doutoramento da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (Referência: POCTI/SFRH/BD/12617/2003