MAANTIEKULJETUSTEN TURVALLISUUDEN PARANTAMINEN

vaikuttavia eri tekijöitä. Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, millä eri tavoin maantiekuljetuksia on kehitetty ja tullaan kehittämään turvallisemmiksi Suomen maanteillä. Aihealueina työssä otetaan esiin Suomen liikenneympäristö, koulutus, lainsäädäntö, sekä ajoneuvotekniikka ja sen tuomat mahdollisuudet. Maantieliikenteen turvallisuudesta on tehty lukuisia eri tutkimuksia ja tilastoja on saa-tavilla hyvin, joten tutkimusmenetelmä perustuu aineistoanalyysiin ja aineistosta koot-tuihin tärkeimpiin liikenneturvan asioihin. Lähtökohtaisesti tutkimus perustuu ammat-tiliikenteen tarpeisiin ja vaatimuksiin raskas liikenne huomioon ottaen. Usein onnettomuudet tapahtuvat huonon sään, jonkun osapuolen huolimattomuuden, liian suuren tilannenopeuden tai ajoneuvotekniikkaan liittyvän ongelman johdosta. Liikenneturvan eteen tehdään jatkuvasti päättymätöntä työtä, autoilijoita koulutetaan, ajoneuvotekniikka kehittyy ja ajoneuvojen turvallisuutta parannetaan. Myös tieverk-koja yritetään pitää kunnossa, oli keli tai vuodenaika sitten mikä tahansa. Silti onnet-tomuuksia tapahtuu ja tulee tapahtumaan nyt ja tulevaisuudessa, mutta niiden määrään on pystytty viime vuosikymmenenä vaikuttamaan, ja liikennekuolemiin johtavat on-nettomuudet ovat tilastollisesti vähenemään päin. Työn lopussa otetaan esimerkkinä Suomen vakavimpana liikenneonnettomuutena tun-nettu Konginkankaan onnettomuus ja käsitellään syitä, miksi onnettomuus tapahtui ja mitä muutosehdotuksia liikenneturvallisuuteen tästä on seurannut. Onnettomuuden jäl-jiltä tärkeimpinä asioina nostettiin esiin ajoneuvon nopeus, raskaan liikenteen enna-koivan ajon koulutus, työnjohdon vastuu mahdollisesta rikkomuksesta tai seuraamuk-sesta sekä ajo- ja lepoaikarikkeistä.The purpose of this thesis was to investigate the safety of road transport and the range of factors related to road safety. The purpose of this study was to examine various ways in which road transport has been developed and will develop toward a safer direction in Finnish roads. In this thesis traffic environment, education, legislation and vehicle technology were examined. Numerous studies have been conducted on road safety issues and statistics are avail-able as well, so the research methodology is based on an analysis of the previously written materials. Research was based on the needs of commercial transport and the demands of heavy traffic. Often, accidents occur due to negligence of another party, because of bad weather, too high situational speed of the vehicle or due to technical issues. Traffic safety is an ongoing task, drivers are trained, vehicle technology is advancing and car safety is improved. Also road networks are tried to be kept in shape, whatever the weather or season. The number of accidents has decreased and fatal accidents have been reduced. At the end of this thesis there is an example of the most serious road accident of Finland and the list of new security proposals, and what changes have followed on road safety. Most important issues were vehicle speed, heavy traffic proactive training and management responsibility for a possible violation or penalty as well both for driving and for rest period violations

A Susceptible, Infected, Recovered Chagas Disease Model with Multiple Households Analyzed in Parallel

Chagas Disease impacts millions of people in South and Central America and yet it remains a mostly unheard of disease outside its area of influence. The Center of Disease Control refers to Chagas Disease as one of the primary “neglected” diseases of the world (CDC, 2013). This parasitic disease is spread primarily through the feces of blood sucking insects of the Triatominae subfamily, also known as “kissing bugs”. When the insect drops its feces, a vertebrate host can transfer the parasite, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), into the bloodstream, i.e. via the eyes, mouth, or open wounds, and become infected. In this honors thesis, a susceptible, infected and removed/resistant (SIR) model of disease transmission at the household level was developed. The model is replicated and parameterized with geospatial survey data for all households within a town. In addition, a logistic regression analysis was performed on all the household survey data collected in Guayabo and Chiquimula, Guatemala to identify parameters of importance (p\u3c0.10) to infested houses (i.e. the presence of insects collected in a household and the presence of insect evidence within a household). Eventually the individual household models will be linked for the purpose of modeling the disease transmission between houses at the town scale. The latter will enable better insect and disease control mitigation strategies

Eggs and chicken embryos as potential sentinels for flock and hatchery health

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias, especialidade Sanidade AnimalSuccessful hatching of strong, healthy chicks with a potential for good productive and reproductive performance depends on the assurance of as normal and ideal as possible embryonic development. The latter, however, can be negatively affected by a series of factors intrinsic to either the egg, its handling, or the incubator. This project aimed at collecting and interpreting essential and extensive information regarding embryonal response to physical challenges (temperature, relative humidity and carbon dioxide concentration) in the incubation environment, to infectious challenge with vertically transmitted Salmonella serovars Enteritidis and Typhimurium and, ultimately, to apply the knowledge obtained to a field survey of a commercial hatchery. For this purpose, eggs were incubated under different, controlled environments or after infection with a vertically transmitted pathogen, and an extensive list of parameters used to monitor subsequent changes in embryonic behavior, metabolism, growth and viability. The information gathered was then applied to a sample of non-viable eggs incubated at a major hatchery. Overall, the effects of manipulating temperature were more prominent than those of manipulating humidity and carbon dioxide. The most significantly affected parameters pertained to embryo metabolism, embryo weight, mortality and malformation rates. Changes in the development of the lymphoid follicles in the bursa of Fabricius and of the glandular epithelium of the gizzard were also found. Vertical infection with Salmonella was associated with higher embryonic mortality rates. No changes in performance or growth were observed in infected but viable embryos. The results obtained during the field survey did not directly correlate to the variables studied. However, the issues detected allowed for the designation of critical control points and opportunities for performance improvement that could have otherwise gone undetected at the hatchery and at the breeder farm, highlighting the importance of embryodiagnosis in the monitoring of hatchery and flock health.A operação eficiente e lucrativa de uma exploração industrial produtora de espécies aviárias (Gallus gallus) depende, entre outras coisas, do acesso a pintos saudáveis e com bom potencial produtivo, obtidos por incubação artificial de ovos de um bando reprodutor. É com a incubação destes ovos, levada a cabo em grande escala por máquinas altamente especializadas, que se inicia o desenvolvimento das aves, tendo esta influência directa sobre a viabilidade e futura performance do pinto eclodido. Vários factores podem intervir negativamente no sucesso da incubação, estando estes relacionados com o ovo em si, com o seu manuseamento ou com a própria incubadora. Por essa razão, este trabalho teve por objectivo adquirir, coligir e interpretar informação essencial sobre a resposta embrionária a alterações físicas do ambiente de incubação (temperatura, humidade relativa (RH) e concentração de dióxido de carbono), assim como à infecção com agentes patogénicos com transmissão vertical conhecida (Salmonella enterica vars. Enteritidis e Typhimurium). Estes ensaios foram conduzidos em laboratório, em ambiente cuidadosamente controlado. Numa segunda fase, o conhecimento obtido através de experimentação laboratorial foi aplicado na análise de uma amostra de ovos incubados provenientes de um centro de incubação industrial, com o objectivo de verificar a compatibilidade dos dados experimentais com os dados obtidos em situação real. Com vista a estudar a influência de alterações no ambiente de incubação sobre o desenvolvimento embrionário, procedeu-se à incubação de 2300 ovos specificpathogen free, dividos em dez grupos diferentes. O primeiro grupo foi incubado sob condições controlo (temperatura - 37.8ºC; RH - 50-55% durante os primeiros 18 dias de incubação e 60-65% durante os últimos 3 dias) e os restantes cinco grupos incubados sob: A) temperatura elevada constante (38.9ºC) e RH padrão; B) temperatura inferior constante (36.7ºC) e RH padrão; C) temperatura e RH padrão com um período (3 h) de elevação da temperatura (38.9ºC) aos dias 3 e 18 de incubação; D) temperatura e RH padrão com um período (3 h) de redução da temperatura (36.7ºC) aos dias 3 e 18 de incubação; E) humidade relativa elevada constante (63%) e temperatura padrão; F) humidade relativa inferior constante (43%) e temperatura padrão; G) humidade relativa e temperatura padrão com um período (3 h) de elevação da RH (63%) aos dias 3 e 18 de incubação; H) temperatura padrão com um período (3 h) de redução da RH (43%) aos dias 3 e 18 de incubação; I) ausência de renovação de ar/concentração de CO2 elevada constante durante incubação sob temperatura e RH padrão. Para investigar a influência da infecção com microrganismos transmitidos verticalmente, foram utilizados 576 ovos specific-pathogen free, divididos por oito grupos, quatro grupos controlo e quatro grupos inoculados. O primeiro grupo tratado foi inoculado com 105 CFU/ml de uma cultura de referência de S. enterica var. Enteritidis (CECT-4300) em NaCl (0,9%) estéril. O segundo grupo foi inoculado com 102 CFU/ml (dose de inoculação semelhante à concentração destas bactérias previamente reportada em ovos naturalmente infetados) da mesma cultura de referência. O terceiro grupo foi inoculado com 105 CFU/ml de uma cultura de referência de S. enterica var. Typhimurium (CECT-443) em NaCl (0,9%) estéril. Finalmente, o quarto grupo foi inoculado com 102 CFU/ml da mesma cultura de referência. Cada grupo tratado foi incubado juntamente com um grupo controlo inoculado com NaCl (0.9%) estéril. A presença ou ausência de Salmonella em cada grupo foi confirmada através de PCR multiplex convencional. Em todos os ensaios, foi retirada uma amostra de ovos da incubadora a cada 48 horas de incubação para análise dos efeitos das diferentes manipulações sobre o desenvolvimento embrionário. Uma extensa lista de parâmetros relacionados com o comportamento, metabolismo, crescimento e viabilidade dos embriões foi depois analisada. Em relação ao estudo de campo, foi efetuada análise morfológica, histológica e microbiológica de uma amostra de 51 ovos não viáveis, obtidos após 21 dias de incubação, num centro de incubação industrial. Relativamente aos ensaios de manipulação do ambiente físico de incubação, os resultados obtidos permitiram concluir que as alterações de temperatura, em qualquer direção, exerceram efeitos mais marcados sobre o desenvolvimento embrionário do que as alterações na humidade relativa ou na concentração de CO2 no interior da incubadora, enquanto que estas duas últimas variáveis produzem efeitos na sua maior parte sobreponíveis. Dos parâmetros monitorizados, aqueles que mais consistentemente apresentaram alterações encontravam-se relacionados com o comportamento e metabolismo embrionários, nomeadamente com a diminuição do metabolismo embrionário como consequência do stress induzido pela manipulação. O crescimento embrionário, representado pelo peso do embrião e por parâmetros alométricos, foi igualmente afetado, tendo-se verificado que as alterações de temperatura resultaram em embriões mais leves, enquanto as alterações de humidade relativa e CO2 produziram embriões de tamanho semelhante mas peso superior aos dos restantes tratamentos. À análise histológica, os embriões sujeitos a alterações contínuas de temperatura apresentaram ainda atraso na formação do tecido linfoide da bolsa de Fabricius e alterações celulares com distorção da arquitetura do epitélio glandular da moela, estas últimas em embriões sujeitos a aumentos de temperatura). Os embriões sujeitos a modificações da humidade relativa produziram efeitos temporários sobre o desenvolvimento do tecido hepático. As lesões microscópicas encontradas em animais mortos durante a incubação não permitiram o diagnóstico fiável da(s) causa(s) imediata de morte. Nenhum dos tratamentos produziu elevação significativa dos níveis de mortalidade, à exceção da incubação sob temperaturas inferiores ao normal. Dos restantes tratamentos, a elevação da humidade relativa resultou num aumento da mortalidade no final do período de incubação. Ainda relativamente à viabilidade embrionária, verificou-se que apenas as manipulações da temperatura de incubação resultaram num aumento significativo na incidência de malformações espontâneas. Finalmente, é de notar que, para todas as variáveis estudadas, a alteração contínua de uma variável produziu efeitos mais pronunciados e duradouros, enquanto a alteração pontual e temporária de uma variável produziu efeitos mais limitados, tanto em amplitude como em duração. Ao contrário dos ensaios de manipulação do ambiente de incubação, a inoculação de ovos specific-pathogen free não incubados com serovars de Salmonella enterica e sua posterior incubação não produziu alterações significativas no comportamento, metabolismo ou desenvolvimento embrionários. A inoculação de S. Enteridis, tanto em inóculo alto como em inóculo baixo, resultou num aumento significativo da taxa de mortalidade, sendo que esta se encontrou limitada aos primeiros 7 dias de incubação. A inoculação com qualquer dos inóculos de S. Typhimurium produziu, igualmente, níveis de mortalidade superiores comparados com os controlos, limitados aos primeiros dias de incubação, mas inferiores aos produzidos por S. Enteritidis. As lesões microscópicas observadas em animais encontrados mortos não permitiram o diagnóstico fiável da(s) causa(s) imediata de morte, sendo que a única diferença significativa encontrada se restringiu a alteração da afinidade tintoral dos tecidos provenientes de embriões infetados, indicativa de decomposição mais acelerada provavelmente devido a maior proliferação bacteriana. Contudo, nenhum dos embriões viáveis inoculados apresentou qualquer alteração macroscópica ou histológica significativa e em nenhum destes animais se observaram agregados bacterianos à análise microscópica, apesar da presença de infeção confirmada por métodos de biologia molecular. Os resultados obtidos sugeriram, ainda, que ambos os serovars de Salmonella utilizados apresentam tropismo para o embrião, possuindo a capacidade de não só sobreviver dentro do ovo, mas também de atravessar compartimentos orgânicos em direção ao embrião. Estas observações evidenciam algumas das razões para a eficiência demonstrada por estes serovars (e particularmente S. Enteritidis) na transmissão vertical e estabelecimento de portadores assintomáticos. Em relação ao estudo de campo, a análise dos ovos não viáveis não evidenciou diminuição de performance ou viabilidade embrionária devido a qualquer das variáveis estudadas em laboratório. Contudo, o exame externo, macroscópico dos ovos, assim como a sua análise microbiológica evidenciaram problemas na seleção e calibração dos ovos para incubação, assim como na possível higiene e práticas de recolha dos ovos na exploração de reprodutores, sinalizando potenciais pontos de intervenção futura com vista ao melhoramento da performance de incubação que de outra forma não seriam detetados. Finalmente, este trabalho permitiu a aquisição de informação essencial para a compreensão da resposta embrionária aos desafios da incubação, permitindo ainda confirmar a importância do embriodiagnóstico na monitorização da saúde da incubadora e do bando

Investigating cell fate decisions of the intestinal stem cell

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Biologia do Desenvolvimento), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2011The development of multicellular organisms, as well as the maintenance of adult tissue homeostasis, requires the production of new cell types that will build up the new organism and maintain it throughout its entire life. Cell proliferation, differentiation and cell death have to be carefully orchestrated during development, requiring cell-cell communication. This is carried out by a small number of cell signaling pathways that are reiteratively employed both during development and during tissue homeostasis in adults. One of these pathways, which plays many critical roles, both during development and in adult stem cells, is the Notch signaling pathway. During my PhD, I become interested in understanding how different cell types can be specified during development, and how do cells ensure that this occurs properly. During the first part of my thesis, I investigated one mechanism of cell type specification – asymmetric cell division. During the second part of my PhD, I studied the maintenance of tissue homeostasis by the adult stem cells of the Drosophila ntestine. During development, multipotent cells divide and give rise to cells with more restricted fates, in the process of building differentiated adult tissues. One mechanism employed to specify different cell fates is asymmetric cell division: during mitosis, cell fate determinants are asymmetrically localized to one of the future daughter cells, and will determine the fate of that daughter cell (Knoblich, 2001). A good example of this occurs during the development of the sensory organs in Drosophila, where precursor cells, the sensory organ precursors (SOPs), divide asymmetrically to produce two distinct cells, a pIIa cell and a pIIb cell. These will again divide asymmetrically to give rise to the four different cell types of the sensory organs. In this process, the Par6-aPKC complex localizes at the posterior cortex of the SOPs and promotes the actin-dependent localization of the cell fate determinants Numb, Partner of Numb (Pon) and Neuralized to the opposite anterior pole. Both Numb and Neuralized regulate Notch signaling, promoting its activation only in the posterior cell, which will become the pIIa cell (Bardin et al., 2004). The plasma membrane lipid phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate (PIP2) regulates the plasma vi membrane localization and activity of various proteins, including several actin regulators, thereby modulating actin-based processes (Di Paolo and De Camilli, 2006). I examined the distribution of PIP2 and of the PIP2-producing kinase Skittles (Sktl) in mitotic SOPs, and found that both Sktl and PIP2 reporters were uniformly distributed in dividing SOPs. However, in the course of this study, I unexpectedly observed that overexpression of full-length Pon or its localization domain (LD) fused to the Red Fluorescent Protein (RFP:PonLD) resulted in asymmetric distribution of Sktl and PIP2 reporters in dividing SOPs. This finding that Pon overexpression alters polar protein distribution is important because RFP::PonLD is often used as a polarity marker of dividing progenitors (Perdigoto et al., 2008). However, since Sktl and PIP2 do not play any detectable role in the asymmetric localization of the cell fate determinants, I decided to not further pursue this project. The second part of my PhD focused on how adult stem cells maintain tissue homeostasis. The maintenance of adult tissue homeostasis during the whole life span of the organism (which in some vertebrates can be more 200 years) requires that stem cells divide to replace the differentiated cell types of the organ, as well as to maintain the stem cell pool. In order to do so, adult stem cells utilize many of the same signaling pathways that are employed during embryonic development to regulate cell growth, proliferation, differentiation, death and morphogenesis. The adult Drosophila Intestinal Stem Cells (ISC) divide throughout the lifetime of the adult fly to replenish gut tissue by producing two differentiated cell types. The ISC division is thought to be asymmetric concerning the fate of the two daughter cells: one remains an ISC and the other becomes a progenitor cell, termed the enteroblast (EB). The ISC is the only dividing cell in the adult gut, and the EBs go on to differentiate directly, either into an enterocyte or an enteroendocrine cell. Enterocytes are polyploid absorptive epithelial cells, while the enteroendocrine cells are diploid cells that express peptide hormones. Lineage labeling analysis demonstrated that ISCs are multipotent stem cells (Micchelli and Perrimon, 2006; Ohlstein and Spradling, 2006) and Notch signaling has been shown to play a role in regulating cell fate decision of the ISC lineage. The Notch ligand Delta is expressed in the ISCs and Notch signaling is activated in the EB to promote EB, enteroendocrine and vii enterocyte fates (Micchelli and Perrimon, 2006; Ohlstein and Spradling, 2006; Ohlstein and Spradling, 2007). In my work, I have shown that the transcriptional repression of Notch target genes is required to maintain the ISC identity (Bardin et al., 2010). However, how Notch signaling is modulated to control the acquisition of the EB fate and two distinct differentiated cell fates is not understood. It has been proposed that the specification of the differentiated fates could be related to the level of Notch signaling (Ohlstein and Spradling, 2007), a mechanism that has also been proposed to be employed by other stem cell lineages (Mazzone et al., 2010). Given the role of Notch signaling in many stem cell fate decisions, it is important to understand how it can promote alternative fates in a single precursor cell. To answer this question and to identify novel regulators of the cell fate decisions in the ISC lineage, we carried out a chemical mutagenesis screen in Drosophila. During this screen, random mutations were induced and mitotic clones, in the F2 generation, were screened for mutants in which intestinal cell type specification was affected. Several complementation groups with defects in cell type specification were identified, which can be divided into three groups: mutants in which the stem cell is lost, mutants with overproduction of enteroendocrine like cells and mutants with excess of stem cell-like cells. I characterized briefly and mapped some of these mutations. I further investigated the role of one of the genes identified in this screen. One complementation group was found to specifically affect the self-renewing of ISCs without affecting the production of differentiated cells. I mapped this complementation group to the Gmd (GDP-mannose 4,6-dehydratase) gene. Clones of Gmd mutant cells have an overproduction of Delta positive, proliferative, multipotent stem cell-like cells in the intestine. However, unlike the loss of Notch signaling, loss of Gmd does not affect differentiation, as shown by the finding that enterocytes and enteroendocrine cells are normally specified in Gmd mutant clones. This suggests that in Gmd mutants ISCs, the ISC can divide asymmetrically, in relation to the fate of the daughter cells, to self-renew and produce EBs, or symmetrically to give rise to two ISCs. Gmd is required for the production of fucose and has been shown to be required for the O-fucosyltransferase 1 (Ofut1)-dependent fucosylation of the Notch viii receptor (Okajima and Irvine, 2002; Okajima et al., 2003; Sasamura et al., 2003). It is thought that O-fucosylated Notch protein serves only as a subsequent substrate for further glycosylation by the glycosyltransferase Fringe (Fng), since the loss of fucosylation results in defects only in developmental contexts that require Fngdependent modification of Notch (Okajima et al., 2008; Okajima et al., 2005). Interestingly, I found that Gmd plays a fringe-independent, but Ofut1-dependent, role to limit symmetric ISC divisions. Furthermore, the Gmd phenotype can be suppressed by the expression of active nuclear Notch. In addition, I found that Notch signaling could still be activated in Gmd mutant clones, but that precise asymmetric fate decisions in the daughter cells do not occur. Studies in mammalian cells found that O-fucosylated Notch receptor is more strongly activated by its ligands (Chen et al., 2001; Moloney et al., 2000; Stahl et al., 2008). My data are consistent with Gmd being required for high levels of Notch activation in the ISC lineage, which is necessary to limit symmetric division of the ISC. To test how the levels of Notch signaling affect the ISC lineage, I analyzed the temperature-dependent effect of rumi mutations in the intestine. Rumi is a component of the Notch signaling pathway but the requirement for Rumi is temperature-dependent: at 18ºC rumi mutants have a very mild loss of Notch signaling phenotype while at 28ºC they have a stronger phenotype (Acar et al., 2008). I found that rumi mutant clones in the intestine are wild-type at 18ºC but have a stronger phenotype at 28ºC. At 21ºC and 22ºC, rumi mutant clones have an overabundance of ISCs but differentiation is essentially unaffected, similar to Gmd mutants. This data support a model in which different cell fate decisions require different levels of Notch signaling: while the asymmetric decision between ISC and EB requires high levels of Notch signaling, further differentiation of the EB into enterocyte or enteroendocrine cells can occur with lower levels of Notch activity. Such requirement of high levels of Notch signaling for daughter cell commitment, that is, exit from self-renewal, could be a mechanism to prevent loss of the ISC. I propose that this could be a general mechanism utilized by stem cells to ensure their maintenance, in which high threshold signaling prevents noisy, low levels of signaling that could lead to the loss of the stem cell.A produção de diferentes tipos celulares é um processo fulcral para o organismo, quer durante o seu desenvolvimento, quer na regulação da homeostase adulta, para a qual contribuem os processos de renovação celular. A coordenação de diferentes eventos celulares, tais como a proliferação, diferenciação e morte celular, envolve sofisticados processos de comunicação celular. Para este efeito, existem diferentes vias de sinalização inter-celular que são utilizadas, primeiro durante o desenvolvimento, para orquestrar a embriogénese, e posteriormente no adulto, para manter os diferentes tecidos. A via de sinalização ‘Notch’ é uma das principais vias de sinalização celular, sendo essencial tanto durante o desenvolvimento como para a regulação de vários tipos de células estaminais. O principal objectivo da minha actividade científica tem sido investigar a origem dos diferentes tipos celulares e os mecanismos que asseguram a sua correcta especificação num tecido em homeostase. Numa fase inicial, estudei a divisão celular assimétrica, um dos mecanismos utilizados para gerar diferentes tipos celulares. Na segunda e principal parte dos meus estudos doutorais, investiguei a manutenção do epitélio intestinal em Drosophila melanogaster por células estaminais intestinais. Durante o desenvolvimento dos metazoários, células progenitoras com potencial para gerar diferentes tipos celulares dão origem a células com potencial mais restrito que, eventualmente, estarão na origem dos diferentes tipos de células diferenciadas constituintes dos vários tecidos do organismo adulto. A divisão celular assimétrica é um dos mecanismos utilizados para gerar diferentes tipos celulares. Quando uma célula se divide assimetricamente, ocorre uma distribuição assimétrica de factores citoplasmáticos durante a mitose, que são herdados diferencialmente pelas células filhas e determinam a identidade dessas células (Knoblich, 2001). A divisão da célula precursora dos órgãos sensoriais (SOPs) em Drosophila é um exemplo de divisão celular assimétrica. A célula SOP divide-se assimetricamente produzindo uma célula pIIa e uma pIIb, que se dividem também assimetricamente, originando os quatro tipos de células dos órgãos sensoriais. Durante a mitose, o x complexo Par6-aPKC, um complexo de proteínas que participa em processos de polarização celular, localiza-se no pólo posterior da célula SOP e promove a localização, através dos microfilamentos de actina, dos determinantes Numb, Partner of Numb (Pon) e Neuralized no pólo oposto da célula. As proteínas Numb e Neuralized são reguladoras da via de sinalização Notch, promovendo a activação assimétrica do receptor Notch na célula posterior, que adopta a identidade de pIIa (Bardin et al., 2004). O fosfolípido fosfatidilinositol (4,5) -bifosfato (PIP2) é um componente do folheto interno da membrana plasmática que regula a localização e actividade de várias proteínas, incluindo reguladores dos microfilamentos de actina (Di Paolo and De Camilli, 2006). Para testar o papel do PIP2 na divisão assimétrica das células SOP, determinou-se a localização do PIP2 e da proteína Skittles (Sktl), a cinase que produz PIP2. Observei que tanto Sktl como repórteres de PIP2 se localizam simetricamente no córtex de células SOP em mitose. No entanto, observei também que a expressão da proteína Pon ou do seu domínio de localização (LD) ligado com uma proteína fluorescente (RFP::PonLD) resultam na localização assimétrica dos repórteres de PIP2 e de Sktl no pólo posterior da célula SOP em divisão. Como o RFP::PonLD é um repórter de divisão assimétrica frequentemente utilizado, o seu efeito na localização da cinase que produz PIP2 e do PIP2 é relevante (Perdigoto et al., 2008). No entanto, como o PIP2 não parece estar implicado na localização assimétrica de determinantes durante a divisão celular, o projecto foi concluído com a publicação destes resultados. Durante a segunda e principal parte dos meus estudos doutorais, interessei-me pela problemática da manutenção da homeostase por células estaminais adultas. A manutenção dos diferentes orgãos ocorre continuamente durante toda a vida do organismo que, em certos animais, pode ultrapassar os 200 anos. Durante esse tempo, as células estaminais têm que renovar os diferentes tipos celulares e, simultaneamente, manter a sua própria população. Para tal, as células estaminais adultas utilizam as mesmas vias de sinalização celular que são utilizadas durante o desenvolvimento embrionário para comunicar entre si e regular a proliferação, diferenciação e morte celular. As células estaminais intestinais (ISCs) presentes no intestino de Drosophila proliferam durante toda a vida adulta, produzindo os dois xi tipos celulares diferenciados que constituem este epitélio. As ISCs são as únicas células a proliferar no intestino e têm uma linhagem muito simples: uma das células filhas permanece como ISC enquanto.que a outra célula filha, denominada enteroblasto (EB), se diferencia. O EB adopta um de dois tipos celulares, convertendo-se quer numa célula enteroendócrina, produzindo hormonas peptídicas, quer numa célula epitelial absortiva, designada de enterócito. As ISCs exprimem Delta, um ligando da via Notch, e foram recentemente identificadas como células estaminais proliferativas e multipotentes (Micchelli and Perrimon, 2006; Ohlstein and Spradling, 2006). A via Notch tem um papel essencial na regulação dos diferentes tipos celulares no intestino, na medida em que esta via é activada no EB e promove a diferenciação desta célula, regulando também a sua diferenciação numa célula enteroendócrina ou num enterócito (Micchelli and Perrimon, 2006; Ohlstein and Spradling, 2006; Ohlstein and Spradling, 2007). A repressão da transcrição de genes alvo da via Notch é essencial para a manutenção da célula estaminal (Bardin et al., 2010). No entanto, ainda não foi determinado como é que a via Notch regula estas três decisões. Foi proposto que o EB poderá receber diferentes níveis de sinalização Notch, determinando assim qual dos tipos celulares será produzido (Ohlstein and Spradling, 2007). Um mecanismo semelhante foi proposto para a regulação da diferenciação na glândula mamária (Mazzone et al., 2010). Para identificar novos reguladores do desenvolvimento das células ISC, decidimos fazer um ‘crivo’ genético através da indução de mutações aleatórias no genoma de Drosophila, analisando posteriormente o fenótipo no intestino de moscas adultas. O objectivo deste trabalho foi a identificação de genes que resultam em proliferação ou diferenciação alteradas das células ISC. Neste ‘crivo’ genético identificámos três tipos diferentes de mutantes: mutantes com hiperproliferação de células estaminais, mutantes com hiperproliferação de células enteroendócrinas e mutantes com número reduzido de células estaminais. Após breve caracterização e mapeamento genético de alguns destes mutantes, concentrei-me no estudo da função dum destes genes na regulação da produção de células ISC. Num dos grupos de complementação de mutantes identificado, foi observada uma expansão da população de células ISC sem que a sua diferenciação parecesse xii afectada. Os mutantes deste grupo de complementação foram mapeados e foram identificadas mutações no gene Gmd (codificando a enzima GDP-manose 4,6-desidratase). Os mutantes Gmd tem um excesso de células proliferativas multipotentes que expressam o marcador Delta. No entanto, e ao contrário do que foi observado nos mutantes da via Notch (que também revelam excesso de células ISC), as células diferenciadas são normalmente especificadas nos mutantes Gmd. Em contraste com o que se verifica em animais controlo, onde as células ISC normais se dividem sempre assimetricamente em relação ao destino das células filhas, as células ISC de animais mutantes Gmd podem dividir-se quer.assimetricamente, originando uma ISC e um EB, quer simetricamente, produzindo duas células ISC idênticas. A enzima Gmd é essencial à produção de fucose nas células, sendo necessária para a fucosilação do receptor Notch pela enzima Ofut1 [Ofucosyltransferase 1 (Okajima and Irvine, 2002; Okajima et al., 2003; Sasamura et al., 2003)]. A proteína Notch fucosilada pode ser subsequentemente glicosilada por outra glicosiltransferase, conhecida por Fringe [Fng (Okajima et al., 2003)]. Esta modificação de Notch por Fng é necessária em certos contextos celulares e modifica a afinidade de Notch para os seu ligandos; o único contexto descrito em que fucosilação de Notch é indispensável é como substrato para a subsequente glicosilação do recepor pelo Fng (Okajima et al., 2008; Okajima et al., 2005). No entanto, observei que a mutação do gene fng no intestino não afecta as células ISC, enquanto que mutações em Ofut1 resultam no mesmo fenótipo que a perda de função de Gmd. Experiências em células de mamíferos sugerem que o receptor Notch fucosilado pode ser mais eficazmente activado pelos ligandos (Chen et al., 2001; Moloney et al., 2000; Stahl et al., 2008). Isto levou-nos a propor que a intensidade do sinal Notch depende da fucosilação do receptor e que a decisão que as células filhas de uma célula ISC têm que tomar, entre permanecer como ISC ou iniciar a diferenciação, requer uma actividade elevada da via Notch. Pelo contrário, a decisão sobre o destino das células diferenciadas pode ocorrer com uma actividade mais reduzida da via Notch. xiii . A apoiar desta hipótese, verifica-se que a modulação da actividade Notch em mutantes termosensíveis rumi [codificando para um componente da via Notch (Acar et al., 2008)], revelam hiperproliferação de células ISC sem afectar a decisão do tipo de diferenciação. Estes resultados levam-me a propor um modelo em que uma actividade elevada da via Notch é necessária para implementar a decisão de diferenciação das células ISC. Esta necessidade de uma actividade elevada da via Notch poderá constituir um potencial mecanismo para proteger a célula estaminal. Assim, será interessante verificar se outros tipos de células estaminais também requerem uma sinalização Notch elevada, antes de se comprometerem com vias de diferenciação. Concluindo, este estudo põe em evidência um potencial mecanismo de protecção de uma população de células estaminais, em que a diferenciação só pode ocorrer com níveis elevados de comunicação celular mediada pela via Notch ou por outra via de comunicação celular. Este mecanismo confere assim robustez à população de células estaminais, limitando a vulnerabilidade destas células a sinais de diferenciação inespecíficos e que põe em risco a manutenção, a longo prazo, da homeostase dos tecidos e a viabilidade do organismo.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH / BD / 22135 / 2005; Association Pasteur-Weizmann

Chitin nanocrystals-alginate bioinks for bioprinting of 3D structures

Bioprinting is a 3D printing technology to deposit layer-by-layer stacking patterns of biomaterials with incorporated viable cells, enabling the production of cells, tissues or organs. Biocompatibility, biodegradability, good cross-linking mechanisms, good rheological and printability are the most important features of a bioink which are typically achieved with polymer hydrogels. Alginate hydrogels have been found much use in bioprinting applications because they are so easily cross-linked, low cost, abundantly available, and have shown good biocompatibility. However, their gel precursor solutions generally present low viscosity and Newtonian flow behavior at low shear-rates (zero shear viscosity), which can lead to deformation of printed constructs after deposition from the needle in the extrusion printing process. These mechanical problems can be overcome adding viscosity modifiers such as nanocellulose and chitin, that will enhance the viscosity of the precursor solutions and will give them a yield point at low shear rates rather than a zero. The main goal of this dissertation is the production and characterization of hydrogels composed by alginate and nanocellulose or chitin nanowhiskers and evaluate its 3D printability as bioinks. Nanocellulose was successfully obtained from acid hydrolysis and was prepared as a aqueous solution with a concentration of 1.9 % wt.. Additionally, chitin nanowhiskers were also successfully obtained from acid hydrolysis and two aqueous solutions were prepared at 1.9 % wt. and 2.7 % wt.. The aqueous solutions were posteriorly mixed with alginate at different proportions in order to study the cross-linking mechanism of the bioinks. 3D structures were printed using “hand-draw” 3D printing and 3D printing techniques resorting the bioinks and cross-linking solutions. This work shows the progress of the printing conditions until successfully printed structures were obtained, using hydrogels and natural resources like cellulose and chiti

Modeling the water consumption of Singapore using system dynamics

Thesis (S.M.)--Massachusetts Institute of Technology, Dept. of Architecture, 2011.Cataloged from PDF version of thesis.Includes bibliographical references (p. 217-226).Water resources are essential to life, and in urban areas, the high demand density and finite local resources often engender conditions of relative water scarcity. To overcome this scarcity, governments intensify infrastructure and project demand into the future. Growth in the economy, population, and affluence of cities increase water demand, and water demand for many cities will increase into the future, requiring additional investments in water infrastructure. More sustainable policies for water will require capping socioeconomic water demand and reducing the associated demand for non-renewable energy and material resources. The thesis consists of the formulation of a System Dynamics model to replicate historic trends in water consumption for the growing city of Singapore. The goal of the model is to provide a platform for assessing socioeconomic demand trends relative to current water resources and water management policies and for examining how changes in climate and infrastructure costs might impact water availability over time. The model was calibrated to historical behavior and scenarios examined the vulnerability of supply to changing demand, climate, and cost. The outcome is a qualitative dynamic assessment of the circumstances under which Singapore's current policies allow them to meet their goals. Singapore was chosen as the case study to demonstrate the methodology, but in the future, the model will be applied to other cities to develop a typology of cities relative to water resources.by Karen Noiva Welling.S.M

Influence of temperature and humidity manipulation on chicken embryonic development

BACKGROUND: Temperature and relative humidity (RH) are very important factors affecting embryo development, hatchability, and posthatch performance. This study aimed at characterizing embryonic metabolic and behavioural response to a harsh incubation environment generated by manipulations (elevations and drops) in these two key factors. This study was aimed at establishing patterns of metabolic and behavioural response, as well as mortality and the development of malformations, all of which can potentially be used in monitoring incubating operations and diagnosing problems with faulty equipment. RESULTS: Of all the parameters monitored throughout embryonic development the ones shown to be most affected were: albumen-weight to egg-weight ratio (AR); yolk-weight to egg-weight ratio (YR); embryo-weight to egg-weight ratio (ER); heart rate (HR); voluntary movements per minute (VMM); mortality rates; malformation prevalence and type. The most significant changes in the evolution of AR and YR throughout incubation involved delay and reduction in the amplitude of the expected drop in albumen and yolk levels, reflecting lower nutrient consumption by the embryo. ER tended to grow more slowly and remain lower than the established normal, especially in embryos challenged with temperature treatments. HR and VMM were considered to be strong indicators of embryonic stress, as all treatments applied resulted in elevated heart rate and decreased embryo movement. Mortality rates for both temperature-related treatments were higher during the first four days of incubation. Changes in relative humidity have produced less radical effects on mortality. Malformation rates were higher for embryos subjected to high incubation temperatures and were most prominently related to the abdominal wall, head, skull and limbs. Overall, manipulations in environmental (incubator) temperature during incubation produced more drastic changes in embryo development than humidity-related manipulations, especially where mortality and malformation rates were concerned. CONCLUSIONS: This paper describes changes in embryonic metabolism and behaviour, as well as in mortality and malformation rates, in response to manipulations in environmental temperature and relative humidity. Together with further studies, these patterns may prove helpful in the diagnosis of equipment malfunctions relating to temperature or relative humidity

Caracterização de estruturas tectónicas activas da Região Sul de Portugal com recurso a ferramentas SIG : o caso da falha de São Marcos-Quarteira

Com este trabalho pretende-se avaliar o desempenho dos metodos de interpolação presentes nos softwares de Sistemas de Informação Geográfica para a produção de modelos superfície. São efectuadas varias simulações com diversos interpoladores, com dados geográficos da região emersa e imersa do sudeste Algarvio onde se localiza uma estrutura tectónica regional importante, a falha São Marcos-Quarteira. A partir de dados provenientes de levantamentos de sísmica de reflexão multicanal e monocanal de média resolução e efectuada uma interpretação sismostratigráfica dos perfis adquiridos. Com o método de interpolação mais eficiente produzem-se modelos de superfície que conduzem à interpretação da actividade neotectónica da falha São Marcos-Quarteira