Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Biologia do Desenvolvimento), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2011The development of multicellular organisms, as well as the maintenance of adult tissue homeostasis, requires the production of new cell types that will build up the new organism and maintain it throughout its entire life. Cell proliferation, differentiation and cell death have to be carefully orchestrated during development, requiring cell-cell communication. This is carried out by a small number of cell signaling pathways that are reiteratively employed both during development and during tissue homeostasis in adults. One of these pathways, which plays many critical roles, both during development and in adult stem cells, is the Notch signaling pathway. During my PhD, I become interested in understanding how different cell types can be specified during development, and how do cells ensure that this occurs properly. During the first part of my thesis, I investigated one mechanism of cell type specification – asymmetric cell division. During the second part of my PhD, I studied the maintenance of tissue homeostasis by the adult stem cells of the Drosophila ntestine. During development, multipotent cells divide and give rise to cells with more restricted fates, in the process of building differentiated adult tissues. One mechanism employed to specify different cell fates is asymmetric cell division: during mitosis, cell fate determinants are asymmetrically localized to one of the future daughter cells, and will determine the fate of that daughter cell (Knoblich, 2001). A good example of this occurs during the development of the sensory organs in Drosophila, where precursor cells, the sensory organ precursors (SOPs), divide asymmetrically to produce two distinct cells, a pIIa cell and a pIIb cell. These will again divide asymmetrically to give rise to the four different cell types of the sensory organs. In this process, the Par6-aPKC complex localizes at the posterior cortex of the SOPs and promotes the actin-dependent localization of the cell fate determinants Numb, Partner of Numb (Pon) and Neuralized to the opposite anterior pole. Both Numb and Neuralized regulate Notch signaling, promoting its activation only in the posterior cell, which will become the pIIa cell (Bardin et al., 2004). The plasma membrane lipid phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate (PIP2) regulates the plasma vi membrane localization and activity of various proteins, including several actin regulators, thereby modulating actin-based processes (Di Paolo and De Camilli, 2006). I examined the distribution of PIP2 and of the PIP2-producing kinase Skittles (Sktl) in mitotic SOPs, and found that both Sktl and PIP2 reporters were uniformly distributed in dividing SOPs. However, in the course of this study, I unexpectedly observed that overexpression of full-length Pon or its localization domain (LD) fused to the Red Fluorescent Protein (RFP:PonLD) resulted in asymmetric distribution of Sktl and PIP2 reporters in dividing SOPs. This finding that Pon overexpression alters polar protein distribution is important because RFP::PonLD is often used as a polarity marker of dividing progenitors (Perdigoto et al., 2008). However, since Sktl and PIP2 do not play any detectable role in the asymmetric localization of the cell fate determinants, I decided to not further pursue this project. The second part of my PhD focused on how adult stem cells maintain tissue homeostasis. The maintenance of adult tissue homeostasis during the whole life span of the organism (which in some vertebrates can be more 200 years) requires that stem cells divide to replace the differentiated cell types of the organ, as well as to maintain the stem cell pool. In order to do so, adult stem cells utilize many of the same signaling pathways that are employed during embryonic development to regulate cell growth, proliferation, differentiation, death and morphogenesis. The adult Drosophila Intestinal Stem Cells (ISC) divide throughout the lifetime of the adult fly to replenish gut tissue by producing two differentiated cell types. The ISC division is thought to be asymmetric concerning the fate of the two daughter cells: one remains an ISC and the other becomes a progenitor cell, termed the enteroblast (EB). The ISC is the only dividing cell in the adult gut, and the EBs go on to differentiate directly, either into an enterocyte or an enteroendocrine cell. Enterocytes are polyploid absorptive epithelial cells, while the enteroendocrine cells are diploid cells that express peptide hormones. Lineage labeling analysis demonstrated that ISCs are multipotent stem cells (Micchelli and Perrimon, 2006; Ohlstein and Spradling, 2006) and Notch signaling has been shown to play a role in regulating cell fate decision of the ISC lineage. The Notch ligand Delta is expressed in the ISCs and Notch signaling is activated in the EB to promote EB, enteroendocrine and vii enterocyte fates (Micchelli and Perrimon, 2006; Ohlstein and Spradling, 2006; Ohlstein and Spradling, 2007). In my work, I have shown that the transcriptional repression of Notch target genes is required to maintain the ISC identity (Bardin et al., 2010). However, how Notch signaling is modulated to control the acquisition of the EB fate and two distinct differentiated cell fates is not understood. It has been proposed that the specification of the differentiated fates could be related to the level of Notch signaling (Ohlstein and Spradling, 2007), a mechanism that has also been proposed to be employed by other stem cell lineages (Mazzone et al., 2010). Given the role of Notch signaling in many stem cell fate decisions, it is important to understand how it can promote alternative fates in a single precursor cell. To answer this question and to identify novel regulators of the cell fate decisions in the ISC lineage, we carried out a chemical mutagenesis screen in Drosophila. During this screen, random mutations were induced and mitotic clones, in the F2 generation, were screened for mutants in which intestinal cell type specification was affected. Several complementation groups with defects in cell type specification were identified, which can be divided into three groups: mutants in which the stem cell is lost, mutants with overproduction of enteroendocrine like cells and mutants with excess of stem cell-like cells. I characterized briefly and mapped some of these mutations. I further investigated the role of one of the genes identified in this screen. One complementation group was found to specifically affect the self-renewing of ISCs without affecting the production of differentiated cells. I mapped this complementation group to the Gmd (GDP-mannose 4,6-dehydratase) gene. Clones of Gmd mutant cells have an overproduction of Delta positive, proliferative, multipotent stem cell-like cells in the intestine. However, unlike the loss of Notch signaling, loss of Gmd does not affect differentiation, as shown by the finding that enterocytes and enteroendocrine cells are normally specified in Gmd mutant clones. This suggests that in Gmd mutants ISCs, the ISC can divide asymmetrically, in relation to the fate of the daughter cells, to self-renew and produce EBs, or symmetrically to give rise to two ISCs. Gmd is required for the production of fucose and has been shown to be required for the O-fucosyltransferase 1 (Ofut1)-dependent fucosylation of the Notch viii receptor (Okajima and Irvine, 2002; Okajima et al., 2003; Sasamura et al., 2003). It is thought that O-fucosylated Notch protein serves only as a subsequent substrate for further glycosylation by the glycosyltransferase Fringe (Fng), since the loss of fucosylation results in defects only in developmental contexts that require Fngdependent modification of Notch (Okajima et al., 2008; Okajima et al., 2005). Interestingly, I found that Gmd plays a fringe-independent, but Ofut1-dependent, role to limit symmetric ISC divisions. Furthermore, the Gmd phenotype can be suppressed by the expression of active nuclear Notch. In addition, I found that Notch signaling could still be activated in Gmd mutant clones, but that precise asymmetric fate decisions in the daughter cells do not occur. Studies in mammalian cells found that O-fucosylated Notch receptor is more strongly activated by its ligands (Chen et al., 2001; Moloney et al., 2000; Stahl et al., 2008). My data are consistent with Gmd being required for high levels of Notch activation in the ISC lineage, which is necessary to limit symmetric division of the ISC. To test how the levels of Notch signaling affect the ISC lineage, I analyzed the temperature-dependent effect of rumi mutations in the intestine. Rumi is a component of the Notch signaling pathway but the requirement for Rumi is temperature-dependent: at 18ºC rumi mutants have a very mild loss of Notch signaling phenotype while at 28ºC they have a stronger phenotype (Acar et al., 2008). I found that rumi mutant clones in the intestine are wild-type at 18ºC but have a stronger phenotype at 28ºC. At 21ºC and 22ºC, rumi mutant clones have an overabundance of ISCs but differentiation is essentially unaffected, similar to Gmd mutants. This data support a model in which different cell fate decisions require different levels of Notch signaling: while the asymmetric decision between ISC and EB requires high levels of Notch signaling, further differentiation of the EB into enterocyte or enteroendocrine cells can occur with lower levels of Notch activity. Such requirement of high levels of Notch signaling for daughter cell commitment, that is, exit from self-renewal, could be a mechanism to prevent loss of the ISC. I propose that this could be a general mechanism utilized by stem cells to ensure their maintenance, in which high threshold signaling prevents noisy, low levels of signaling that could lead to the loss of the stem cell.A produção de diferentes tipos celulares é um processo fulcral para o organismo, quer durante o seu desenvolvimento, quer na regulação da homeostase adulta, para a qual contribuem os processos de renovação celular. A coordenação de diferentes eventos celulares, tais como a proliferação, diferenciação e morte celular, envolve sofisticados processos de comunicação celular. Para este efeito, existem diferentes vias de sinalização inter-celular que são utilizadas, primeiro durante o desenvolvimento, para orquestrar a embriogénese, e posteriormente no adulto, para manter os diferentes tecidos. A via de sinalização ‘Notch’ é uma das principais vias de sinalização celular, sendo essencial tanto durante o desenvolvimento como para a regulação de vários tipos de células estaminais. O principal objectivo da minha actividade científica tem sido investigar a origem dos diferentes tipos celulares e os mecanismos que asseguram a sua correcta especificação num tecido em homeostase. Numa fase inicial, estudei a divisão celular assimétrica, um dos mecanismos utilizados para gerar diferentes tipos celulares. Na segunda e principal parte dos meus estudos doutorais, investiguei a manutenção do epitélio intestinal em Drosophila melanogaster por células estaminais intestinais. Durante o desenvolvimento dos metazoários, células progenitoras com potencial para gerar diferentes tipos celulares dão origem a células com potencial mais restrito que, eventualmente, estarão na origem dos diferentes tipos de células diferenciadas constituintes dos vários tecidos do organismo adulto. A divisão celular assimétrica é um dos mecanismos utilizados para gerar diferentes tipos celulares. Quando uma célula se divide assimetricamente, ocorre uma distribuição assimétrica de factores citoplasmáticos durante a mitose, que são herdados diferencialmente pelas células filhas e determinam a identidade dessas células (Knoblich, 2001). A divisão da célula precursora dos órgãos sensoriais (SOPs) em Drosophila é um exemplo de divisão celular assimétrica. A célula SOP divide-se assimetricamente produzindo uma célula pIIa e uma pIIb, que se dividem também assimetricamente, originando os quatro tipos de células dos órgãos sensoriais. Durante a mitose, o x complexo Par6-aPKC, um complexo de proteínas que participa em processos de polarização celular, localiza-se no pólo posterior da célula SOP e promove a localização, através dos microfilamentos de actina, dos determinantes Numb, Partner of Numb (Pon) e Neuralized no pólo oposto da célula. As proteínas Numb e Neuralized são reguladoras da via de sinalização Notch, promovendo a activação assimétrica do receptor Notch na célula posterior, que adopta a identidade de pIIa (Bardin et al., 2004). O fosfolípido fosfatidilinositol (4,5) -bifosfato (PIP2) é um componente do folheto interno da membrana plasmática que regula a localização e actividade de várias proteínas, incluindo reguladores dos microfilamentos de actina (Di Paolo and De Camilli, 2006). Para testar o papel do PIP2 na divisão assimétrica das células SOP, determinou-se a localização do PIP2 e da proteína Skittles (Sktl), a cinase que produz PIP2. Observei que tanto Sktl como repórteres de PIP2 se localizam simetricamente no córtex de células SOP em mitose. No entanto, observei também que a expressão da proteína Pon ou do seu domínio de localização (LD) ligado com uma proteína fluorescente (RFP::PonLD) resultam na localização assimétrica dos repórteres de PIP2 e de Sktl no pólo posterior da célula SOP em divisão. Como o RFP::PonLD é um repórter de divisão assimétrica frequentemente utilizado, o seu efeito na localização da cinase que produz PIP2 e do PIP2 é relevante (Perdigoto et al., 2008). No entanto, como o PIP2 não parece estar implicado na localização assimétrica de determinantes durante a divisão celular, o projecto foi concluído com a publicação destes resultados. Durante a segunda e principal parte dos meus estudos doutorais, interessei-me pela problemática da manutenção da homeostase por células estaminais adultas. A manutenção dos diferentes orgãos ocorre continuamente durante toda a vida do organismo que, em certos animais, pode ultrapassar os 200 anos. Durante esse tempo, as células estaminais têm que renovar os diferentes tipos celulares e, simultaneamente, manter a sua própria população. Para tal, as células estaminais adultas utilizam as mesmas vias de sinalização celular que são utilizadas durante o desenvolvimento embrionário para comunicar entre si e regular a proliferação, diferenciação e morte celular. As células estaminais intestinais (ISCs) presentes no intestino de Drosophila proliferam durante toda a vida adulta, produzindo os dois xi tipos celulares diferenciados que constituem este epitélio. As ISCs são as únicas células a proliferar no intestino e têm uma linhagem muito simples: uma das células filhas permanece como ISC enquanto.que a outra célula filha, denominada enteroblasto (EB), se diferencia. O EB adopta um de dois tipos celulares, convertendo-se quer numa célula enteroendócrina, produzindo hormonas peptídicas, quer numa célula epitelial absortiva, designada de enterócito. As ISCs exprimem Delta, um ligando da via Notch, e foram recentemente identificadas como células estaminais proliferativas e multipotentes (Micchelli and Perrimon, 2006; Ohlstein and Spradling, 2006). A via Notch tem um papel essencial na regulação dos diferentes tipos celulares no intestino, na medida em que esta via é activada no EB e promove a diferenciação desta célula, regulando também a sua diferenciação numa célula enteroendócrina ou num enterócito (Micchelli and Perrimon, 2006; Ohlstein and Spradling, 2006; Ohlstein and Spradling, 2007). A repressão da transcrição de genes alvo da via Notch é essencial para a manutenção da célula estaminal (Bardin et al., 2010). No entanto, ainda não foi determinado como é que a via Notch regula estas três decisões. Foi proposto que o EB poderá receber diferentes níveis de sinalização Notch, determinando assim qual dos tipos celulares será produzido (Ohlstein and Spradling, 2007). Um mecanismo semelhante foi proposto para a regulação da diferenciação na glândula mamária (Mazzone et al., 2010). Para identificar novos reguladores do desenvolvimento das células ISC, decidimos fazer um ‘crivo’ genético através da indução de mutações aleatórias no genoma de Drosophila, analisando posteriormente o fenótipo no intestino de moscas adultas. O objectivo deste trabalho foi a identificação de genes que resultam em proliferação ou diferenciação alteradas das células ISC. Neste ‘crivo’ genético identificámos três tipos diferentes de mutantes: mutantes com hiperproliferação de células estaminais, mutantes com hiperproliferação de células enteroendócrinas e mutantes com número reduzido de células estaminais. Após breve caracterização e mapeamento genético de alguns destes mutantes, concentrei-me no estudo da função dum destes genes na regulação da produção de células ISC. Num dos grupos de complementação de mutantes identificado, foi observada uma expansão da população de células ISC sem que a sua diferenciação parecesse xii afectada. Os mutantes deste grupo de complementação foram mapeados e foram identificadas mutações no gene Gmd (codificando a enzima GDP-manose 4,6-desidratase). Os mutantes Gmd tem um excesso de células proliferativas multipotentes que expressam o marcador Delta. No entanto, e ao contrário do que foi observado nos mutantes da via Notch (que também revelam excesso de células ISC), as células diferenciadas são normalmente especificadas nos mutantes Gmd. Em contraste com o que se verifica em animais controlo, onde as células ISC normais se dividem sempre assimetricamente em relação ao destino das células filhas, as células ISC de animais mutantes Gmd podem dividir-se quer.assimetricamente, originando uma ISC e um EB, quer simetricamente, produzindo duas células ISC idênticas. A enzima Gmd é essencial à produção de fucose nas células, sendo necessária para a fucosilação do receptor Notch pela enzima Ofut1 [Ofucosyltransferase 1 (Okajima and Irvine, 2002; Okajima et al., 2003; Sasamura et al., 2003)]. A proteína Notch fucosilada pode ser subsequentemente glicosilada por outra glicosiltransferase, conhecida por Fringe [Fng (Okajima et al., 2003)]. Esta modificação de Notch por Fng é necessária em certos contextos celulares e modifica a afinidade de Notch para os seu ligandos; o único contexto descrito em que fucosilação de Notch é indispensável é como substrato para a subsequente glicosilação do recepor pelo Fng (Okajima et al., 2008; Okajima et al., 2005). No entanto, observei que a mutação do gene fng no intestino não afecta as células ISC, enquanto que mutações em Ofut1 resultam no mesmo fenótipo que a perda de função de Gmd. Experiências em células de mamíferos sugerem que o receptor Notch fucosilado pode ser mais eficazmente activado pelos ligandos (Chen et al., 2001; Moloney et al., 2000; Stahl et al., 2008). Isto levou-nos a propor que a intensidade do sinal Notch depende da fucosilação do receptor e que a decisão que as células filhas de uma célula ISC têm que tomar, entre permanecer como ISC ou iniciar a diferenciação, requer uma actividade elevada da via Notch. Pelo contrário, a decisão sobre o destino das células diferenciadas pode ocorrer com uma actividade mais reduzida da via Notch. xiii . A apoiar desta hipótese, verifica-se que a modulação da actividade Notch em mutantes termosensíveis rumi [codificando para um componente da via Notch (Acar et al., 2008)], revelam hiperproliferação de células ISC sem afectar a decisão do tipo de diferenciação. Estes resultados levam-me a propor um modelo em que uma actividade elevada da via Notch é necessária para implementar a decisão de diferenciação das células ISC. Esta necessidade de uma actividade elevada da via Notch poderá constituir um potencial mecanismo para proteger a célula estaminal. Assim, será interessante verificar se outros tipos de células estaminais também requerem uma sinalização Notch elevada, antes de se comprometerem com vias de diferenciação. Concluindo, este estudo põe em evidência um potencial mecanismo de protecção de uma população de células estaminais, em que a diferenciação só pode ocorrer com níveis elevados de comunicação celular mediada pela via Notch ou por outra via de comunicação celular. Este mecanismo confere assim robustez à população de células estaminais, limitando a vulnerabilidade destas células a sinais de diferenciação inespecíficos e que põe em risco a manutenção, a longo prazo, da homeostase dos tecidos e a viabilidade do organismo.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH / BD / 22135 / 2005;
Association Pasteur-Weizmann
