Inhibition of the tyrosine phosphatase SHP-2 suppresses angiogenesis in vitro and in vivo

Endothelial cell survival is indispensable to maintain endothelial integrity and initiate new vessel formation. We investigated the role of SHP-2 in endothelial cell survival and angiogenesis in vitro as well as in vivo. SHP-2 function in cultured human umbilical vein and human dermal microvascular endothelial cells was inhibited by either silencing the protein expression with antisense-oligodesoxynucleotides or treatment with a pharmacological inhibitor (PtpI IV). SHP-2 inhibition impaired capillary-like structure formation (p < 0.01; n = 8) in vitro as well as new vessel growth ex vivo (p < 0.05; n = 10) and in vivo in the chicken chorioallantoic membrane (p < 0.01, n = 4). Additionally, SHP-2 knock-down abrogated fibroblast growth factor 2 (FGF-2)-dependent endothelial proliferation measured by MTT reduction ( p ! 0.01; n = 12). The inhibitory effect of SHP-2 knock-down on vessel growth was mediated by increased endothelial apoptosis ( annexin V staining, p ! 0.05, n = 9), which was associated with reduced FGF-2-induced phosphorylation of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K), Akt and extracellular regulated kinase 1/2 (ERK1/2) and involved diminished ERK1/2 phosphorylation after PI3-K inhibition (n=3). These results suggest that SHP-2 regulates endothelial cell survival through PI3-K-Akt and mitogen-activated protein kinase pathways thereby strongly affecting new vessel formation. Thus, SHP-2 exhibits a pivotal role in angiogenesis and may represent an interesting target for therapeutic approaches controlling vessel growth. Copyright (C) 2007 S. Karger AG, Basel

In Vivo Conditions to Identify Prkci Phosphorylation Targets Using the Analog-Sensitive Kinase Method in Zebrafish

Protein kinase C iota is required for various cell biological processes including epithelial tissue polarity and organ morphogenesis. To gain mechanistic insight into different roles of this kinase, it is essential to identify specific substrate proteins in their cellular context. The analog-sensitive kinase method provides a powerful tool for the identification of kinase substrates under in vivo conditions. However, it has remained a major challenge to establish screens based on this method in multicellular model organisms. Here, we report the methodology for in vivo conditions using the analog-sensitive kinase method in a genetically-tractable vertebrate model organism, the zebrafish. With this approach, kinase substrates can uniquely be labeled in the developing zebrafish embryo using bulky ATPγS analogs which results in the thiophosphorylation of substrates. The labeling of kinase substrates with a thiophosphoester epitope differs from phosphoesters that are generated by all other kinases and allows for an enrichment of thiophosphopeptides by immunoaffinity purification. This study provides the foundation for using the analog-sensitive kinase method in the context of complex vertebrate development, physiology, or disease

Direct proton conductance through the TRPV1 pore and multimerization of TRPV channel subunits

0\. Titelblatt und Inhaltsverzeichnis 1\. Einleitung 2\. Zielsetzung 3\. Material und Methoden 4\. Ergebnisse 5\. Diskussion 6\. Zusammenfassung 7\. Referenzen 8\. AnhangTRPV1-induzierte intrazelluläre Ansäuerung: Die Vanilloidrezeptor-verwandten "transient receptor potential" (TRPV)-Kanäle gehören zu der Superfamilie der hexahelikalen Kationenkanäle und sind integrale Komponenten der Wärme- und Schmerzwahrnehmung sowie der renalen und intestinalen Ca2+-Resorption. Der Begründer der TRPV-Subfamilie, der Vanilloid-Rezeptor (TRPV1), ein in sensorischen Neuronen exprimierter, nicht-selektiver Kationenkanal, wird sowohl durch chemische als auch durch physikalische Reize aktiviert. Hierzu gehören Vanilloide wie z.B. Capsaicin und körpereigene vanilloidähnliche Stoffe sowie Hitze. Eine Beteiligung von TRPV1 an der Regulation des intrazellulären pH war bislang noch nicht bekannt und wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht. Bei neutralem extrazellulärem pH, konnte eine Capsaicin-vermittelte Ansäuerung als Folge eines Ca2+-Einstroms beobachtet werden. In azidem Extrazellulärmedium hingegen konnte sowohl durch fluometrische als auch elektrophysiologische Untersuchungen eine direkte Permeation von Protonen durch die TRPV1-Pore nachgewiesen werden, was einen neuen Mechanismus darstellt. Für TRPV1 konnten sehr hohe relative Protonen- Permeabilitäten ermittelt werden, was auf einen von Metallkationen abweichenden Protonen-Permeationsmechanismus hinweist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die TRPV1-Pore permeabel für große organische Kationen wie NMDG, TEA und den fluoreszierenden Chlorid-Indikator MEQ ist. Sowohl die Ca2+-abhängige als auch die Ca2+-unabhängige intrazelluläre Azidifizierung konnte in frisch isolierten Neuronen aus Hinterwurzelganglien der Ratte nachgewiesen werden. Diese Daten weisen darauf hin, dass beide Mechanismen auch im nativen Zellsystem existieren. Weiterhin konnte in elektrophysiologischen Messungen an "cell-attached"-Membranflecken TRPV1-exprimierender HEK293-Zellen eine spannungsabhängige Blockierung von TRPV1 durch Erhöhung der intrazellulären Protonenkonzentration gezeigt werden. Selektivität und Promiskuität der TRPV-Multimerisierung: In Analogie zu CNG- und spannungsabhängigen Kalium-Kanälen werden funktionelle TRPV-Kanalkomplexe durch eine Quartärstruktur aus vier Kanaluntereinheiten aufgebaut. Dies konnte bereits für TRPV1, TRPV5 und TRPV6 gezeigt werden. Da bislang keine systematischen Untersuchungen zur Ausbildung von TRPV-Homo- und Heteromultimeren vorlagen, wurde dies im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Bei der Analyse der Assemblierung von unterschiedlichen TRPV-Untereinheiten zeigte sich, dass trotz phylogenetisch enger Verwandtschaft innerhalb der TRPV- Subfamilie vorwiegend Homomultimere ausgebildet werden. Heteromultimere konnten nur für TRPV5 und TRPV6, sowie zwischen TRPV1 und TRPV2 nachgewiesen werden. Kolokalisations-Experimente mit CFP- bzw. YFP-markierten TRPV- Kanaluntereinheiten zeigten ein übereinstimmendes Verteilungsmuster der betreffenden Proteine. Eine direkte Interaktion der Kanaluntereinheiten konnte mittels FRET- und Koimmunpräzipitations-Experimenten nachgewiesen werden. Um zu klären, welche Proteindomänen an der spezifischen Interaktion zwischen TRPV-Untereinheiten beteiligt sind, wurden FRET-Experimente und Ca2+-Messungen mit N- bzw. C-terminal trunkiertem TRPV1, den cytosolischen Termini von TRPV1 und TRPV4 als auch mit chimären TRPV1/TRPV4-Kanaluntereinheiten durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die cytosolischen Termini als auch die Transmembransegmente synergistisch zu der Gesamtaffinität zwischen TRPV- Kanaluntereinheiten beitragen und die Selektivität der Homo- und Heteromultimerisierung von TRPV-Untereinheiten kontrollieren.TRPV1-induced intracellular acidification: The vanilloid receptor-related transient receptor potential channels (TRPV) belong to the superfamily of hexahelical cation channels and are integral components of thermosensation, pain perception and Ca2+-reabsorption in kidney and intestine. The vanilloid receptor (TRPV1), a poorly selective cation channel, is expressed in dorsal root ganglion (DRG) neurons and is regulated by diverse stimuli including capsaicin, endovanilloids and heat. Since a possible impact of TRPV1 activation on the intracellular pH was not known, this was investigated in this part of the study. At neutral extracellular pH, the capsaicin-induced intracellular acidification was strictly coupled to the Ca2+ influx component. In acidic extracellular media, an as yet unrecognized direct proton permeation through the nonselective TRPV1-pore could be demonstrated by fluometric and electrophysiological analyses. The high proton permeability determined for TRPV1 points to a proton entry mechanism through the TRPV1-pore which is distinct from the permeation of metal ions. Furthermore, permeation of large organic cations through the TRPV1-pore as NMDG, TEA and the fluorescent cell- impermeant chloride indicator MEQ could be demonstrated. Activation of TRPV1 both in the presence of extracellular Ca2+ and in acidic Ca2+- and Na+-free acidic KCl solutions resulted in a marked intracellular acidification in freshly isolated nociceptive dorsal root ganglion (DRG) neurons. These data indicate that both acidification mechanisms also exist in the native cellular context of nociceptive neurons. Furthermore, the intracellular acidification caused a voltage-dependent block of TRPV1 in cell-attached patches. Selectivity and promiscuity of homo- and heteromeric assembly of TRPV channel subunits: Like voltage-gated K+ channels and cyclic nucleotide-gated channels, functional channel complexes are believed to be composed of tetrameric TRPV proteins as recently shown for TRPV1, TRPV5 and TRPV6. A systematic and combinatorial analysis of TRPV homo- and heterooligomerization was lacking so far. Therefore, the aim of this part of the study was to evaluate the selectivity and promiscuity of homo- and heteromultimerization between TRPV channel subunits in living cells. To analyze the assembly of TRPV subunits in living cells, fluorescent fusion proteins or FLAG-tagged TRPV channel subunits were generated. The interaction between TRPV subunits was assessed by analysis of the subcellular colocalization, fluorescence resonance energy transfer and coimmunoprecipitation. The results point to a restricted promiscuity of heteromeric TRPV channel assembly. Besides heteromers between TRPV5 and TRPV6 or between TRPV1 and TRPV2, TRPV channel subunits preferentially assemble into homomeric complexes. To explore which protein domains contribute to the specific interaction between TRPV channel subunits, quantitative FRET analyses and Ca2+ imaging experiments with truncated TRPV1 subunits, cytosolic termini of TRPV1 or TRPV4 and chimeric TRPV channel subunits were performed. The data revealed that the specificity and the affinity of the subunit interaction may be synergistically provided by interaction modules located in the cytosolic termini and in the transmembrane domains

Fluch und Segen des Bauhausstils

Der anhaltende Bauboom verändert das Aussehen deutscher Städte. Dabei werden insbesondere die Häuser im sog. Bauhausstil kritisiert, die in Baulücken gesetzt werden und traditionelle Bauensemble auseinanderreißen. Ziel des Beitrags ist es, die Zustimmung zum sog. Bauhausstil zu überprüfen, der deutsche Wohnsiedlungen überrennt. Wie viel Zuspruch erhalten diese Häuser wirklich? Wird dieser Stil tatsächlich geschätzt? Wie werden Häuser im Bauhausstil alleine und im Kontext anderer Immobilien bewertet? Die Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen: Der Bauhausstil wird im Vergleich mit anderen Baustilen nur von einer Minderheit präferiert. Menschen in Deutschland präferieren üppiger verzierte und ornamentierte Gebäude. Die weiße Farbe ist absolut kein Muss. Flachdächer werden überwiegend abgelehnt. Bauhäuser, denen nachträglich schräge Dächer aufgesetzt wurden, werden präferiert. Werden Häuser im Bauhausstil in Baulücken gesetzt, so dass eine früher homogene Bausituation gestört wird, wird dies überwiegend abgelehnt. Häuser in homogenen Bausituationen haben einen höheren Wert als Häuser in Gebäudegruppen, die durch ein abweichendes Haus gestört wurden. Homogenität von Gebäudegruppen ist eine wertsteigernde Eigenschaft. Punkten können Häuser im Bauhausstil gegenüber traditionellen Immobilien vor allem durch ihre Neuwertigkeit: c.p. wird Neu gegenüber Alt bevorzugt. Wenn Häuser im Bauhausstil in einigen Jahren nicht mehr neu sein werden, dann wird die Zerstörung der Homogenität einer Bausituation übrigbleiben. Die Stadtplanung sollte stärker regulierend eingreifen.The sustained and continuing construction boom alters the appearance of German cities. One project follows the other. There is no or limited willingness for serious urban planning. People criticise the disappearance of traditional structures. Especially new houses in the so called Bauhaus style are accused of being aesthetically unattractive. They would disturb and hinder a positive urban development. Aim of the article is to evaluate the consent or disapproval with the Bauhaus style. How serious is the criticism, and how deep is the aversion when residential property in the Bauhaus style fills a gap in a homogenous row of houses built in other styles? The results are as follows: The Bauhaus style is supported by a minority only. The vast majority prefers other styles, especially the classical style. People do not favour the white colour – other colours are equally liked. The same is true with the flat roof or the asymmetric windows – all typical elements of the Bauhaus style. Other types of roofs and windows are preferred. The disturbance of a homogenous row of houses by a house in the Bauhaus style is being negatively rated. Homogeneity of a neighbourhood is a very highly ranked criterion when valuing residential properties. It follows that urban planning should be more restrictive in regulating the appearance of new buildings in established urban areas

Clinical and antibacterial effect of an anti-inflammatory toothpaste formulation with Scutellaria baicalensis extract on experimental gingivitis

It was the aim of the study to evaluate the clinical and antibacterial effect of a dentifrice containing an anti-inflammatory plant extract (SB) versus a placebo (PLA) using an experimental gingivitis model. Forty subjects (20 per group) discontinued all oral hygiene measures for four teeth for a period of 21 days using a shield (to generate a possible gingivitis) while they could brush the other teeth normally. After brushing, the shield was removed and teeth were treated with the randomly assigned toothpaste slurry for 1 min. Löe and Silness gingival index (GI), Silness and Löe plaque index (PI), and biofilm vitality (VF%) were assessed at days 0, 14, and 21, respectively. Subjects of the PLA group developed a GI of 0.82?±?0.342 (day 14) and 1.585?±?0.218 (day 21), while the data of the SB group were significantly reduced (0.355?±?0.243 and 0.934?±?0.342, p?<?0.001). While PI was significantly reduced at all follow-up appointments, reductions in VF reached the level of significance only at day 21. The results suggest that the new toothpaste formulation was able to significantly reduce the extent of gingivitis, plaque development, and vital flora

Structure of the human TRPML2 ion channel extracytosolic/lumenal domain

TRPML2 is the least structurally characterized mammalian transient receptor potential mucolipin ion channel channel. The TRPML family hallmark is a large extracytosolic/lumenal domain (ELD) between transmembrane transmembrane helices S1 and S2. We present crystal structures of the tetrameric human TRPML2 ELD at pH 6.5 (2.0 Å) and 4.5 (2.95 Å), corresponding to the pH values in recycling endosomes and lysosomes lysosomes. Isothermal titration calorimetry shows Ca2+ binding to the highly acidic central pre-pore pore loop which is abrogated at low pH, in line with a pH-dependent channel regulation model. Small angle X-ray scattering confirms the ELD dimensions in solution. Changes in pH or Ca2+ concentration do not affect the protein&#039;s secondary structure, but can influence ELD oligomer integrity according to to native mass spectrometry. Our data thus complete the set of high-resolution views of human TRPML channel channel ELDs and reveal some structural responses to the conditions the TRPML2 ELD encounters as the the channel traffics through the endolysosomal system