0\. Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
1\. Einleitung
2\. Zielsetzung
3\. Material und Methoden
4\. Ergebnisse
5\. Diskussion
6\. Zusammenfassung
7\. Referenzen
8\. AnhangTRPV1-induzierte intrazelluläre Ansäuerung: Die Vanilloidrezeptor-verwandten
"transient receptor potential" (TRPV)-Kanäle gehören zu der Superfamilie der
hexahelikalen Kationenkanäle und sind integrale Komponenten der Wärme- und
Schmerzwahrnehmung sowie der renalen und intestinalen Ca2+-Resorption. Der
Begründer der TRPV-Subfamilie, der Vanilloid-Rezeptor (TRPV1), ein in
sensorischen Neuronen exprimierter, nicht-selektiver Kationenkanal, wird
sowohl durch chemische als auch durch physikalische Reize aktiviert. Hierzu
gehören Vanilloide wie z.B. Capsaicin und körpereigene vanilloidähnliche
Stoffe sowie Hitze. Eine Beteiligung von TRPV1 an der Regulation des
intrazellulären pH war bislang noch nicht bekannt und wurde in der
vorliegenden Arbeit untersucht. Bei neutralem extrazellulärem pH, konnte eine
Capsaicin-vermittelte Ansäuerung als Folge eines Ca2+-Einstroms beobachtet
werden. In azidem Extrazellulärmedium hingegen konnte sowohl durch
fluometrische als auch elektrophysiologische Untersuchungen eine direkte
Permeation von Protonen durch die TRPV1-Pore nachgewiesen werden, was einen
neuen Mechanismus darstellt. Für TRPV1 konnten sehr hohe relative Protonen-
Permeabilitäten ermittelt werden, was auf einen von Metallkationen
abweichenden Protonen-Permeationsmechanismus hinweist. Weiterhin konnte
gezeigt werden, dass die TRPV1-Pore permeabel für große organische Kationen
wie NMDG, TEA und den fluoreszierenden Chlorid-Indikator MEQ ist. Sowohl die
Ca2+-abhängige als auch die Ca2+-unabhängige intrazelluläre Azidifizierung
konnte in frisch isolierten Neuronen aus Hinterwurzelganglien der Ratte
nachgewiesen werden. Diese Daten weisen darauf hin, dass beide Mechanismen
auch im nativen Zellsystem existieren. Weiterhin konnte in
elektrophysiologischen Messungen an "cell-attached"-Membranflecken
TRPV1-exprimierender HEK293-Zellen eine spannungsabhängige Blockierung von
TRPV1 durch Erhöhung der intrazellulären Protonenkonzentration gezeigt werden.
Selektivität und Promiskuität der TRPV-Multimerisierung: In Analogie zu CNG-
und spannungsabhängigen Kalium-Kanälen werden funktionelle TRPV-Kanalkomplexe
durch eine Quartärstruktur aus vier Kanaluntereinheiten aufgebaut. Dies konnte
bereits für TRPV1, TRPV5 und TRPV6 gezeigt werden. Da bislang keine
systematischen Untersuchungen zur Ausbildung von TRPV-Homo- und
Heteromultimeren vorlagen, wurde dies im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Bei
der Analyse der Assemblierung von unterschiedlichen TRPV-Untereinheiten zeigte
sich, dass trotz phylogenetisch enger Verwandtschaft innerhalb der TRPV-
Subfamilie vorwiegend Homomultimere ausgebildet werden. Heteromultimere
konnten nur für TRPV5 und TRPV6, sowie zwischen TRPV1 und TRPV2 nachgewiesen
werden. Kolokalisations-Experimente mit CFP- bzw. YFP-markierten TRPV-
Kanaluntereinheiten zeigten ein übereinstimmendes Verteilungsmuster der
betreffenden Proteine. Eine direkte Interaktion der Kanaluntereinheiten konnte
mittels FRET- und Koimmunpräzipitations-Experimenten nachgewiesen werden. Um
zu klären, welche Proteindomänen an der spezifischen Interaktion zwischen
TRPV-Untereinheiten beteiligt sind, wurden FRET-Experimente und Ca2+-Messungen
mit N- bzw. C-terminal trunkiertem TRPV1, den cytosolischen Termini von TRPV1
und TRPV4 als auch mit chimären TRPV1/TRPV4-Kanaluntereinheiten durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigten, dass die cytosolischen Termini als auch die
Transmembransegmente synergistisch zu der Gesamtaffinität zwischen TRPV-
Kanaluntereinheiten beitragen und die Selektivität der Homo- und
Heteromultimerisierung von TRPV-Untereinheiten kontrollieren.TRPV1-induced intracellular acidification: The vanilloid receptor-related
transient receptor potential channels (TRPV) belong to the superfamily of
hexahelical cation channels and are integral components of thermosensation,
pain perception and Ca2+-reabsorption in kidney and intestine. The vanilloid
receptor (TRPV1), a poorly selective cation channel, is expressed in dorsal
root ganglion (DRG) neurons and is regulated by diverse stimuli including
capsaicin, endovanilloids and heat. Since a possible impact of TRPV1
activation on the intracellular pH was not known, this was investigated in
this part of the study. At neutral extracellular pH, the capsaicin-induced
intracellular acidification was strictly coupled to the Ca2+ influx component.
In acidic extracellular media, an as yet unrecognized direct proton permeation
through the nonselective TRPV1-pore could be demonstrated by fluometric and
electrophysiological analyses. The high proton permeability determined for
TRPV1 points to a proton entry mechanism through the TRPV1-pore which is
distinct from the permeation of metal ions. Furthermore, permeation of large
organic cations through the TRPV1-pore as NMDG, TEA and the fluorescent cell-
impermeant chloride indicator MEQ could be demonstrated. Activation of TRPV1
both in the presence of extracellular Ca2+ and in acidic Ca2+- and Na+-free
acidic KCl solutions resulted in a marked intracellular acidification in
freshly isolated nociceptive dorsal root ganglion (DRG) neurons. These data
indicate that both acidification mechanisms also exist in the native cellular
context of nociceptive neurons. Furthermore, the intracellular acidification
caused a voltage-dependent block of TRPV1 in cell-attached patches.
Selectivity and promiscuity of homo- and heteromeric assembly of TRPV channel
subunits: Like voltage-gated K+ channels and cyclic nucleotide-gated channels,
functional channel complexes are believed to be composed of tetrameric TRPV
proteins as recently shown for TRPV1, TRPV5 and TRPV6. A systematic and
combinatorial analysis of TRPV homo- and heterooligomerization was lacking so
far. Therefore, the aim of this part of the study was to evaluate the
selectivity and promiscuity of homo- and heteromultimerization between TRPV
channel subunits in living cells. To analyze the assembly of TRPV subunits in
living cells, fluorescent fusion proteins or FLAG-tagged TRPV channel subunits
were generated. The interaction between TRPV subunits was assessed by analysis
of the subcellular colocalization, fluorescence resonance energy transfer and
coimmunoprecipitation. The results point to a restricted promiscuity of
heteromeric TRPV channel assembly. Besides heteromers between TRPV5 and TRPV6
or between TRPV1 and TRPV2, TRPV channel subunits preferentially assemble into
homomeric complexes. To explore which protein domains contribute to the
specific interaction between TRPV channel subunits, quantitative FRET analyses
and Ca2+ imaging experiments with truncated TRPV1 subunits, cytosolic termini
of TRPV1 or TRPV4 and chimeric TRPV channel subunits were performed. The data
revealed that the specificity and the affinity of the subunit interaction may
be synergistically provided by interaction modules located in the cytosolic
termini and in the transmembrane domains
