Presentació d'autoantígens per MHC II en cèl·lules endocrines: anàlisi del repertori de pèptids associat a DR4 i de la influència de les chaperones li i HLA-DM

Les molècules MHC de classe II uneixen pèptids generats en l'interior de la cèl.lula i els presenten a les cèl.lules T CD4+, que inicien i regulen la resposta immunitària. Les cadenes a i b que formen les MHC de classe II de nova síntesi, interaccionen amb una chaperona, la cadena invariant (Ii), que estabilitza el plegament dels dímers ab i impedeix la seva unió als pèptids presents en el reticle endoplasmàtic (RE). La interacció amb Ii també permet l'arribada dels complexes MHC II-Ii a la via endocítica on la chaperona es degrada fins que només el segment anomenat CLIP roman unit al solc d'unió a antigen dels dímers ab. L'alliberació del CLIP i la unió amb pèptids antigènics s' afavoreix pel baix pH dels endosomes i és catalitzada per HLA-DM, que estabilitza les MHC II i selecciona els pèptids units més estables. Quan s'ha format el complex MHC II-pèptid, aquest és conduït cap a la superfície cel.lular. En les cèl.lules B s'ha descrit l'expressió de la co-chaperona HLA-DO que interacciona amb el complex MHC II/DM i modula l'acció d'HLA-DM. En les malalties autoimmunitàries específiques d'òrgan, com la diabetis de tipus 1, la resposta autorreactiva destrueix selectivament les cèl.lules epitelials endocrines. En aquestes situacions s'ha descrit l'expressió de MHC II així com l'expressió variable de la cadena invariant (Ii) i HLA-DM, suggerint que la presentació d'epítops críptics per les cèl.lules endocrines podria permetre el manteniment de la resposta autorreactiva. En aquest treball s'ha estudiat aquesta hipòtesi des de dos aproximacions: (i) l'anàlisi del repertori peptídic associat a les MHC II en cèl.lules endocrines mitjançant tècniques d'espectrometria de masses i (ii) la caracterització de la via endocítica on s'associen els lligands a MHC II, per tècniques de microscopia electrònica de transmissió. L'estudi s'ha realitzat sobre el model experimental aconseguit per transfecció estable de la línia cel.lular derivada d'un insulinoma de rata RINm5F, amb els gens de les molècules humanes: HLA-DRB1*0401, Ii i HLA-DM. La transfecció seqüencial dels diferents gens permeté obtenir les cèl.lules endocrines (i) RIN-DR4, (ii) RIN-DR4Ii, (iii) RIN-DR4DM, i (iv) RIN-DR4IiDM. Els resultats mostren que les cèl.lules endocrines reorganitzen la via endocítica amb l'expressió de DR4, Ii i DM, afavorint-se la formació d'endosomes tardans multivesiculars i multilaminars, on es concentren les tres molècules implicades en la presentació d'antigen. En absència de chaperones, els complexes DR4-pèptid de la superfície cel.lular es troben associats a un repertori peptídic inestable i molt heterogeni, on s'identifiquen lligands derivats majoritàriament d' extrems N- i C-terminals de proteïnes citosòliques i que en molts casos no respecten el motiu d'anclatge a DR4. La coexpressió d'Ii permet la detecció d'un major nombre de dímers DR4 fora del RE que es localitzen preferentment a la superfície cel.lular. En absència d'HLA-DM, aquests complexes són inestables i es troben associats a CLIP, tot i que també s'han identificat lligands derivats de proteïnes exògenes i autòlogues. L'expressió d' HLA-DM en absència d'Ii permet la detecció de complexes DR4-pèptid estables amb lligands que respecten el motiu d'anclatge i deriven de proteïnes de membrana i citoplasmàtiques. La màxima eficiència s'aconsegueix amb la coexpressió d'ambdues chaperones. En les cèl.lules DR4IiDM, els dímers DR4 expressats a la superfície són estables i s'associen a un repertori peptídic homogeni en seqüència, longitud i origen, format per lligands autòlegs derivats de proteïnes de la superfície, de la vía secretora i del citoplasma, en algunes ocasions específiques de llinatge. Aquests lligands sempre respecten el motiu d'anclatge a DR4 i difereixen dels identificats en una línia B limfoblastoid homozigota per DR4. Per tant, l'expressió de DR4, Ii i DM en cèl.lules endocrines permet la presentació de pèptids autòlegs, específics de teixit i amb característiques diferents als presentats per cèl.lules amb l'expressió de MHC II constitutiva. Aquests epítops a més de ser condicionats pel llinatge cel.lular, estan influenciats per l'expressió de chaperones i podrien variar durant la resposta autoimmune en l'òrgan diana, condicionant el seu desenvolupament.MHC class II molecules present peptides to CD4+T cells to iniciate and regulate the immune response. Newly synthetized MHC class II a and b chains interact with a chaperone named invariant chain (Ii) that stabilizes their folding preventing the binding of peptide ligands in the endoplasmic reticulum (ER). The invariant chain targets MHC II-Ii complexes to the endocytic pathway where it is proteolitically degraded leaving a portion of its sequence named CLIP bound to the ab dimers. The exchange of CLIP for stably bound peptides is favoured by the endosomal acidic pH and catalized by another specific chaperone, HLA-DM. Stable MHC II-peptide complexes reach the plasma membrane by vesicular transport. HLA-DO is a third class II chaperone expressed by some antigen presenting cells, like B cells, that modulate HLA-DM function. In organ-specific autoimmune diseases such as type 1 diabetes, epithelial endocrine cells are the specific targets of the autoreactive response. In these situations endocrine cells express MHC II molecules and both chaperones Ii and DM with heterogeneous expression levels that leads to the suggestion that criptic epitopes may be presented by endocrine epithelial cells, thus maintaining the autoreactive response. This hypotesis has ben approached in this work from two different points: (i) analysis of the peptide repertoire associated to MHC II by mass spectrometry techniques and (ii) characterization of the endocytic pathway, where ligands associate to class II molecules, by cryoelectron microscopy. The study has been performed using an experimental model based on the stable transfection of the rat insulinoma cell line RINm5F with human class II genes HLA-DRB1*0401, Invariant chain and HLA-DM. Sequential transfection allowed the generation of four endocrine cell lines expressing (i) RIN-DR4, (ii) RIN-DR4Ii, (iii) RIN-DR4DM, (iv) RIN-DR4IiDM. The data show that class II expression in endocrine cells induce a reorganization of the endocytic pathway, favouring the formation of multivesicular and multilaminar late endosomes where molecules involved in class II antigen presentation are accumulated. In the absence of chaperones, DR4-peptide complexes contain a highly heterogeneous unstable peptide pool, with ligands mostly derived from the N- and C-termini of cytosolic proteins, that in many cases did not respect the DR4-peptide binding motif. Ii expression increase the presence of DR4 dimers outside the ER, mostly accumulated at the cell surface. In the absence of DM, these complexes are unstable and most of them associate to CLIP, although minor ligands from exogenous and autologous proteins are also identified. DM expresion in the absence of Ii allow the detection of stably bound DR4-peptide complexes at the cell surface, containing sequences derived from either cell surface or cytoplasmic proteins. In DR4IiDM cells, DR4 complexes at the cell surafce are stable and are associated to a peptide repertoire highly homogeneous in sequence, length and origin, formed by ligands derived from surface, secreted and cytoplasmic proteins, some of them tissue-specific. All the identified ligands respect the DR4-peptide binding motif and are different from the repertoire identified in a DR4-homozygous B-lymphoblastoid cell line. Thus, DR4, Ii and DM expression in endocrine epithelial cells allow the presentation of a panel of peptides, different from the ones presented by cells with constitutive class II expression, some of which are tissue specific. This repertoire is cell type dependent and influenced by the expression of both chaperones, suggesting the possibility of variations in the target organs during the autoimmune process that may condition its development

Presentació d'autoantígens per MHC II en cél·lules endocrines : anàlisi del repertori de pèptids associat a DR4 i de la influència de les chaperones li I HLA-DM /

Consultable des del TDXTítol obtingut de la portada digitalitzadaLes molècules MHC de classe II uneixen pèptids generats en l'interior de la cèl·lula i els presenten a les cèl·lules T CD4+, que inicien i regulen la resposta immunitària. Les cadenes a i b que formen les MHC de classe II de nova síntesi, interaccionen amb una chaperona, la cadena invariant (Ii), que estabilitza el plegament dels dímers ab i impedeix la seva unió als pèptids presents en el reticle endoplasmàtic (RE). La interacció amb Ii també permet l'arribada dels complexes MHC II-Ii a la via endocítica on la chaperona es degrada fins que només el segment anomenat CLIP roman unit al solc d'unió a antigen dels dímers ab. L'alliberació del CLIP i la unió amb pèptids antigènics s' afavoreix pel baix pH dels endosomes i és catalitzada per HLA-DM, que estabilitza les MHC II i selecciona els pèptids units més estables. Quan s'ha format el complex MHC II-pèptid, aquest és conduït cap a la superfície cel·lular. En les cèl·lules B s'ha descrit l'expressió de la co-chaperona HLA-DO que interacciona amb el complex MHC II/DM i modula l'acció d'HLA-DM. En les malalties autoimmunitàries específiques d'òrgan, com la diabetis de tipus 1, la resposta autorreactiva destrueix selectivament les cèl·lules epitelials endocrines. En aquestes situacions s'ha descrit l'expressió de MHC II així com l'expressió variable de la cadena invariant (Ii) i HLA-DM, suggerint que la presentació d'epítops críptics per les cèl·lules endocrines podria permetre el manteniment de la resposta autorreactiva. En aquest treball s'ha estudiat aquesta hipòtesi des de dos aproximacions: (i) l'anàlisi del repertori peptídic associat a les MHC II en cèl·lules endocrines mitjançant tècniques d'espectrometria de masses i (ii) la caracterització de la via endocítica on s'associen els lligands a MHC II, per tècniques de microscopia electrònica de transmissió. L'estudi s'ha realitzat sobre el model experimental aconseguit per transfecció estable de la línia cel·lular derivada d'un insulinoma de rata RINm5F, amb els gens de les molècules humanes: HLA-DRB1*0401, Ii i HLA-DM. La transfecció seqüencial dels diferents gens permeté obtenir les cèl·lules endocrines (i) RIN-DR4, (ii) RIN-DR4Ii, (iii) RIN-DR4DM, i (iv) RIN-DR4IiDM. Els resultats mostren que les cèl·lules endocrines reorganitzen la via endocítica amb l'expressió de DR4, Ii i DM, afavorint-se la formació d'endosomes tardans multivesiculars i multilaminars, on es concentren les tres molècules implicades en la presentació d'antigen. En absència de chaperones, els complexes DR4-pèptid de la superfície cel·lular es troben associats a un repertori peptídic inestable i molt heterogeni, on s'identifiquen lligands derivats majoritàriament d' extrems N- i C-terminals de proteïnes citosòliques i que en molts casos no respecten el motiu d'anclatge a DR4. La coexpressió d'Ii permet la detecció d'un major nombre de dímers DR4 fora del RE que es localitzen preferentment a la superfície cel·lular. En absència d'HLA-DM, aquests complexes són inestables i es troben associats a CLIP, tot i que també s'han identificat lligands derivats de proteïnes exògenes i autòlogues. L'expressió d' HLA-DM en absència d'Ii permet la detecció de complexes DR4-pèptid estables amb lligands que respecten el motiu d'anclatge i deriven de proteïnes de membrana i citoplasmàtiques. La màxima eficiència s'aconsegueix amb la coexpressió d'ambdues chaperones. En les cèl·lules DR4IiDM, els dímers DR4 expressats a la superfície són estables i s'associen a un repertori peptídic homogeni en seqüència, longitud i origen, format per lligands autòlegs derivats de proteïnes de la superfície, de la vía secretora i del citoplasma, en algunes ocasions específiques de llinatge. Aquests lligands sempre respecten el motiu d'anclatge a DR4 i difereixen dels identificats en una línia B limfoblastoid homozigota per DR4. Per tant, l'expressió de DR4, Ii i DM en cèl·lules endocrines permet la presentació de pèptids autòlegs, específics de teixit i amb característiques diferents als presentats per cèl·lules amb l'expressió de MHC II constitutiva. Aquests epítops a més de ser condicionats pel llinatge cel·lular, estan influenciats per l'expressió de chaperones i podrien variar durant la resposta autoimmune en l'òrgan diana, condicionant el seu desenvolupament.MHC class II molecules present peptides to CD4+T cells to iniciate and regulate the immune response. Newly synthetized MHC class II a and b chains interact with a chaperone named invariant chain (Ii) that stabilizes their folding preventing the binding of peptide ligands in the endoplasmic reticulum (ER). The invariant chain targets MHC II-Ii complexes to the endocytic pathway where it is proteolitically degraded leaving a portion of its sequence named CLIP bound to the ab dimers. The exchange of CLIP for stably bound peptides is favoured by the endosomal acidic pH and catalized by another specific chaperone, HLA-DM. Stable MHC II-peptide complexes reach the plasma membrane by vesicular transport. HLA-DO is a third class II chaperone expressed by some antigen presenting cells, like B cells, that modulate HLA-DM function. In organ-specific autoimmune diseases such as type 1 diabetes, epithelial endocrine cells are the specific targets of the autoreactive response. In these situations endocrine cells express MHC II molecules and both chaperones Ii and DM with heterogeneous expression levels that leads to the suggestion that criptic epitopes may be presented by endocrine epithelial cells, thus maintaining the autoreactive response. This hypotesis has ben approached in this work from two different points: (i) analysis of the peptide repertoire associated to MHC II by mass spectrometry techniques and (ii) characterization of the endocytic pathway, where ligands associate to class II molecules, by cryoelectron microscopy. The study has been performed using an experimental model based on the stable transfection of the rat insulinoma cell line RINm5F with human class II genes HLA-DRB1*0401, Invariant chain and HLA-DM. Sequential transfection allowed the generation of four endocrine cell lines expressing (i) RIN-DR4, (ii) RIN-DR4Ii, (iii) RIN-DR4DM, (iv) RIN-DR4IiDM. The data show that class II expression in endocrine cells induce a reorganization of the endocytic pathway, favouring the formation of multivesicular and multilaminar late endosomes where molecules involved in class II antigen presentation are accumulated. In the absence of chaperones, DR4-peptide complexes contain a highly heterogeneous unstable peptide pool, with ligands mostly derived from the N- and C-termini of cytosolic proteins, that in many cases did not respect the DR4-peptide binding motif. Ii expression increase the presence of DR4 dimers outside the ER, mostly accumulated at the cell surface. In the absence of DM, these complexes are unstable and most of them associate to CLIP, although minor ligands from exogenous and autologous proteins are also identified. DM expresion in the absence of Ii allow the detection of stably bound DR4-peptide complexes at the cell surface, containing sequences derived from either cell surface or cytoplasmic proteins. In DR4IiDM cells, DR4 complexes at the cell surafce are stable and are associated to a peptide repertoire highly homogeneous in sequence, length and origin, formed by ligands derived from surface, secreted and cytoplasmic proteins, some of them tissue-specific. All the identified ligands respect the DR4-peptide binding motif and are different from the repertoire identified in a DR4-homozygous B-lymphoblastoid cell line. Thus, DR4, Ii and DM expression in endocrine epithelial cells allow the presentation of a panel of peptides, different from the ones presented by cells with constitutive class II expression, some of which are tissue specific. This repertoire is cell type dependent and influenced by the expression of both chaperones, suggesting the possibility of variations in the target organs during the autoimmune process that may condition its development

Natural Killer Cell-Based Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia: Lessons for the Future.

The report by Curti et al. highlightsthe potential of NK cell-based adoptive cellular immunotherapy in oncology,currently boosted by advances in the knowledge on NK cell biology and in their ex-vivo GMP manipulation.Several issues deserve attention to fully achieve the translation of these advances to the clinic

Natural Killer Cell-Based Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia: Lessons for the Future.

The report by Curti et al. highlightsthe potential of NK cell-based adoptive cellular immunotherapy in oncology,currently boosted by advances in the knowledge on NK cell biology and in their ex-vivo GMP manipulation.Several issues deserve attention to fully achieve the translation of these advances to the clinic

Complete genomic characterization of a new allele, *03

Altres ajuts: Fundación Científica Asociación Española Contra el Cáncer, Grant/Award Number: GCB15152947MELEThe novel NKG2C*03 allele encodes a hybrid of the NKG2C*01 and NKG2C*02 primary structures

Complete genomic characterization of a new KLRC2 allele, NKG2C*03

Data de publicació electrònica: 20-02-2021This work was partially funded by grants SAF2016‐80363‐C2‐1/2‐R from the Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación (MCINN, Agencia Estatal de Investigación‐AEI/FEDER, EU), and PCIN‐2015‐191‐C02‐01/02 (FP7‐MINECO ERA‐NET Infect‐ERA program, EU) to C.V. and M.L.B. M.M. is hired by grant GCB15152947MELE from the Asociación Española contra el Cáncer Foundation; J.A. is hired by grant PID2019‐110609RB‐C22/AEI/10.13039/501100011033 (AEI/FEDER, EU) to C.V. Publication costs are defrayed by a nominative grant to support research from Consejería de Sanidad de la Comunidad de Madrid in 2021 to Fundación de Investigación Biomédica Puerta de Hierro

Adaptive NK cell response to human cytomegalovirus: Facts and open issues

Human cytomegalovirus (HCMV) infection exerts broad effects on the immune system. These include the differentiation and persistent expansion of a mature NK cell subset which displays a characteristic phenotypic and functional profile hallmarked by expression of the HLA-E-specific CD94/NKG2C activating receptor. Based on our experience and recent advances in the field, we overview the adaptive features of the NKG2C+ NK cell response, discussing observations and open questions on: (a) the mechanisms and influence of viral and host factors; (b) the existence of other NKG2C- NK cell subsets sharing adaptive features; (c) the development and role of adaptive NKG2C+ NK cells in the response to HCMV in hematopoietic and solid organ transplant patients; (d) their relation with other viral infections, mainly HIV-1; and (e) current perspectives for their use in adoptive immunotherapy of cancer.Research is supported by: Agencia Estatal de Investigación-FEDER (PID2019–110609RB-C21-C22/AEI/10.13039/501100011033); Fundació La Marató de TV3 (201822–10); Ministero dell’Istruzione (MIUR) - FRA 219; Ministero dell’Istruzione (MIUR): FISR2020IP_02937; ISCiii/FEDER (PI19/00328; PI22/00040) and CIBERONC

Haplotype-based analysis of KIR-gene profiles in a south european population-distribution of standard and variant Haplotypes, and identification of novel recombinant structures

Inhibitory Killer-cell Immunoglobulin-like Receptors (KIR) specific for HLA class I molecules enable human natural killer cells to monitor altered antigen presentation in pathogen-infected and tumor cells. KIR genes display extensive copy-number variation and allelic polymorphism. They organize in a series of variable arrangements, designated KIR haplotypes, which derive from duplications of ancestral genes and sequence diversification through point mutation and unequal crossing-over events. Genomic studies have established the organization of multiple KIR haplotypes-many of them are fixed in most human populations, whereas variants of those have less certain distributions. Whilst KIR-gene diversity of many populations and ethnicities has been explored superficially (frequencies of individual genes and presence/absence profiles), less abundant are in-depth analyses of how such diversity emerges from KIR-haplotype structures. We characterize here the genetic diversity of KIR in a sample of 414 Spanish individuals. Using a parsimonious approach, we manage to explain all 38 observed KIR-gene profiles by homo- or heterozygous combinations of six fixed centromeric and telomeric motifs; of six variant gene arrangements characterized previously by us and others; and of two novel haplotypes never detected before in Caucasoids. Associated to the latter haplotypes, we also identified the novel transcribed KIR2DL5B * 0020202 allele, and a chimeric KIR2DS2/KIR2DL3 gene (designated KIR2DL3 * 033) that challenges current criteria for classification and nomenclature of KIR genes and haplotypes.This work was supported by grants SAF2016-80363-C2-1/2-R (Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (MINECO)-FEDER, EU), and PCIN-2015-191-C02-02 (FP7-MINECO Infect-ERA program) to CV and ML-B. MM was supported by Fundación Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) grant GCB15152947MELE. EC was supported, successively, by grants SAF2010–22153-C03, Fundació La Marató de TV3 121531, and PCIN-2015-191-C02-02. AM was supported by Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)/FEDER grant PI19/00328

Human cytomegalovirus antigen presentation by HLA-DR+ NKG2C+ adaptive NK cells specifically activates polyfunctional effector memory CD4+ T lymphocytes

Natural killer (NK) cells play a dual role in the defense against viral pathogens by directly lysing infected cells as well as by regulating anti-viral T cell immunity. Infection by human cytomegalovirus (HCMV) promotes a persistent expansion of NKG2C+ adaptive NK cells which have been shown to display enhanced antibody-dependent responses against infected targets and associated to viral control in transplanted patients. Based on gene expression data showing increased transcription of CIITA and several genes related to the MHC class II pathway in adaptive NK cells, we explored their putative capacity for antigen presentation to CD4+ T cells. Phenotypic analysis confirmed a preferential steady-state expression of HLA-DR by circulating NKG2C+ adaptive NK cells in healthy individuals. Expression of HLA-DR in NKG2C+ adaptive NK cells was variable and unrelated to the expression of activation (i.e., CD69 and CD25) or differentiation (i.e., FcRγ chain, CD57) markers, remaining stable over time at the individual level. Incubation of purified NK cells with HCMV complexed with serum specific antibodies induced an up-regulation of surface HLA-DR concomitant to CD16 loss whereas no changes in CD80/CD86 co-stimulatory ligands were detected. In addition, surface CX3CR1 decreased upon antigen-loading while HLA-DR+ NK cells maintained a CCR7-, CXCR3low homing profile. Remarkably, HCMV-loaded purified NK cells activated autologous CD4+ T cells in an HLA-DR dependent manner. The fraction of T lymphocytes activated by antigen-loaded NK cells was smaller than that stimulated by monocyte-derived dendritic cells, corresponding to CD28-negative effector-memory CD4+ T cells with cytotoxic potential. Antigen presentation by NK cells activated a polyfunctional CD4+ T cell response characterized by degranulation (CD107a) and the secretion of Th1 cytokines (IFNγ and TNFα). Overall, our data discloses the capacity of NKG2C+ adaptive NK cells to process and present HCMV antigens to memory CD4+ cytotoxic T cells, directly regulating their response to the viral infection.The authors are supported by Plan Estatal I+D Retos (SAF2016-80363-C2-1-R/-2-R), Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (MINECO, FEDER); EU FP7-MINECO Infect-ERA program (PCIN-2015-191-C02-01/02); Fundación Española contra el Cáncer (GCB15152947MELE); Proyecto Integrado de Excelencia ISCIII (PIE 2015/00008); and Worldwide Cancer Research Foundation (15–1146)