Μελέτη των μηχανισμών μεμβρανικής διακίνησης και ενδοκύτωσης στον Aspergillus nidulans

Η κυτταρική ζωή απαιτεί τη συντονισμένη εκτέλεση διάφορων κυτταρικών διεργασιών – από την διαφορική μεταγραφή του DNA μέχρι την τελική αποικοδόμηση ή ανακύκλωση των γονιδιακών προϊόντων’ των πρωτεϊνών. Τα ευκαρυωτικά κύτταρα είναι οντότητες με υψηλή πολυπλοκότητα και διαμερισματοποίηση, η οποία απαιτεί τη διακίνηση υλικών και μορίων (όπως RNA, πρωτεΐνες, λιπίδια) μέσω του δικτύου των πολύπλοκων μεμβρανών και οργανιδίων τους, από ή προς το εξωκυτταρικό περιβάλλον, ή ακόμη και την μεταφορά ολόκληρων οργανιδίων μέσα στο κυτταρόπλασμα. Η σπουδαιότητα της μεμβρανικής διακίνησης για την ομοιόσταση ενός κυττάρου αντανακλάται συχνά σε θνησιγόνους φαινότυπους και γενετικές ασθένειες του ανθρώπου, όπως η κυστική ίνωση. Σε αυτή τη διδακτορική διατριβή, ερευνήσαμε διαφορετικές πτυχές της μεμβρανικής διακίνησης, χρησιμοποιώντας ως πρότυπο οργανισμό το νηματοειδή μύκητα Aspergillus nidulans. Αυτός ο ασκομύκητας χρησιμοποιείται ως σύστημα μοντέλο εξαιτίας της γενετικής και μοριακής ευελιξίας του, αλλά και των αναδυόμενων δυνατοτήτων του ως κυτταρικό (πρότυπο) σύστημα για τη μελέτη της μεμβρανικής διακίνησης και άλλων διεργασιών, οι οποίες εξαρτώνται από τους μικροσωληνίσκους. Η παρούσα διδακτορική διατριβή διαιρείται σε τρία τμήματα. Το πρώτο μέρος περιγράφει την ανάπτυξη ενός καινοτόμου γενετικού εργαλείου, το οποίο βασίζεται στην τεχνολογία των μεταθετών στοιχείων για την επιλογή υπομορφικών ή υπερμορφικών μεταλλαγμένων στελεχών του A. nidulans. Αυτό το εργαλείο μεταλλαξιγένεσης αναμένεται να χρησιμοποιηθεί στο μέλλον για την κλωνοποίηση γονιδίων που συμμετέχουν στην μεμβρανική διακίνηση. Το δεύτερο μέρος διερευνά τους μοριακούς μηχανισμούς, οι οποίοι σχετίζονται με την διακίνηση, τη διαλογή και αποικοδόμηση λανθασμένα διπλωμένων διαμεμβρανικών πρωτεϊνών. Τέλος, το τρίτο μέρος μελετά την μοριακή βάση της αλληλεπίδρασης μεταξύ των μικροσωληνίσκων και των μεμβρανών κατά την τοποθέτηση των πυρήνων και κατά την εξωκύτωση. Μέρος Ι. Για την ανάπτυξη ενός εργαλείου μετάθεσης, χρησιμοποιήσαμε ένα μεταθετό στοιχείο από την Drosophila hydeii, το οποίο ονομάζεται minos, και αποτελείται από δυο ανάστροφες επαναλήψεις 254 βάσεων, οι οποίες περιβάλλουν ένα γονίδιο μεταθετάσης. Το minos είχε ήδη δοκιμαστεί επιτυχώς σε διάφορα μετάζωα, σημειώνοντας αποδοτική συχνότητα στην διακοπή ανοικτών πλαισίων ανάγνωσης γονιδίων, σχεδόν χωρίς κάποια προτίμηση σε αλληλουχία εισδοχής. Τροποποιήσαμε το φυσικό μεταθετό minos, αφαιρώντας το γονίδιο της μεταθετάσης και εισάγοντας δυο γονίδια από τον Ασπέργιλλο: το yA, το οποίο κωδικοποιεί μια λακκάση των κονιδίων που παράγει την πράσινη χρωστική τους, και το inoB, το οποίο κωδικοποιεί την συνθάση της 1-φωσφορικής μυο-ινοσιτόλης, ένα ένζυμο απαραίτητο για την βιοσύνθεση της ινοσιτόλης. Το τροποποιημένο μεταθετό minos ενσωματώθηκε σε μία συγκεκριμένη θέση, -10 βάσεις πριν από την έναρξη του γονιδίου niaD, σε ένα στέλεχος, από το οποίο απουσίαζαν τα ενδογενή γονίδια yA και inoB, προκαλώντας την απενεργοποίηση της μεταγραφής του niaD. Το γονίδιο της μεταθετάσης δίχως ιντρόνια, υπό την ρύθμιση του υποκινητή gpdAmini του Ασπέργιλλου, ενσωματώθηκε σε τυχαία θέση μέσα στο γονιδίωμα. Αποκοπή του minos από την αρχική του θέση ενσωμάτωσης θα ενεργοποιούσε εκ νέου την μεταγραφή του γονιδίου niaD, το οποίο κωδικοποιεί μία αναγωγάση νιτρικών απαραίτητη για την αξιοποίηση των NO3- ως πηγή αζώτου. Έτσι, η επιλογή ενός συμβάντος μετάθεσης θα πραγματοποιούταν με επίστρωση κονιδίων σε θρεπτικό υπόστρωμα, το οποίο περιείχε NO3- ως μοναδική παροχή πηγής αζώτου. Το minos μετατίθεται επιτυχώς στον A. nidulans με συχνότητα μετάθεσης 0.21-5.6 x 10-6. Η αποκοπή του minos από την αρχική θέση αφήνει πίσω ένα αποτύπωμα από 4 βάσεις, οι οποίες περιβάλλονται από το δινουκλεοτίδιο ΤΑ. Το NkuA, μία πρωτεΐνη του συμπλόκου του μηχανισμού επιδιόρθωσης σύνδεσης μη-ομόλογων άκρων, αποδείχθηκε απαραίτητο για την επιδιόρθωση των σπασιμάτων της διπλής έλικας του DNA μετά την αποκοπή του minos από την αρχική θέση ενσωμάτωσής του. Το minos χρησιμοποιήθηκε δοκιμαστικά στην επιλογή μεταλλαγμένων στελεχών, τα οποία παρουσίαζαν μορφολογικούς φαινότυπους ή ανθεκτικότητα στην 5-φθορο-ουρακίλη. Ακόμη, έγινε επιλογή ορισμένων τυχαίων γεγονότων μετάθεσης. Η ανάλυση των αλληλουχιών DNA κοντά στο σημείο της ένθεσης έδειξε πως το minos μετατίθεται μέσα σε ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης, 5’ ή 3’ αμετάφραστες περιοχές εξωνίων, εσώνια, ρυθμιστικές αλληλουχίες πριν από την έναρξη των γονιδίων, ή σε αλληλουχίες ακριβώς μετά ή ενδιάμεσα σε γονίδια. Οι στόχοι του περιλάμβαναν μεταγραφικούς παράγοντες, κινάσες, ATPάσες, συνθάσες, μεταφορείς και μη χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες με άγνωστη λειτουργία. Οι αλλαγμένοι φαινότυποι ήταν αποτέλεσμα μεταγραφικής επαγωγής ή αρνητικής μεταγραφικής ρύθμισης ή διακοπή ανοικτών πλαισίων ανάγνωσης. Γι’ αυτό, το minos είναι ένα αποτελεσματικό και αποδοτικό εργαλείο για την επιλογή νέων γονιδίων βασιζόμενο σε φαινοτύπους, ανθεκτικότητα σε φάρμακα ή τοξικά ανάλογα, ή άλλα κριτήρια επιλογής. Μέρος ΙΙ. Στόχος του δεύτερου και κύριου μέρους αυτής της διατριβής ήταν η διευκρίνηση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση λανθασμένα διπλωμένων πολυτοπικών μεμβρανικών φορτίων. Οι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες διπλώνουν συμμεταφραστικά και ενσωματώνονται προοδευτικά στη μεμβράνη του ενδοπλασματικού δικτύου (ΕΔ). Το σωστό δίπλωμα των νεοσυντιθέμενων μορίων είναι κρίσιμο για τη λειτουργικότητα των πρωτεϊνών, και συχνά για την βιωσιμότητα του κυττάρου, καθώς η συσσωμάτωση μη διπλωμένων πρωτεϊνών προκαλεί κυτταροτοξικότητα και κυτταρικό θάνατο. Για το σκοπό μας, χρησιμοποιήσαμε μια ασταθή παραλλαγή μίας καλά μελετημένης διαμεμβρανικής πρωτεΐνης της πλασματικής μεμβράνης του A. nidulans, την περμεάση ξανθίνης-ουρικού οξέος, UapA, ως μοντέλο μη διπλωμένης πρωτεΐνης. Έχει αποδειχθεί προηγουμένως πως ο UapA ενδοκυτώνεται από την πλασματική μεμβράνη παρουσία πλούσιας πηγής αζώτου, όπως τα ιόντα NH4+, ή ως απόκριση σε πλεόνασμα των υποστρωμάτων του. Μετά την εσωτερίκευση, πραγματοποιείται διαλογή του UapA στα ενδοσώματα, ακολουθούμενη τελικώς από την αποικοδόμησή του στα χυμοτόπια. Η ενδοκύτωση του UapA απαιτεί προηγουμένως την ουβικιτινιλύωσή του στη λυσίνη 572 (Lys572) της καρβοξυτελικής κυτταροπλασματικής ουράς του από την Ε3 τύπου HECT λιγάση της ουβικιτίνης, HulARsp5. Μία πρωτεΐνη-προσαρμοστής, με όνομα ArtA, αλληλεπιδρά με την HulA μέσω του αμινοξικού μοτίβου PPxY και την στρατολογεί στην καρβοξυτελική ουρά του UapA. Ορισμένες μεταλλαγές στο γονίδιο uapA δημιουργούν ασταθή πρωτεϊνικά μόρια UapA, τα οποία συσσωρεύονται στο ΕΔ, εντοπίζονται ελάχιστα ή καθόλου στην πλασματική μεμβράνη και προωθούνται για αποικοδόμηση στο χυμοτόπιο, με αποτέλεσμα την απουσία λειτουργικότητας της πρωτεΐνης στο κύτταρο. Στην παρούσα εργασία, μελετήσαμε εκτενώς μια συγκεκριμένη παραλλαγή του UapA, η οποία φέρει έλλειψη της αργινίνης 481 (Arg481) στο 13ο διαμεμβρανικό τμήμα του UapA, και η οποία ονομάστηκε ΔR481. Παρατηρήσαμε πως η έκφραση του ΔR481 προκαλεί την ενεργοποίηση του μηχανισμού απόκρισης μη διπλωμένων πρωτεϊνών (unfolded protein response, UPR) και της αποικοδόμισης που σχετίζεται με το ΕΔ (ER-associated degradation, ERAD). Έτσι, επιβεβαιώσαμε πως το ΔR481 είναι πράγματι ένα μη σωστά διπλωμένο φορτίο. Ωστόσο, μια ενδιαφέρουσα παρατήρηση ήταν πως ορισμένα μόρια του ΔR481 διαφεύγουν του ERAD και κατευθύνονται κυρίως προς το χυμοτόπιο, αλλά και προς τη πλασματική μεμβράνη. Εστιάσαμε ειδικά στην κατανόηση του μηχανισμού της αποικοδόμησης του ΔR481 στο χυμοτόπιο. Η κύρια Ε3 τύπου HECT λιγάση της ουβικιτίνης, HulARsp5, αποδείχθηκε απαραίτητη για την στόχευση του ΔR481 στο χυμοτόπιο, ενώ η πρωτεΐνη-προσαρμοστής ArtA, η οποία συμμετέχει στην ενδοκύτωση του UapA, καθώς και ένας γενικός παράγοντας ενδοκύτωσης, ο SagAEnd3, δεν επηρέασαν τη διαδικασία, δείχνοντας πως η ενδοκύτωση συνεισφέρει ελάχιστα ή καθόλου στη στόχευση του ΔR481 στο χυμοτόπιο. Αυτά τα ευρήματα προτείνουν πως το ΔR481 αναγνωρίζεται ως μη σωστά διπλωμένο και επανα-προωθείται στο χυμοτόπιο κατά το βιοσυνθετικό μονοπάτι, πριν φτάσει στην πλασματική μεμβράνη. Μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη, η οποία εντοπίζεται στο ΕΔ, το BsdABsd2, φάνηκε να είναι απαραίτητη για την μη-ενδοκυτταρική αποικοδόμηση του ΔR481 στο χυμοτόπιο, πιθανώς μέσω αλληλεπίδρασης των αμινοξικών της μοτίβων, PPxY, με την λιγάση της ουβικιτίνης HulA. Απουσία του BsdA ή μεταλλαγές που αντικαθιστούν αμινοξέα μέσα στα μοτίβα PPxY, παρεμποδίζουν την καταστροφή του ΔR481, επιτρέποντας στην πλειονότητα των μορίων να φτάσουν στην πλασματική μεμβράνη. Παρά το σταθερό, συνεχόμενο εντοπισμό του ΔR481 στη πλασματική μεμβράνη σε γενετικό υπόβαθρο bsdAΔ, το ΔR481 δεν είχε λειτουργικότητα μεταφορέα και υπόκειτο «φυσιολογικά» στην ρύθμιση υπό το ενδοκυτταρικό μονοπάτι των ArtA-SagA-HulA. Σημαντικό εύρημα αυτής της εργασίας είναι πως η συσσώρευση του ΔR481 στο ΕΔ πυροδοτεί την αυτοφαγία και τη στρατολόγηση μιας βασικής πρωτεΐνης της αυτοφαγίας, της Atg8, στο ΕΔ. Το BsdA αποδείχτηκε απαραίτητο μόνο για την μεταγενέστερη αποικοδόμηση του ΔR481, καθώς η επαγωγή της αυτοφαγίας εξαιτίας της συσσώρευσης του ΔR481 στο ΕΔ παρέμενε ανεπηρέαστη στο γενετικό υπόβαθρο bsdAΔ. Η γενετική απενεργοποίηση της αυτοφαγίας μέσω μεταλλαγών στα βασικά γονίδια atg9 ή rabO παρεμπόδισε μόνο μερικώς την αποικοδόμηση του ΔR481, υποστηρίζοντας πως ένα άλλο μονοπάτι καταστροφής δρα παράλληλα. Η παρεμπόδιση της λειτουργικότητας του Golgi μέσω μιας θερμοευαίσθητης μεταλλαγής στην συνταξίνη SedV παρεμπόδισε επίσης μόνο μερικώς την αποικοδόμιση του ΔR481 στο χυμοτόπιο. Μόνο η ταυτόχρονη απενεργοποίηση τόσο της αυτοφαγίας όσο και της λειτουργικότητας του Golgi κατάφερε να εμποδίσει πλήρως την καταστροφή του ΔR481 στο χυμοτόπιο. Συμπερασματικά, πολλαπλά μονοπάτια δραστηριοποιούνται για την αποτοξίνωση των κυττάρων από λανθασμένα διπλωμένα φορτία. Μέρος ΙΙΙ. Στο τρίτο μέρος της διατριβής, ακολουθήσαμε τη μετακίνηση των πυρήνων και των εκκριτικών κυστιδίων στις υφές του A. nidulans. Οι νηματοειδείς μύκητες, όπως ο A. nidulans, επιμηκύνονται συνεχώς μέσω ακραίας επέκτασης, μια διαδικασία η οποία απαιτεί στοχευμένη έκκριση και ενδοκυτταρική ανακύκλωση στην κορυφή της υφής (tip). Κατά τα πρώτα στάδια της εκβλάστησης του μύκητα, η πολικότητα εγκαθιδρύεται και έκτοτε διατηρείται καθ’ όλη τη διάρκεια της ζωής του. Η κατευθυνόμενη αύξηση στην άκρη της υφής απαιτεί συνεχόμενη πολική μετακίνηση λιπιδίων και ενζύμων, μεμβρανική αναδιοργάνωση και ανακύκλωση φορτίων στην άκρη της υφής, διαδικασίες οι οποίες εμπλέκουν τους μικροσωληνίσκους και την F-ακτίνη. Οι μικροσωληνίσκοι παίζουν σημαντικό ρόλο στην μίτωση, καθώς σχηματίζουν την μιτωτική άτρακτο, αλλά και κατά τη διάρκεια της μεσόφασης στην κατανομή των πυρήνων και στην κυστιδιακή μετακίνηση. Σε αυτό το μέρος της διατριβής, εστιάσαμε στην λειτουργία πρωτεϊνών του κυτταρικού φλοιού, οι οποίες σχετίζονται με τους μικροσωληνίσκους. Προηγούμενες αναφορές είχαν χαρακτηρίσει τη δράση της πρωτεΐνης ApsANum1, μιας μεμβρανικής, αγκυροβολημένης πρωτεΐνης του φλοιού, η οποία αλληλεπιδρά με τους αστρικούς μικροσωληνίσκους κατά τη διάρκεια της μίτωσης, βοηθώντας στη δημιουργία ελκτικών δυνάμεων, οι οποίες απομακρύνουν περαιτέρω τους δύο πόλους της ατράκτου. Η ApsC, μια πρωτεΐνη με ομοιότητα ως προς την ApsA, ταυτοποιήθηκε ως δεύτερο ομόλογο της πρωτεΐνης Num1 του Saccharomyces cerevisiae. H ApsC εντοπίζεται σε συγκεκριμένες επικράτειες της πλασματικής μεμβράνης στον κεντρικό πόρο των σέπτων και στοχεύεται συνεχόμενα στην κορυφή της υφής, υποδεικνύοντας ένα ρόλο στην πολική αύξηση και την έκκριση. Χρησιμοποιώντας το σύστημα ανασύστασης φθορισμού split YFP, αποδείξαμε αλληλεπίδραση μεταξύ της ApsA και ApsC στον κυτταρικό φλοιό, αλλά και με την κινεσίνη UncA, η οποία μετακινεί ενδοσώματα και εκκριτικά κυστίδια πάνω στους μικροσωληνίσκους, τη μυοσίνη MyoV, η οποία μετακινεί εκκριτικά κυστίδια πάνω στην F-ακτίνη, και τη διαμεμβρανική συνθάση της χιτίνης, ChsB, η οποία εκκρίνεται μέσω κυστιδίων στις θέσεις της αύξησης στην άκρη της υφής. Βασιζόμενο στις δοκιμές αλληλεπίδρασης και στην in vivo μικροσκοπία της ApsC, το μοντέλο μας προτείνει ότι η ApsC θα μπορούσε να εντοπίζεται σε εκκριτικά κυστίδια, τα οποία μετακινούνται από τους μικροσωληνίσκους στην F-ακτίνη, μέχρι τελικώς να συντηχθούν με την πλασματική μεμβράνη στο πολικό σημείο της αύξησης.Cell life demands the coordinated execution of various cellular processes - from the differential transcription of the DNA to the final degradation or recycling of the gene products: the proteins. Eukaryotic cells are unities with high complexity and compartmentalization, requesting trafficking of material and molecules (e.g. RNA, protein, lipids) through their network of complex membranes and organelles, from or towards the extracellular environment or even the transport of complete organelles in the cytoplasm. The importance of trafficking in cell homeostasis is often reflected in lethal phenotypes and genetic diseases, such as cystic fibrosis. In this PhD Thesis, we investigated different aspects of membrane trafficking using the model filamentous fungus Aspergillus nidulans. This ascomycete is generally selected as a model system due to its genetic and molecular tractability, but also for its emerging power as a cellular system to study membrane trafficking and other microtubule-dependent processes. The PhD thesis is divided into three parts. The first part describes the development of a novel transposon-based tool for selecting hypomorphic or hypermorphic A. nidulans mutants. This mutagenesis tool is expected to be used to identify trafficking mutants in the future. The second part investigates the molecular mechanisms involved in trafficking, sorting and degradation of misfolded transmembrane protein cargoes. Finally, the third part studies the molecular basis of interaction between microtubules and membranes during nuclear positioning and secretion. Part I. To develop a new transposon-based tool, we made use of a transposon from Drosophila hydeii, named minos, consisting of two inverted repeats of 254 bp flanking a transposase gene. Minos had been already successfully tested in several metazoans, showing an efficient frequency to interrupt open reading frames of genes in rather unbiased way. We modified minos, removing the transposase gene and introducing two Aspergillus genes; the yA, encoding for a conidial laccase involved in the green pigmentation of conidia and the inoB, encoding myo-inositol-1-phosphate synthase, an enzyme necessary for inositol biosynthesis. The modified minos element was introduced in a strain lacking the endogenous yA and inoB genes, in a specific initial position, in the -10 bp of the niaD gene, resulting in the inactivation of the transcription of niaD. The intron-less transposase, under the regulation of an Aspergillus promoter, gpdAmini, was inserted in a random position inside the genome. Excision of minos from the initial insertion site, would reactivate the transcription of niaD, encoding a nitrate reductase necessary to utilize NO3- as a nitrogen source. Thus, selection of a transposition event would be carried out by plating conidia on medium supplemented with NO3- as sole nitrogen source. Minos was able to transpose in A. nidulans with a transposition frequency of 0.21-5.6 x 10-6. Excision of minos from the initial site left a footprint of 4 bp flanked by the TA dinucleotide. The NkuA, a component of the non-homologous end joint repair complex was found necessary to repair the breaks in the double strand of DNA after the excision of minos from the initial insertion site. Minos was used in a screen for morphological mutants, 5-fluorouracil resistant mutants or of random integration events. The DNA sequence analysis of the insertion sites showed that minos transposes into open reading frames, 5’ UTR or 3’ UTR of exons, introns, upstream regulatory sequences, downstream and intergenic sequences. Its target sequences include transcription factors, kinases, ATPases, synthases, transporters and uncharacterized proteins with unknown function. Altered phenotypes were the result of transcriptional up-regulation, down-regulation and disruption of the tagged ORF. Thus, minos is an efficient, robust tool to select for new genes based on phenotypes, drug and toxic analogue resistance or other selection criteria. Part II. In the second and main part of this study, we aimed at elucidating the molecular mechanisms involved in the turnover of misfolded polytopic membrane cargoes. Transmembrane proteins fold co-translationally and integrate progressively into the membrane of the endoplasmic reticulum (ER). Proper folding of newly-synthesized molecules is crucial for protein function and often cell viability, as aggregation of unfolded molecules causes cytotoxicity and cell death. For our purposes, we used an unstable version of a well-studied plasma membrane transmembrane protein of A. nidulans, the UapA xanthine-uric acid transporter, as a model unfolded cargo. UapA has been previously shown to be endocytosed from the plasma membrane upon a shift to a favored nitrogen source, such as NH4+, or in response to excess of substrates. After its internalization, UapA is sorted into endosomes and is finally degraded into vacuoles. The endocytic internalization of UapA requires its prior ubiquitination at the C-terminal Lys572 by E3 HECT ubiquitin ligase, HulARsp5. An adaptor protein, named ArtA, interacts with HulA through its PPxY motifs, recruiting HulA to the c-tail of UapA. Several uapA mutations result in apparently unstable UapA protein molecules, which accumulate into the ER, show little or no plasma membrane localization, are highly re-directed and degraded in the vacuole, and thus have no function. For the present work, we studied exclusively a specfic UapA mutant carrying a deletion of Arg481 in the 13th transmembrane segment of UapA, named ΔR481. We observed that expression of ΔR481 leads to activation of the unfolded protein response (UPR) and ER-associated degradation (ERAD). Thus, we conformed that ΔR481 is indeed a misfolded cargo. Interestingly however, we also noticed that a fraction of ΔR481 escapes ERAD and is re-directed mainly to the vacuole, but also to the PM. We focused specifically on understanding the mechanism of the vacuolar degradation of ΔR481. The major E3 HECT type ubiquitin ligase, HulA, was found to be necessary for the vacuolar targeting of ΔR481, although the arrestin-like protein adaptor, ArtA, necessary for the endocytosis of UapA and a general endocytic factor, SagAEnd3, had no impact on the process, suggesting that endocytosis contributes little or not at all to the vacuolar sorting. These findings suggest that ΔR481 is recognized and re-directed to the vacuole along the secretory pathway, prior to its localization to the plasma membrane. A transmembrane protein, located in the ER, named BsdABsd2, was identified to be necessary for the non-endocytic vacuolar degradation of ΔR481, probably interacting with HulA via its PPxY motifs. Lack of BsdA or mutations affecting its PPxY motifs blocked the vacuolar degradation of ΔR481, allowing most of the molecules to be re-directed to the plasma membrane. Despite being stably localized in the PM in a bsdAΔ background, ΔR481 showed no transport function and was ‘normally’ subject to the endocytic regulation under the ArtA-SagA-HulA pathway. Importantly, we observed that accumulation of ΔR481 in the ER also triggers autophagy and recruitment of the key autophagy protein, Atg8, in the ER. BsdA proved necessary solely for the downstream vacuolar degradation of ΔR481, as induction of autophagy by ΔR481 accumulation in the ER was still evident in the bsdAΔ genetic background. Surprisingly, genetically blocking autophagy, through mutations in the necessary genes, atg9 or rabO, only partially impairs degradation of ΔR481, suggesting that still another route for ΔR481 degradation exists. Impairing Golgi trafficking, using a thermosensitive version of syntaxin SedV, also only partially impaired the vacuolar degradation of ΔR481 either. Only the simultaneous blocking of both autophagy and Golgi functioning was able to completely prevent the vacuolar turnover of ΔR481. Thus, multiple pathways operate to detoxify cells from misfolded membrane cargoes. Part III. In the third part of this Thesis, we followed the transport of nuclei and secretory vesicles in the hyphal body of A. nidulans. Filamentous fungi, such as A. nidulans, continuously elongate through apical extension, a process demanding targeted secretion and endocytic recycling at the tip of the hyphae. From the early stages of germination, polarity is established and then, maintained. Directed tip growth demands continuous polar transport of lipids and enzymes, membrane re-organization and cargo recycling at the tip; processes involving microtubules (MTs) and F-actin. Microtubules play an important role in mitosis, as they form the mitotic spindle, but also during interphase in nuclei distribution and vesicle transport. In this part of the Thesis, we focus on the function of cell cortex proteins associating with MTs. Previous reports had characterized the function of a protein, named ApsANum1, a membrane anchored cortical protein, which interacts with astral MTs during mitosis, assisting in the generation of pulling forces that further move the two spindle poles away. ApsC, an ApsA-like protein, was identified as a second homologue of the Saccharomyces cerevisiae protein, Num1. ApsC localizes in specific domains of the plasma membrane, in the central pore of the septa and is continuously targeted at the tip, suggesting a role in polar growth and secretion. Using the split YFP system we have shown interaction between ApsA and ApsC at the cell cortex, but also with UncA, a kinesin transporting endosomes and secretory vesicles on MTs, MyoV, a motor protein transporting secretory vesicles on

Dynamics of actin cables in polarized growth of the filamentous fungus Aspergillus nidulans

Highly polarized growth of filamentous fungi requires a continuous supply of proteins and lipids to the hyphal tip. This transport is managed by vesicle trafficking via the actin and microtubule cytoskeletons and their associated motor proteins. Particularly, actin cables originating from the hyphal tip are essential for hyphal growth. Although, specific marker proteins have been developed to visualize actin cables in filamentous fungi, the exact organization and dynamics of actin cables has remained elusive. Here, we observed actin cables using tropomyosin (TpmA) and Lifeact fused to fluorescent proteins in living Aspergillus nidulans hyphae and studied the dynamics and regulation. GFP tagged TpmA visualized dynamic actin cables formed from the hyphal tip with cycles of elongation and shrinkage. The elongation and shrinkage rates of actin cables were similar and approximately 0.6 μm/s. Comparison of actin markers revealed that high concentrations of Lifeact reduced actin dynamics. Simultaneous visualization of actin cables and microtubules suggests temporally and spatially coordinated polymerization and depolymerization between the two cytoskeletons. Our results provide new insights into the molecular mechanism of ordered polarized growth regulated by actin cables and microtubules

Superresolution and pulse-chase imaging reveal the role of vesicle transport in polar growth of fungal cells

Polarized growth of filamentous fungi requires continuous transport of biomolecules to the hyphal tip. To this end, construction materials are packaged in vesicles and transported by motor proteins along microtubules and actin filaments. We have studied these processes with quantitative superresolution localization microscopy of live Aspergillus nidulans cells expressing the photoconvertible protein mEosFPthermo fused to the chitin synthase ChsB. ChsB is mainly located at the Spitzenkörper near the hyphal tip and produces chitin, a key component of the cell wall. We have visualized the pulsatory dynamics of the Spitzenkörper, reflecting vesicle accumulation before exocytosis and their subsequent fusion with the apical plasma membrane. Furthermore, high-speed pulse-chase imaging after photoconversion of mEosFPthermo in a tightly focused spot revealed that ChsB is transported with two different speeds from the cell body to the hyphal tip and vice versa. Comparative analysis using motor protein deletion mutants allowed us to assign the fast movements (7 to 10 μm s−1) to transport of secretory vesicles by kinesin-1, and the slower ones (2 to 7 μm s−1) to transport by kinesin-3 on early endosomes. Our results show how motor proteins ensure the supply of vesicles to the hyphal tip, where temporally regulated exocytosis results in stepwise tip extension

Effects of Laser Welding on Formability Aspects of Advanced High Strength Steel

Limiting dome height (LDH) tests were used to evaluate the formability of both base metal and laser butt welded blanks of AHSS (including High strength low alloy (HSLA), Dual phase (DP) steels of different grades). Mechanical properties of the base metal and welded blanks were assessed by uniaxial tensile and biaxial LDH tests, and related to measured microhardness distributions across the welds. The formability ratio of laser welded dual phase sheet steels generally decreases with increased base metal strength. A significant decrease of LDH was observed in the higher strength DP steel welded specimens due to the formation of a softened zone in the Heat Affected Zone(HAZ). Softened zone characteristics were correlated to the LDH. Larger softened zones led to a larger reduction in the LDH. HAZ softening has been shown to be a function of the base metal martensite content and the weld heat input. Formability also decreased with increased weld heat input. Both in experiment and numerical simulations strain is localized in the softened HAZ in the uniaxial tensile testing, indicating that strain localization decreases tensile strength and elongation of laser welds in DP980

Μελέτη των μηχανισμών μεμβρανικής διακίνησης και ενδοκύτωσης στον Aspergillus nidulans

Cell life demands the coordinated execution of various cellular processes - from the differential transcription of the DNA to the final degradation or recycling of the gene products: the proteins. Eukaryotic cells are unities with high complexity and compartmentalization, requesting trafficking of material and molecules (e.g. RNA, protein, lipids) through their network of complex membranes and organelles, from or towards the extracellular environment or even the transport of complete organelles in the cytoplasm. The importance of trafficking in cell homeostasis is often reflected in lethal phenotypes and genetic diseases, such as cystic fibrosis. In this PhD Thesis, we investigated different aspects of membrane trafficking using the model filamentous fungus Aspergillus nidulans. This ascomycete is generally selected as a model system due to its genetic and molecular tractability, but also for its emerging power as a cellular system to study membrane trafficking and other microtubule-dependent processes. The PhD thesis is divided into three parts. The first part describes the development of a novel transposon-based tool for selecting hypomorphic or hypermorphic A. nidulans mutants. This mutagenesis tool is expected to be used to identify trafficking mutants in the future. The second part investigates the molecular mechanisms involved in trafficking, sorting and degradation of misfolded transmembrane protein cargoes. Finally, the third part studies the molecular basis of interaction between microtubules and membranes during nuclear positioning and secretion.Part I. To develop a new transposon-based tool, we made use of a transposon from Drosophila hydeii, named minos, consisting of two inverted repeats of 254 bp flanking a transposase gene. Minos had been already successfully tested in several metazoans, showing an efficient frequency to interrupt open reading frames of genes in rather unbiased way. We modified minos, removing the transposase gene and introducing two Aspergillus genes; the yA, encoding for a conidial laccase involved in the green pigmentation of conidia and the inoB, encoding myo-inositol-1-phosphate synthase, an enzyme necessary for inositol biosynthesis. The modified minos element was introduced in a strain lacking the endogenous yA and inoB genes, in a specific initial position, in the -10 bp of the niaD gene, resulting in the inactivation of the transcription of niaD. The intron-less transposase, under the regulation of an Aspergillus promoter, gpdAmini, was inserted in a random position inside the genome. Excision of minos from the initial insertion site, would reactivate the transcription of niaD, encoding a nitrate reductase necessary to utilize NO3- as a nitrogen source. Thus, selection of a transposition event would be carried out by plating conidia on medium supplemented with NO3- as sole nitrogen source. Minos was able to transpose in A. nidulans with a transposition frequency of 0.21-5.6 x 10-6. Excision of minos from the initial site left a footprint of 4 bp flanked by the TA dinucleotide. The NkuA, a component of the non-homologous end joint repair complex was found necessary to repair the breaks in the double strand of DNA after the excision of minos from the initial insertion site. Minos was used in a screen for morphological mutants, 5-fluorouracil resistant mutants or of random integration events. The DNA sequence analysis of the insertion sites showed that minos transposes into open reading frames, 5’ UTR or 3’ UTR of exons, introns, upstream regulatory sequences, downstream and intergenic sequences. Its target sequences include transcription factors, kinases, ATPases, synthases, transporters and uncharacterized proteins with unknown function. Altered phenotypes were the result of transcriptional up-regulation, down-regulation and disruption of the tagged ORF. Thus, minos is an efficient, robust tool to select for new genes based on phenotypes, drug and toxic analogue resistance or other selection criteria.Part II. In the second and main part of this study, we aimed at elucidating the molecular mechanisms involved in the turnover of misfolded polytopic membrane cargoes. Transmembrane proteins fold co-translationally and integrate progressively into the membrane of the endoplasmic reticulum (ER). Proper folding of newly-synthesized molecules is crucial for protein function and often cell viability, as aggregation of unfolded molecules causes cytotoxicity and cell death. For our purposes, we used an unstable version of a well-studied plasma membrane transmembrane protein of A. nidulans, the UapA xanthine-uric acid transporter, as a model unfolded cargo. UapA has been previously shown to be endocytosed from the plasma membrane upon a shift to a favored nitrogen source, such as NH4+, or in response to excess of substrates. After its internalization, UapA is sorted into endosomes and is finally degraded into vacuoles. The endocytic internalization of UapA requires its prior ubiquitination at the C-terminal Lys572 by E3 HECT ubiquitin ligase, HulARsp5. An adaptor protein, named ArtA, interacts with HulA through its PPxY motifs, recruiting HulA to the c-tail of UapA.Several uapA mutations result in apparently unstable UapA protein molecules, which accumulate into the ER, show little or no plasma membrane localization, are highly re-directed and degraded in the vacuole, and thus have no function. For the present work, we studied exclusively a specfic UapA mutant carrying a deletion of Arg481 in the 13th transmembrane segment of UapA, named ΔR481. We observed that expression of ΔR481 leads to activation of the unfolded protein response (UPR) and ER-associated degradation (ERAD). Thus, we conformed that ΔR481 is indeed a misfolded cargo. Interestingly however, we also noticed that a fraction of ΔR481 escapes ERAD and is re-directed mainly to the vacuole, but also to the PM. We focused specifically on understanding the mechanism of the vacuolar degradation of ΔR481. The major E3 HECT type ubiquitin ligase, HulA, was found to be necessary for the vacuolar targeting of ΔR481, although the arrestin-like protein adaptor, ArtA, necessary for the endocytosis of UapA and a general endocytic factor, SagAEnd3, had no impact on the process, suggesting that endocytosis contributes little or not at all to the vacuolar sorting. These findings suggest that ΔR481 is recognized and re-directed to the vacuole along the secretory pathway, prior to its localization to the plasma membrane. A transmembrane protein, located in the ER, named BsdABsd2, was identified to be necessary for the non-endocytic vacuolar degradation of ΔR481, probably interacting with HulA via its PPxY motifs. Lack of BsdA or mutations affecting its PPxY motifs blocked the vacuolar degradation of ΔR481, allowing most of the molecules to be re-directed to the plasma membrane. Despite being stably localized in the PM in a bsdAΔ background, ΔR481 showed no transport function and was ‘normally’ subject to the endocytic regulation under the ArtA-SagA-HulA pathway. Importantly, we observed that accumulation of ΔR481 in the ER also triggers autophagy and recruitment of the key autophagy protein, Atg8, in the ER. BsdA proved necessary solely for the downstream vacuolar degradation of ΔR481, as induction of autophagy by ΔR481 accumulation in the ER was still evident in the bsdAΔ genetic background. Surprisingly, genetically blocking autophagy, through mutations in the necessary genes, atg9 or rabO, only partially impairs degradation of ΔR481, suggesting that still another route for ΔR481 degradation exists. Impairing Golgi trafficking, using a thermosensitive version of syntaxin SedV, also only partially impaired the vacuolar degradation of ΔR481 either. Only the simultaneous blocking of both autophagy and Golgi functioning was able to completely prevent the vacuolar turnover of ΔR481. Thus, multiple pathways operate to detoxify cells from misfolded membrane cargoes. Part III. In the third part of this Thesis, we followed the transport of nuclei and secretory vesicles in the hyphal body of A. nidulans. Filamentous fungi, such as A. nidulans, continuously elongate through apical extension, a process demanding targeted secretion and endocytic recycling at the tip of the hyphae. From the early stages of germination, polarity is established and then, maintained. Directed tip growth demands continuous polar transport of lipids and enzymes, membrane re-organization and cargo recycling at the tip; processes involving microtubules (MTs) and F-actin. Microtubules play an important role in mitosis, as they form the mitotic spindle, but also during interphase in nuclei distribution and vesicle transport. In this part of the Thesis, we focus on the function of cell cortex proteins associating with MTs. Previous reports had characterized the function of a protein, named ApsANum1, a membrane anchored cortical protein, which interacts with astral MTs during mitosis, assisting in the generation of pulling forces that further move the two spindle poles away. ApsC, an ApsA-like protein, was identified as a second homologue of the Saccharomyces cerevisiae protein, Num1. ApsC localizes in specific domains of the plasma membrane, in the central pore of the septa and is continuously targeted at the tip, suggesting a role in polar growth and secretion. Using the split YFP system we have shown interaction between ApsA and ApsC at the cell cortex, but also with UncA, a kinesin transporting endosomes and secretory vesicles on MTs, MyoV, a motor protein transporting secretory vesicles on F-actin and ChsB, a transmembrane chitin synthase, heavily secreted in vesicles at the extension sites at the tip. Based on the interaction assays and the in vivo microscopy of ApsC, our model suggests that ApsC could localize at secretory vesicles, which move from MTs to F-actin until they finally merge with the PM at the polar site of growth.Η κυτταρική ζωή απαιτεί τη συντονισμένη εκτέλεση διάφορων κυτταρικών διεργασιών – από την διαφορική μεταγραφή του DNA μέχρι την τελική αποικοδόμηση ή ανακύκλωση των γονιδιακών προϊόντων’ των πρωτεϊνών. Τα ευκαρυωτικά κύτταρα είναι οντότητες με υψηλή πολυπλοκότητα και διαμερισματοποίηση, η οποία απαιτεί τη διακίνηση υλικών και μορίων (όπως RNA, πρωτεΐνες, λιπίδια) μέσω του δικτύου των πολύπλοκων μεμβρανών και οργανιδίων τους, από ή προς το εξωκυτταρικό περιβάλλον, ή ακόμη και την μεταφορά ολόκληρων οργανιδίων μέσα στο κυτταρόπλασμα. Η σπουδαιότητα της μεμβρανικής διακίνησης για την ομοιόσταση ενός κυττάρου αντανακλάται συχνά σε θνησιγόνους φαινότυπους και γενετικές ασθένειες του ανθρώπου, όπως η κυστική ίνωση. Σε αυτή τη διδακτορική διατριβή, ερευνήσαμε διαφορετικές πτυχές της μεμβρανικής διακίνησης, χρησιμοποιώντας ως πρότυπο οργανισμό το νηματοειδή μύκητα Aspergillus nidulans. Αυτός ο ασκομύκητας χρησιμοποιείται ως σύστημα μοντέλο εξαιτίας της γενετικής και μοριακής ευελιξίας του, αλλά και των αναδυόμενων δυνατοτήτων του ως κυτταρικό (πρότυπο) σύστημα για τη μελέτη της μεμβρανικής διακίνησης και άλλων διεργασιών, οι οποίες εξαρτώνται από τους μικροσωληνίσκους.Η παρούσα διδακτορική διατριβή διαιρείται σε τρία τμήματα. Το πρώτο μέρος περιγράφει την ανάπτυξη ενός καινοτόμου γενετικού εργαλείου, το οποίο βασίζεται στην τεχνολογία των μεταθετών στοιχείων για την επιλογή υπομορφικών ή υπερμορφικών μεταλλαγμένων στελεχών του A. nidulans. Αυτό το εργαλείο μεταλλαξιγένεσης αναμένεται να χρησιμοποιηθεί στο μέλλον για την κλωνοποίηση γονιδίων που συμμετέχουν στην μεμβρανική διακίνηση. Το δεύτερο μέρος διερευνά τους μοριακούς μηχανισμούς, οι οποίοι σχετίζονται με την διακίνηση, τη διαλογή και αποικοδόμηση λανθασμένα διπλωμένων διαμεμβρανικών πρωτεϊνών. Τέλος, το τρίτο μέρος μελετά την μοριακή βάση της αλληλεπίδρασης μεταξύ των μικροσωληνίσκων και των μεμβρανών κατά την τοποθέτηση των πυρήνων και κατά την εξωκύτωση.Μέρος Ι. Για την ανάπτυξη ενός εργαλείου μετάθεσης, χρησιμοποιήσαμε ένα μεταθετό στοιχείο από την Drosophila hydeii, το οποίο ονομάζεται minos, και αποτελείται από δυο ανάστροφες επαναλήψεις 254 βάσεων, οι οποίες περιβάλλουν ένα γονίδιο μεταθετάσης. Το minos είχε ήδη δοκιμαστεί επιτυχώς σε διάφορα μετάζωα, σημειώνοντας αποδοτική συχνότητα στην διακοπή ανοικτών πλαισίων ανάγνωσης γονιδίων, σχεδόν χωρίς κάποια προτίμηση σε αλληλουχία εισδοχής. Τροποποιήσαμε το φυσικό μεταθετό minos, αφαιρώντας το γονίδιο της μεταθετάσης και εισάγοντας δυο γονίδια από τον Ασπέργιλλο: το yA, το οποίο κωδικοποιεί μια λακκάση των κονιδίων που παράγει την πράσινη χρωστική τους, και το inoB, το οποίο κωδικοποιεί την συνθάση της 1-φωσφορικής μυο-ινοσιτόλης, ένα ένζυμο απαραίτητο για την βιοσύνθεση της ινοσιτόλης. Το τροποποιημένο μεταθετό minos ενσωματώθηκε σε μία συγκεκριμένη θέση, -10 βάσεις πριν από την έναρξη του γονιδίου niaD, σε ένα στέλεχος, από το οποίο απουσίαζαν τα ενδογενή γονίδια yA και inoB, προκαλώντας την απενεργοποίηση της μεταγραφής του niaD. Το γονίδιο της μεταθετάσης δίχως ιντρόνια, υπό την ρύθμιση του υποκινητή gpdAmini του Ασπέργιλλου, ενσωματώθηκε σε τυχαία θέση μέσα στο γονιδίωμα. Αποκοπή του minos από την αρχική του θέση ενσωμάτωσης θα ενεργοποιούσε εκ νέου την μεταγραφή του γονιδίου niaD, το οποίο κωδικοποιεί μία αναγωγάση νιτρικών απαραίτητη για την αξιοποίηση των NO3- ως πηγή αζώτου. Έτσι, η επιλογή ενός συμβάντος μετάθεσης θα πραγματοποιούταν με επίστρωση κονιδίων σε θρεπτικό υπόστρωμα, το οποίο περιείχε NO3- ως μοναδική παροχή πηγής αζώτου. Το minos μετατίθεται επιτυχώς στον A. nidulans με συχνότητα μετάθεσης 0.21-5.6 x 10-6. Η αποκοπή του minos από την αρχική θέση αφήνει πίσω ένα αποτύπωμα από 4 βάσεις, οι οποίες περιβάλλονται από το δινουκλεοτίδιο ΤΑ. Το NkuA, μία πρωτεΐνη του συμπλόκου του μηχανισμού επιδιόρθωσης σύνδεσης μη-ομόλογων άκρων, αποδείχθηκε απαραίτητο για την επιδιόρθωση των σπασιμάτων της διπλής έλικας του DNA μετά την αποκοπή του minos από την αρχική θέση ενσωμάτωσής του. Το minos χρησιμοποιήθηκε δοκιμαστικά στην επιλογή μεταλλαγμένων στελεχών, τα οποία παρουσίαζαν μορφολογικούς φαινότυπους ή ανθεκτικότητα στην 5-φθορο-ουρακίλη. Ακόμη, έγινε επιλογή ορισμένων τυχαίων γεγονότων μετάθεσης. Η ανάλυση των αλληλουχιών DNA κοντά στο σημείο της ένθεσης έδειξε πως το minos μετατίθεται μέσα σε ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης, 5’ ή 3’ αμετάφραστες περιοχές εξωνίων, εσώνια, ρυθμιστικές αλληλουχίες πριν από την έναρξη των γονιδίων, ή σε αλληλουχίες ακριβώς μετά ή ενδιάμεσα σε γονίδια. Οι στόχοι του περιλάμβαναν μεταγραφικούς παράγοντες, κινάσες, ATPάσες, συνθάσες, μεταφορείς και μη χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες με άγνωστη λειτουργία. Οι αλλαγμένοι φαινότυποι ήταν αποτέλεσμα μεταγραφικής επαγωγής ή αρνητικής μεταγραφικής ρύθμισης ή διακοπή ανοικτών πλαισίων ανάγνωσης. Γι’ αυτό, το minos είναι ένα αποτελεσματικό και αποδοτικό εργαλείο για την επιλογή νέων γονιδίων βασιζόμενο σε φαινοτύπους, ανθεκτικότητα σε φάρμακα ή τοξικά ανάλογα, ή άλλα κριτήρια επιλογής.Μέρος ΙΙ. Στόχος του δεύτερου και κύριου μέρους αυτής της διατριβής ήταν η διευκρίνηση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση λανθασμένα διπλωμένων πολυτοπικών μεμβρανικών φορτίων. Οι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες διπλώνουν συμμεταφραστικά και ενσωματώνονται προοδευτικά στη μεμβράνη του ενδοπλασματικού δικτύου (ΕΔ). Το σωστό δίπλωμα των νεοσυντιθέμενων μορίων είναι κρίσιμο για τη λειτουργικότητα των πρωτεϊνών, και συχνά για την βιωσιμότητα του κυττάρου, καθώς η συσσωμάτωση μη διπλωμένων πρωτεϊνών προκαλεί κυτταροτοξικότητα και κυτταρικό θάνατο. Για το σκοπό μας, χρησιμοποιήσαμε μια ασταθή παραλλαγή μίας καλά μελετημένης διαμεμβρανικής πρωτεΐνης της πλασματικής μεμβράνης του A. nidulans, την περμεάση ξανθίνης-ουρικού οξέος, UapA, ως μοντέλο μη διπλωμένης πρωτεΐνης. Έχει αποδειχθεί προηγουμένως πως ο UapA ενδοκυτώνεται από την πλασματική μεμβράνη παρουσία πλούσιας πηγής αζώτου, όπως τα ιόντα NH4+, ή ως απόκριση σε πλεόνασμα των υποστρωμάτων του. Μετά την εσωτερίκευση, πραγματοποιείται διαλογή του UapA στα ενδοσώματα, ακολουθούμενη τελικώς από την αποικοδόμησή του στα χυμοτόπια. Η ενδοκύτωση του UapA απαιτεί προηγουμένως την ουβικιτινιλύωσή του στη λυσίνη 572 (Lys572) της καρβοξυτελικής κυτταροπλασματικής ουράς του από την Ε3 τύπου HECT λιγάση της ουβικιτίνης, HulARsp5. Μία πρωτεΐνη-προσαρμοστής, με όνομα ArtA, αλληλεπιδρά με την HulA μέσω του αμινοξικού μοτίβου PPxY και την στρατολογεί στην καρβοξυτελική ουρά του UapA.Ορισμένες μεταλλαγές στο γονίδιο uapA δημιουργούν ασταθή πρωτεϊνικά μόρια UapA, τα οποία συσσωρεύονται στο ΕΔ, εντοπίζονται ελάχιστα ή καθόλου στην πλασματική μεμβράνη και προωθούνται για αποικοδόμηση στο χυμοτόπιο, με αποτέλεσμα την απουσία λειτουργικότητας της πρωτεΐνης στο κύτταρο. Στην παρούσα εργασία, μελετήσαμε εκτενώς μια συγκεκριμένη παραλλαγή του UapA, η οποία φέρει έλλειψη της αργινίνης 481 (Arg481) στο 13ο διαμεμβρανικό τμήμα του UapA, και η οποία ονομάστηκε ΔR481. Παρατηρήσαμε πως η έκφραση του ΔR481 προκαλεί την ενεργοποίηση του μηχανισμού απόκρισης μη διπλωμένων πρωτεϊνών (unfolded protein response, UPR) και της αποικοδόμισης που σχετίζεται με το ΕΔ (ER-associated degradation, ERAD). Έτσι, επιβεβαιώσαμε πως το ΔR481 είναι πράγματι ένα μη σωστά διπλωμένο φορτίο. Ωστόσο, μια ενδιαφέρουσα παρατήρηση ήταν πως ορισμένα μόρια του ΔR481 διαφεύγουν του ERAD και κατευθύνονται κυρίως προς το χυμοτόπιο, αλλά και προς τη πλασματική μεμβράνη. Εστιάσαμε ειδικά στην κατανόηση του μηχανισμού της αποικοδόμησης του ΔR481 στο χυμοτόπιο. Η κύρια Ε3 τύπου HECT λιγάση της ουβικιτίνης, HulARsp5, αποδείχθηκε απαραίτητη για την στόχευση του ΔR481 στο χυμοτόπιο, ενώ η πρωτεΐνη-προσαρμοστής ArtA, η οποία συμμετέχει στην ενδοκύτωση του UapA, καθώς και ένας γενικός παράγοντας ενδοκύτωσης, ο SagAEnd3, δεν επηρέασαν τη διαδικασία, δείχνοντας πως η ενδοκύτωση συνεισφέρει ελάχιστα ή καθόλου στη στόχευση του ΔR481 στο χυμοτόπιο. Αυτά τα ευρήματα προτείνουν πως το ΔR481 αναγνωρίζεται ως μη σωστά διπλωμένο και επανα-προωθείται στο χυμοτόπιο κατά το βιοσυνθετικό μονοπάτι, πριν φτάσει στην πλασματική μεμβράνη. Μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη, η οποία εντοπίζεται στο ΕΔ, το BsdABsd2, φάνηκε να είναι απαραίτητη για την μη-ενδοκυτταρική αποικοδόμηση του ΔR481 στο χυμοτόπιο, πιθανώς μέσω αλληλεπίδρασης των αμινοξικών της μοτίβων, PPxY, με την λιγάση της ουβικιτίνης HulA. Απουσία του BsdA ή μεταλλαγές που αντικαθιστούν αμινοξέα μέσα στα μοτίβα PPxY, παρεμποδίζουν την καταστροφή του ΔR481, επιτρέποντας στην πλειονότητα των μορίων να φτάσουν στην πλασματική μεμβράνη. Παρά το σταθερό, συνεχόμενο εντοπισμό του ΔR481 στη πλασματική μεμβράνη σε γενετικό υπόβαθρο bsdAΔ, το ΔR481 δεν είχε λειτουργικότητα μεταφορέα και υπόκειτο «φυσιολογικά» στην ρύθμιση υπό το ενδοκυτταρικό μονοπάτι των ArtA-SagA-HulA. Σημαντικό εύρημα αυτής της εργασίας είναι πως η συσσώρευση του ΔR481 στο ΕΔ πυροδοτεί την αυτοφαγία και τη στρατολόγηση μιας βασικής πρωτεΐνης της αυτοφαγίας, της Atg8, στο ΕΔ. Το BsdA αποδείχτηκε απαραίτητο μόνο για την μεταγενέστερη αποικοδόμηση του ΔR481, καθώς η επαγωγή της αυτοφαγίας εξαιτίας της συσσώρευσης του ΔR481 στο ΕΔ παρέμενε ανεπηρέαστη στο γενετικό υπόβαθρο bsdAΔ. Η γενετική απενεργοποίηση της αυτοφαγίας μέσω μεταλλαγών στα βασικά γονίδια atg9 ή rabO παρεμπόδισε μόνο μερικώς την αποικοδόμηση του ΔR481, υποστηρίζοντας πως ένα άλλο μονοπάτι καταστροφής δρα παράλληλα. Η παρεμπόδιση της λειτουργικότητας του Golgi μέσω μιας θερμοευαίσθητης μεταλλαγής στην συνταξίνη SedV παρεμπόδισε επίσης μόνο μερικώς την αποικοδόμιση του ΔR481 στο χυμοτόπιο. Μόνο η ταυτόχρονη απενεργοποίηση τόσο της αυτοφαγίας όσο και της λειτουργικότητας του Golgi κατάφερε να εμποδίσει πλήρως την καταστροφή του ΔR481 στο χυμοτόπιο. Συμπερασματικά, πολλαπλά μονοπάτια δραστηριοποιούνται για την αποτοξίνωση των κυττάρων από λανθασμένα διπλωμένα φορτία. Μέρος ΙΙΙ. Στο τρίτο μέρος της διατριβής, ακολουθήσαμε τη μετακίνηση των πυρήνων και των εκκριτικών κυστιδίων στις υφές του A. nidulans. Οι νηματοειδείς μύκητες, όπως ο A. nidulans, επιμηκύνονται συνεχώς μέσω ακραίας επέκτασης, μια διαδικασία η οποία απαιτεί στοχευμένη έκκριση και ενδοκυτταρική ανακύκλωση στην κορυφή της υφής (tip). Κατά τα πρώτα στάδια της εκβλάστησης του μύκητα, η πολικότητα εγκαθιδρύεται και έκτοτε διατηρείται καθ’ όλη τη διάρκεια της ζωής του. Η κατευθυνόμενη αύξηση στην άκρη της υφής απαιτεί συνεχόμενη πολική μετακίνηση λιπιδίων και ενζύμων, μεμβρανική αναδιοργάνωση και ανακύκλωση φορτίων στην άκρη της υφής, διαδικασίες οι οποίες εμπλέκουν τους μικροσωληνίσκους και την F-ακτίνη. Οι μικροσωληνίσκοι παίζουν σημαντικό ρόλο στην μίτωση, καθώς σχηματίζουν την μιτωτική άτρακτο, αλλά και κατά τη διάρκεια της μεσόφασης στην κατανομή των πυρήνων και στην κυστιδιακή μετακίνηση. Σε αυτό το μέρος της διατριβής, εστιάσαμε στην λειτουργία πρωτεϊνών του κυτταρικού φλοιού, οι οποίες σχετίζονται με τους μικροσωληνίσκους. Προηγούμενες αναφορές είχαν χαρακτηρίσει τη δράση της πρωτεΐνης ApsANum1, μιας μεμβρανικής, αγκυροβολημένης πρωτεΐνης του φλοιού, η οποία αλληλεπιδρά με τους αστρικούς μικροσωληνίσκους κατά τη διάρκεια της μίτωσης, βοηθώντας στη δημιουργία ελκτικών δυνάμεων, οι οποίες απομακρύνουν περαιτέρω τους δύο πόλους της ατράκτου. Η ApsC, μια πρωτεΐνη με ομοιότητα ως προς την ApsA, ταυτοποιήθηκε ως δεύτερο ομόλογο της πρωτεΐνης Num1 του Saccharomyces cerevisiae. H ApsC εντοπίζεται σε συγκεκριμένες επικράτειες της πλασματικής μεμβράνης στον κεντρικό πόρο των σέπτων και στοχεύεται συνεχόμενα στην κορυφή της υφής, υποδεικνύοντας ένα ρόλο στην πολική αύξηση και την έκκριση. Χρησιμοποιώντας το σύστημα ανασύστασης φθορισμού split YFP, αποδείξαμε αλληλεπίδραση μεταξύ της ApsA και ApsC στον κυτταρικό φλοιό, αλλά και με την κινεσίνη UncA, η οποία μετακινεί ενδοσώματα και εκκριτικά κυστίδια πάνω στους μικροσωληνίσκους, τη μυοσίνη MyoV, η οποία μετακινεί εκκριτικά κυστίδια πάνω στην F-ακτίνη, και τη διαμεμβρανική συνθάση της χιτίνης, ChsB, η οποία εκκρίνεται μέσω κυστιδίων στις θέσεις της αύξησης στη

Minos as a novel Tc1/mariner-type transposable element for functional genomic analysis in Aspergillus nidulans.

International audienceTransposons constitute powerful genetic tools for gene inactivation, exon or promoter trapping and genome analyses. The Minos element from Drosophila hydei, a Tc1/mariner-like transposon, has proved as a very efficient tool for heterologous transposition in several metazoa. In filamentous fungi, only a handful of fungal-specific transposable elements have been exploited as genetic tools, with the impala Tc1/mariner element from Fusarium oxysporum being the most successful. Here, we developed a two-component transposition system to manipulate Minos transposition in Aspergillus nidulans (AnMinos). Our system allows direct selection of transposition events based on re-activation of niaD, a gene necessary for growth on nitrate as a nitrogen source. On average, among 10(8) conidiospores, we obtain up to ∼0.8×10(2) transposition events leading to the expected revertant phenotype (niaD(+)), while ∼16% of excision events lead to AnMinos loss. Characterized excision footprints consisted of the four terminal bases of the transposon flanked by the TA target duplication and led to no major DNA rearrangements. AnMinos transposition depends on the presence of its homologous transposase. Its frequency was not significantly affected by temperature, UV irradiation or the transcription status of the original integration locus (niaD). Importantly, transposition is dependent on nkuA, encoding an enzyme essential for non-homologous end joining of DNA in double-strand break repair. AnMinos proved to be an efficient tool for functional analysis as it seems to transpose in different genomic loci positions in all chromosomes, including a high proportion of integration events within or close to genes. We have used Minos to obtain morphological and toxic analogue resistant mutants. Interestingly, among morphological mutants some seem to be due to Minos-elicited over-expression of specific genes, rather than gene inactivation