Altered GABA Signaling in Early Life Epilepsies

The incidence of seizures is particularly high in the early ages of life. The immaturity of inhibitory systems, such as GABA, during normal brain development and its further dysregulation under pathological conditions that predispose to seizures have been speculated to play a major role in facilitating seizures. Seizures can further impair or disrupt GABAA signaling by reshuffling the subunit composition of its receptors or causing aberrant reappearance of depolarizing or hyperpolarizing GABAA receptor currents. Such effects may not result in epileptogenesis as frequently as they do in adults. Given the central role of GABAA signaling in brain function and development, perturbation of its physiological role may interfere with neuronal morphology, differentiation, and connectivity, manifesting as cognitive or neurodevelopmental deficits. The current GABAergic antiepileptic drugs, while often effective for adults, are not always capable of stopping seizures and preventing their sequelae in neonates. Recent studies have explored the therapeutic potential of chloride cotransporter inhibitors, such as bumetanide, as adjunctive therapies of neonatal seizures. However, more needs to be known so as to develop therapies capable of stopping seizures while preserving the age- and sex-appropriate development of the brain

Study of the Effect of Methyl Jasmonate Concentration on Aflatoxin B1 Biosynthesis by Aspergillus parasiticus in Yeast Extract Sucrose Medium

Aflatoxin B1 (AFB1) is a carcinogenic metabolite produced by certain Aspergillus species on agricultural commodities. AFB1 biosynthesis is affected by jasmonic acid and also by its methylester (MeJA), a plant growth regulator derived from linoleic acid. This study reports the effect of MeJA on the growth of A. parasiticus and AFB1 output in yeast extract sucrose (YES) medium when added at three different concentrations; namely, 10−2 M, 10−4 M, and 10−6 M. AFB1 determination was performed by immunoaffinity and HPLC. MeJA at 10−4 and 10−6 M concentrations had no significant effect on mycelial growth but did affect AFB1 production after the 7th day of incubation; on the 12th day, AFB1 production was increased by 212.7% and 141.6% compared to the control samples (addition of 10−6 M and 10−4 M MeJA, resp.). Treatment of A. parasiticus cultures with 10−2 M MeJA inhibited mycelial growth and AFB1 production as well. These results suggest that the effect of MeJA on AFB1 biosynthesis by A. parasiticus depends on the MeJA concentration used

Efficacy and tolerability of the Galanin Analog NAX 5055 in the multiple-hit rat model of symptomatic infantile spasms

Infantile spasms are seizures manifesting in infantile epileptic encephalopathies that are associated with poor epilepsy and cognitive outcomes. The current therapies are not always effective or are associated with serious side effects. Early cessation of spasms has been proposed to improve long-term outcomes. To identify new therapies for infantile spasms with rapid suppression of spasms, we are using the multiple-hit rat model of infantile spasms, which is a model of refractory infantile spasms. Here, we are testing the efficacy and tolerability of a single dose of the galanin receptor 1 preferring analog, NAX 5055, in the multiple-hit model of spasms. To induce the model, postnatal day 3 (PN3) male Sprague-Dawley rats underwent right intracerebral infusions of doxorubicin and lipopolysaccharide; p-chlorophenylalanine was then injected intraperitoneally (i.p.) at PN5. After the onset of spasms at PN4, 11-14 rats/group were injected i.p. with either NAX 5055 (0.5, 1, 2, or 4mg/kg) or vehicle. Video monitoring for spasms included a 1h pre-injection period, followed by 5h of recording post-injection, and two 2h sessions on PN5. The study was conducted in a randomized, blinded manner. Neurodevelopmental reflexes were assessed daily as well as at 2h after injection. Respiratory function, heart rate, pulse distension, oximetry and blood glucose were measured 4h after injection. The relative expression of GalR1 and GalR2 mRNA over β-actin in the cerebral cortex and hippocampus was determined with real time reverse transcription polymerase chain reaction. There was no acute effect of NAX 5055 on spasm frequency after the single dose of NAX 5055 (n=11-13 rats/group, following exclusions). Neurodevelopmental reflexes, vital signs, blood glucose measured 4h post-injection, and survival were not affected. A reduction in pulse and breath distention of unclear clinical significance was observed with the 7mg/kg NAX 5055 dose. GalR1 mRNA was present in the cerebral cortex and hippocampus of PN4 and adult rats. The hippocampal - but not the cortical - GalR1 mRNA expression was significantly lower in PN4 pups than in adults. GalR1 mRNA was also at least 20 times less abundant in the PN4 cortex than GalR2 mRNA. In conclusion, a single dose of NAX 5055 has no acute efficacy on spasms or toxicity in the multiple hit rat model of medically refractory infantile spasms. Our findings cannot exclude the possibility that repetitive NAX 5055 administration may show efficacy on spasms. The higher expression of GalR2 in the PN4 cortex suggests that GalR2-preferring analogs may be of interest to test for efficacy on spasms

Harmonization in preclinical epilepsy research: A joint AES/ILAE translational initiative

Among the priority next steps outlined during the first translational epilepsy research workshop in London, United Kingdom (2012), jointly organized by the American Epilepsy Society (AES) and the International League Against Epilepsy (ILAE), are the harmonization of research practices used in preclinical studies and the development of infrastructure that facilitates multicenter preclinical studies. The AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE has been pursuing initiatives that advance these goals. In this supplement, we present the first reports of the working groups of the Task Force that aim to improve practices of performing rodent videoâ\u80\u93electroencephalography (vEEG) studies in experimental controls, generate systematic reviews of preclinical research data, and develop preclinical common data elements (CDEs) for epilepsy research in animals

Bacterial hydrolases of thermophilic origin and their application in plant biomass valorisation

Η παρούσα διδακτορική διατριβή εντάσσεται στο γενικότερο πλαίσιο των βιοδιυληστηρίων δεύτερης γενιάς και ειδικότερα στην αξιοποίησης των θερμόφιλων μικροοργανισμών και των προϊόντων τους στη βιομετατροπή της λιγνοκυτταρινούχου βιομάζας σε βιοκαύσιμα και άλλα ενδιάμεσα χημικά. Πιο συγκεκριμένα, η εργασία εστιάστηκε στην υδρόλυση της κυτταρίνης και της ξυλάνης από 103 θερμόφιλα βακτηριακά στελέχη τα οποία συλλέχθηκαν από το ηφαίστειο της Σαντορίνης (Meintanis, Chalkou et al. 2006). Τα στελέχη αυτά στην πλειοψηφία τους ανήκουν στο γένος Geobacillus και εμφανίζουν ξυλανολυτική ικανότητα ενώ ορισμένα διαθέτουν επιπλέον την ικανότητα υδρόλυσης της κυτταρίνης (Stathopoulou, Galanopoulou et al. 2012). Υπό αυτό το πλαίσιο, η διδακτορική εργασία μπορεί να υποδιαιρεθεί σε τέσσερα επί μέρους τμήματα. Τα πρώτα τρία είναι αλληλένδετα μεταξύ τους και σχετίζονται με την αποικοδόμηση της κυτταρίνης και της ξυλάνης από τα στελέχη Geobacillus που απομονώθηκαν από το ηφαίστειο της Σαντορίνης. Στο τελευταίο τμήμα,-το οποίο επίσης σχετίζεται με την αποικοδόμηση της κυτταρίνης από τους γεωβάκιλλους,- επιλέξαμε ένα διαφορετικό στέλεχος, το στέλεχος G. stearothermophilus T-1, για το οποίο το γονιδίωμα είναι γνωστό, το ξυλανολυτικό του σύστημα είναι εκτενώς μελετημένο και επιπλέον έχουν ήδη αναπτυχθεί τα κατάλληλα εργαλεία μετασχηματισμού του (Shulami, Zaide et al. 2007). Ως σημείο αφετηρίας, επιλεγμένα στελέχη από το ηφαιστειακό ενδιαίτημα της Σαντορίνης ελέγχθηκαν για γονίδια που κωδικοποιούν κυτταρινολυτικά και ξυλανολυτικά ένζυμα. Ο εντοπισμός των επιθυμητών γονιδίων πραγματοποιήθηκε με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και χρήση κατάλληλων μορίων εκκινητών (primers). O σχεδιασμός των primers, βασίστηκε στις συντηρημένες περιοχές της αμινοξικής αλληλουχίας όλων των βιοχημικά χαρακτηρισμένων ξυλανολυτικών και κυτταρινολυτικών ενζύμων του γένους Geobacillus αλλά και συγγενικών ειδών τα οποία βρίσκονται κατατεθειμένα στη βάση δεδομένων CAZy (www.cazy.org). Η παραπάνω πορεία, οδήγησε στον εντοπισμό δύο ξυλανασών της οικογένειας γλυκοσιδικών υδρολασών (GH) 10, τριών β-ξυλοσιδασών των οικογενειών GH39, GH43 και GH52, μίας β-P-γλυκοζιδάσης της οικογένειας GH1, και μίας ενδογλυκανάσης της οικογένειας GH5. Ο βιοχημικός χαρακτηρισμός των ενζύμων αυτών, επιβεβαίωσε την αντίστοιχη ξυλανολυτική ή κυτταρινολυτική τους δράση. Επιπλέον, φάνηκε πως τα ένζυμα αυτά δρουν σε ουδέτερο έως ελαφρώς όξινο περιβάλλον, παρουσιάζουν ιδιαίτερη θερμοσταθέροτητα στους 60 και 65 ˚C ενώ εμφανίζουν μέγιστη ενεργότητα μεταξύ 60 ˚C και 70 ˚C. Στο δεύτερο τμήμα της διδακτορικής διατριβής, η μία ξυλανάση GH10, η β-ξυλοζιδάση GH52 και η ενδογλυκανάση GH5 που κλωνοποιήθηκαν στο προηγούμενο στάδιο της διδακτορικής διατριβής και επιπλέον μία β-γλυκοζιδάση από το βακτήριο Caldicellulosiruptor saccharolyticus (DSMZ 8903) χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή ενός κυτταρινοσώματος ικανού να δρά σε υψηλές θερμοκρασίες. Στα ένζυμα αυτά εισήχθηκε μια εξειδικευμένη επικράτεια αγκίστρωσης (dockerin) έτσι ώστε το προκύπτον χιμαιρικό ένζυμο να είναι ικανό να προσδεθεί στην αντίστοιχη επικράτεια σύνδεσης (cohesin) της πρωτεΐνης στήριξης (scafoldin) του κυτταρινοσώματος. Το σύμπλοκο που προέκυψε, αποδείχτηκε ότι παραμένει σταθερό στους 60 ˚C για τουλάχιστον έξι ώρες επώασης και οτι στο συγκεκριμένο χρονικό διάστημα, υδρολύει το άχυρο καλαμποκιού έως και 66% πιο αποδοτικά σε σύγκριση με τα αντίστοιχα ελεύθερα ένζυμα.(Galanopoulou, Moraïs et al. 2016). H παρούσα εργασία παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον καθώς περιγράφει για πρώτη φορά την κατασκευή θερμοκυτταρινοσωμάτων και αποδεικνύει την λειτουργικότητα τους (Galanopoulou, Moraïs et al. 2016).Τα παραπάνω ανοίγουν το δρόμο για την αξιοποίηση των δομών αυτών σε βιοτεχνολογικές εφαρμογές που απαιτούν υψηλές θερμοκρασίες. Το τρίτο μέρος της παρούσας εργασίας αφορά στην ανάλυση του γονιδιώματος ενός από τα απομονωθέντα στελέχη του ηφαιστείου της Σαντορίνης, του στελέχους “Geobacillus icigianus SP50”. Η μελέτη του συγκεκριμένου στελέχους, παρουσιάζει ενδιαφέρον για δύο λόγους: Αρχικά, ο κυτταρινολυτικός φαινότυπος είναι σπάνιος και όχι καλά μελετημένος για το γένος των γεωβακίλλων. Δεύτερον, το στέλεχος “Geobacillus icigianus SP50” ήταν το μοναδικό στη συλλογή, στο οποίο εντοπίστηκε το γονίδιο της ενδογλυκανάσης GH5 που χαρακτηρίστηκε στο πρώτο μέρος της εργασίας. Από την ανάλυση του γονιδιώματος του εν λόγω στελέχους, εκτός από το γονίδιο της GH5 κυτταρινάσης, εντοπίστηκαν τέσσερα επιπλέον γονίδια: το γονίδιο ενός μεταγραφικού ρυθμιστή της οικογένειας LacI καθώς και τρία γονίδια τα οποία κωδικοποιούν για έναν ΑTP-εξαρτώμενο μεταφορέα ολιγοσακχαριτών. Προτείνουμε πως αυτά τα πέντε γονίδια μαζί αποτελούν μία ομάδα γονιδίων υπεύθυνη για την αποικοδόμηση και πρόσληψη ενός μεγάλου εύρους β-D-γλυκανών από τα κύτταρα. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι τα επιμέρους γονίδια της συγκεκριμένης ομάδας, δεν εντοπίστηκαν σε κανένα άλλο γονιδίωμα του γένους Geobacillus ενώ αντίθετα, σημαντικά συντηρημένα εμφανίστηκαν στο γονιδίωμα αντιπροσώπων διαφορετικών βακτηριακών γενών (Thermicanus aegyptius) αλλά και οικογενειών (Paenibacillus elgii). Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι η συγκεκριμένη ομάδα γονιδίων ενσωματώθηκε, πιθανά, στο γονιδίωμα του ‘Geobacillus icigianus SP50’ μέσω οριζόντιας μεταφοράς. Tέλος και το τελευταίο κομμάτι της διδακτορικής διατριβής, επικεντρώθηκε στη διάσπαση της κυτταρίνης από το γένος Geobacillus. Πιο συγκεκριμένα, επιχειρήθηκε η μετατροπή του μη κυτταρινολυττικού στελέχους G. stearothermophilus T-1 σε κυτταρινολυτικό μέσω ετερόλογης έκφρασης μίας κυτταρινάσης του βακτηρίου Thermobifida fusca YX. Η μεθοδολογία που ακολουθήθηκε βασίστηκε σε πρωτόκολλα μετασχηματισμού του συγκεκριμένου στελέχους με ένα παράγωγο του πλασμιδιακού φορέα pNW33N (Zeigler 2001, Zeigler 2002, Shulami, Shenker et al. 2014). Ο προκύπτον μικτός φαινότυπος είναι ιδιαίτερης βιοτεχνολογικής σημασίας καθώς μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε υψηλής θερμοκρασίας βιομετατροπές ενός σταδίου. Από το σύνολο των επιμέρους τμημάτων της διατριβής που αναλύθηκαν παραπάνω, θεωρούμε ότι προκύπτουν ερωτήματα που χρήζουν περαιτέρω μελέτης: Σε ενζυμικό επίπεδο, είναι γνωστό ότι οι γεωβάκιλοι διαθέτουν μία πληθώρα ενζύμων τα οποία δρουν βοηθητικά στην αποικοδόμηση της ημικυτταρίνης. Τα ένζυμα αυτά θα μπορούσαν να κλωνοποιηθούν και να χαρακτηριστούν βιοχημικά έτσι ώστε να εκτιμηθεί η συνεργιστική δράση τους στην αποτελεσματικότερη αποικοδόμηση της λιγνοκυτταρίνης. Η δημιουργία των θερμοκυτταρινοσωμάτων και η αποτελεσματική ικανότητα υδρόλυσης αυτών σε υψηλές θερμοκρασίες, επιτρέπει την εξαγωγή μίας σειράς υποθέσεων οι οποίες θα μπορούσαν να εξεταστούν. Μεταξύ αυτών, ιδιαίτερο ενδιαφέρον για το εργαστήριο μας, έχει η ένταξη τους σε βιοδιυλιστήρια ενός σταδίου για την παραγωγή αιθανόλης. Όσον αφορά το κυτταρινολυτικό στέλεχος ‘Geobacillus icigianus SP50’, ένας από τους άμεσους στόχους μας είναι η διερεύνηση της ρύθμισης έκφρασης της β-D-γλυκανολυτικής ομάδας. Στην ίδια κατεύθυνση, θα μπορούσε να ενταχθεί το γενετικά τροποποιημένο στέλεχος G. stearothermophilus T-1 για τη χρήση του σε διεργασίες υδρόλυσης της λιγνοκυτταρίνης ενός σταδίου. Ως προς την περαιτέρω βελτιστοποίηση του στελέχους, άμεσος στόχος είναι η ενσωμάτωση του υπεύθυνου τμήματος DNA για τον διάσπαση της κυτταρίνης, στο γονιδίωμα του μικροοργανισμού. Τέλος, ιδιαίτερο ενδιαφέρον θα είχε η ανάπτυξη της κατάλληλης μεθοδολογίας για το γενετικό χειρισμό των βακτηριακών στελεχών τα οποία έχουν απομονωθεί από το ηφαίστειο της Σαντορίνης έτσι ώστε να μελετηθεί εκτενέστερα ο υπάρχον φαινότυπός τους ή να τροποποιηθεί επιπλέον έτσι ώστε να ενταχθούν σε διάφορες βιοτεχνολογικές διεργασίες.Τhe present thesis lies within the general framework of second generation biorefineries. Its subject specifically addresses the exploitation of thermophilic bacteria and their enzymes towards the bioconversion of lignocellulose to biofuels and other chemicals. In particular, it is focused on the study of the hydrolytic potential against cellulose and xylan of 103 thermophilic bacteria isolated from the volcanic habitat of Santorini (Meintanis, Chalkou et al. 2006). The majority of these strains belong to the genus Geobacillus and was able to degrade xylan, while only a few also presented cellulolytic activity (Stathopoulou, Galanopoulou et al. 2012). Within this context, the PhD thesis can be divided into four parts; the first three are interlinked since they are all related to the degradation of xylan and cellulose by the Santorini Geobacillus strains. In the last one - also related to cellulose degradation by Geobacilli - a different Geobacillus isolate is employed, G. stearothermophilus T-1, a strain for which the genome is known, the xylanolytic system is well studied and there are available genetic manipulation techniques for its transformation (Shulami, Zaide et al. 2007). Specifically, in the first part of the thesis, selected strains isolated from the volcanic habitat of Santorini were screened for genes encoding xylanolytic and cellulolytic enzymes. The screening of the desired genes was performed using polymerase chain reaction (PCR) and appropriately designed primers. Primer design was based in the conserved aminoacid regions of all the biochemically characterized xylanolytic and cellulolytic enzymes from Geobacilli and related strains, deposited in CAZy database (www.cazy.org). The outcome of this effort was the detection of two xylanases of the glycoside family GH10, three β-xylosidases of the glycoside families GH39, GH43 and GH52 respectively, one β-P-glucosidase of the glycoside family GH1 and one endoglucanase of the glycoside family GH5. Biochemical characterization of the enzymes validated their optimum xylanolytic or cellulolytic activities at neutral or slightly acid pH values. In addition, all enzymes presented significant thermostability at 60 and 65 ˚C while the maximum activity for all of them was observed at temperatures between 60 ˚C and. 70 ˚C. In the second part of the thesis, one xylanase of the glycoside family GH10, the β-xylosidase of the glycoside family GH52 and the endoglucanase GH5, all cloned and characterized in the previous part, were used to construct a tetravalent designer cellulosome able to act at elevated temperatures. A fourth complementary activity, that from the β-glucosidase of the bacterium Caldicellulosiruptor saccharolyticus (DSMZ 8903), was additionally employed. All four genes were combined with a dockerin domain, in order for the chimaeric products to interact with the corresponding cohesins of the cellulosome's scaffoldin. The resulted cellulosomal complex remained stable for at least 6 hours of incubation at 60 ˚C, while at the same time it hydrolyzed corn stover up to 66 % more efficiently compared to the free enzymes. The produced designer cellulosome, constitutes the first thermocellulosome characterised so far, confirming for the first time the feasibility of employing the designer cellulosome technology in biorefinery processes requiring elevated temperatures (Galanopoulou, Moraïs et al. 2016). The third part of the thesis concerns the genome analysis for one of the cellulolytic strains isolated from the volcanic habitat of Santorini, namely, ‘Geobacillus icigianus SP50’. We decided to further investigate this particular strain for two reasons; first, the cellulolytic phenotype is a rare trait, not well documented among Geobacilli. Second, ‘Geobacillus icigianus SP50’ was the only strain among the Geobacillus strains of Santorini, bearing the gene encoding for the endoglucanase of the glycoside hydrolase family GH5, already characterized in the first part of the thesis. Genome sequencing of ‘Geobacillus icigianus SP50’ allowed us to identify that the GH5 endoglucanase is a part of a genetic locus, unique in Geobacilli, that contains also four additional genes; a transcriptional regulator of the LacI family and three genes constituting together an ATP-dependent oligosaccharide transporter. We propose that all these, together with the GH5 endoglucanase, form a genetic cluster, which is responsible for the degradation and utilization of a broad range of β-D-glucans. Intriguingly, genes of this β-D-glucan utilization cluster, were not detected in any other Geobacillus genome while the neighboring regions were significantly conserved. In contrast though, some of the genes of the cluster were found conserved in representatives of other bacterial genera (Thermicanus aegyptius) and even families (Paenibacillus elgii), indicating that the cluster has possibly been acquired through horizontal gene transfer from phylogenetically distant bacteria. Finally, in line of exploiting the cellulolytic ability of Geobacillus strains, we attempted to transform the non-cellulolytic strain G. stearothermophilus T-1 to a cellulolytic one through heterologous expression of a cellulase from the thermophilic bacterium Thermobifida fusca YX. The procedure we chose was based on well-established transformation protocols of the strain using a derivative of the pNW33N plasmid (Zeigler 2001, Zeigler 2002, Shulami, Zaide et al. 2007). The resulted bifunctional phenotype could be of exceptional biotechnological interest since it could be incorporated in one-step biorefinery processes requiring elevated temperatures. The outcome of the thesis, raises questions that could be further examined: Regarding their enzymatic ability, it is already known that Geobacilli, besides xylanolytic hydrolases, produce a great variety of enzymes with auxiliary activities acting on hemicellulose. These enzymes, could be cloned and biochemically characterized in order to evaluate their contribution in lignocellulose degradation processes. The creation of functional designer thermocellulosomes, sets the basis for their incorporation in various biotechnological applications requiring elevated-temperatures. Among them, their incorporation in one-step biorefineries for ethanol production is of great interest and an ongoing project for our lab. Regarding the glucanolytic strain “Geobacillus icigianus SP50”, one of the immediate goals of our lab is to investigate the regulation of the β-glucan utilization cluster. In the same line, the genetically modified cellulolytic strain G. stearothermophilus T-1, could be incorporated in the hydrolysis of lignocellulosic substrates at elevated temperatures. To further improve the cellulolytic phenotype of the transformed G. stearothermophilus T-1 strain, we would like to attempt the introduction of the corresponding DNA cassette into the genome of the microorganism. Finally, it would be of great interest to develop the appropriate methodology for the genetic manipulation of the thermophilic strains isolated from the volcano of Santorini. In this way, the observed phenotype could be further investigated or appropriately modified for biotechnological purposes